1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 白蔹乙酸乙酯提取物抗菌活性研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 本实验研究了白蔹乙酸乙酯提取物的体外抗菌活性。 在 测试白蔹乙酸乙酯提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能 的基础上，建立定性及定量的测试方法，得到白蔹乙酸乙酯提取物抗菌性能的具体数据，为开发功能性中药材提供理论和实验基础。本实验采用 虑 纸片法及琼脂稀释法进行抑菌定性试验，采用试管倍比稀释法进行定量实验测定白蔹提取物最低抑菌浓度，并选取了一系列提取物浓度梯度测定其体外抗菌活性。 研究结果显示 ：白蔹乙酸乙酯提取物浓度为
2、 10000 ug/ml 时，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为 2.35cm，对大肠杆菌的抑菌圈直径为1.90cm；而当白蔹乙酸乙酯提取物浓度为 625 ug/ml 时，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为0.90cm，而 对大肠杆菌则没有明显的抑菌圈存在； 提取物对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度在12.5ug/ml，对大肠杆菌的最低抑菌浓度在 39.1ug/ml 左右。可见 结果白蔹乙酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌比大肠杆菌抑菌效果较好。 关键词 : 白蔹；乙酸乙酯提取物；抗菌活性；稀释法 II Study on antibacterial activity of ethyl acetate extra
3、ct of Ampelopsis japonica Abstract: The experiment studies on the antibacterial activity of ethyl acetate extract of Ampelopsis japonica. Establish qualitative and quantitative test methods on the basis of antibacterial activity result of ethyl acetate extract of Ampelopsis japonica of E. coli and S
4、taphylococcus aureus. Obtained specific data on antibacterial activity of ethyl acetate extract of Ampelopsis japonica . to provide theoretical and experimental basis for the development of Chinese herbal functionality medicines.Study.By filter paper method and the agar dilution method for antibacte
5、rial test.By tube dilution method extracts of ampelopsis japonica minimum inhibitory concentration and evaluate antibacterial activity in vitro with it .The result of tests show that: While the concentration of ethyl acetate extract of Ampelopsis japonica is 10000ug/ml,the inhibition zone of Staphyl
6、ococcus aureus is 0.90cm ,there is the inhibition zone of E. coli is 1.90cm;When the concentration of ethyl acetate extract of Ampelopsis japonica is 625ug/ml,the inhibition zone of Staphylococcus aureus is 0.90cm , there is no obvious presence of inhibition zone of E. coli ; The ethyl acetate extra
7、ct of Ampelopsis japonica s minimum inhibitory concentration of Staphylococcus aureus is 12.5ug/ml,of E. coli is 39.1ug/ml.So apparent antibacterial activity is against staphylococcus aureus than against Escherichia coli. Keywords: ampelopsis japonica , ethyl acetate extract, antibacterial activity,
8、 dilution目 录 摘要 （） Abstract （ ） 1 绪论 （ 1） 1.1 白蔹的概述 （ 1） 1.1.1 白蔹的化学成分 （ 1） 1.1.2 白蔹的药理作用 （ 2） 1.1.3 白蔹的临床应用 （ 3） 1.2 课题提出及研究内容 （ 4） 2 实验部分（ 5） 2.1 实验流程（ 5） 2.2 主要仪器及设备（ 6） 2.3 实验方法（ 6） 2.3.1 白蔹的提取 （ 6） 2.3.2 定性实验 （ 7） 2.3.3 定量实验 （ 8） 3 结果与分析 （ 10） 3.1 定性实验结果 （ 10） 3.2 定量实验结果 （ 12） 3.3 分析 （ 14） 4 结论
9、 （ 15） 5 致谢（ 16） 参考文献（ 17） 1 1 绪论 1.1 白蔹的概述 白蔹（ Ampelopsis japonica），也称山地瓜、猫儿卵、鹅抱蛋、见肿消、穿山老鼠，为葡萄科、蛇葡萄属多年生半木质藤本攀援植物。 白蔹又名白根、猫儿卵 ,首载于神农本草 经 ,归为下品。具有清热解毒、消肿散结、生肌止 痛之功能。用于痈肿疮疡、瘰疬、烫伤、扭挫伤 ；外用于痈、疖、蜂窝组织炎、淋巴结炎等。中华人民共和国药典 2005 版收载 的白蔹为葡萄科白蔹1( Ampelopsis japonica( Thunb. )Makino) 的块根。 白蔹是近年新开发原产我国的块茎类多肉植物 ，落叶攀援
10、木质藤本，长约 1m。块根粗壮，肉质，卵形、长圆形或长纺锤形，深棕褐色，数个相聚。茎多分枝，幼枝带淡紫色，光滑，有细条纹；卷须与叶对生。 白蔹分布于华北、东北、华东、中南及陕西、宁夏、四川等地。白蔹 藤茎细长，叶片秀丽，群生的块茎古朴苍劲，给人以清新自然、颇具野趣的感觉，或地栽 于庭院假山、篱笆旁，或盆栽陈设于阳台、厅堂等处均宜。其块茎经加工后，具有清热解毒、消痈散结、生肌止痛等功效，可用于痈肿疮疡、扭挫伤、烫伤等治疗。现代医学证明，白蔹具有白嫩肌肤的作用，已作为美容护肤品的添加剂使用 1。 1.1.1 白蔹的化学成分： 从其乙酸 乙酯提取物中分离得到了 8 个化合物 3,利用理化 常数和波谱
11、学方法 (1H-NMR、13C-NMR) 鉴定了 它们的结构 ,分别为 ： 没食子酸 (1) 、原儿茶酸 (2) 、 龙胆酸 (3) 、白藜芦醇 (4) 、大黄素 (5) 、羽扇豆醇 (6) 、 谷甾醇 (7) 、胡萝卜 苷 (8) （ 1） 多酚类 多酚类是白蔹的主要化学成分，也是其主要活性物质。研究白蔹化学成分的首篇报道见于 1995 年，俞文胜等用 Sephadex LH-20 柱层析从白蔹的乙酸乙酯提取物中分离得到一系列多酚类化合物，包括没食子酸， 1,2,6-三氧 -没食子酰基 -D-吡喃葡萄糖， 1,2,3,6-四氧 -没食子酰基 -D-吡喃葡萄糖， 1,2,4,6-四氧 -没食子
12、酰基 -D-吡喃葡萄糖， 1,2,3,4,6-五氧 -没食子酰基 -D-吡喃葡萄糖，二聚没食子酸， 1,4,6-三氧 -没食子酰基 -D-吡喃葡萄糖， 2,4,6-三氧 -没食子酰基 -D-吡喃葡萄糖， 2,3,4,6-四氧 -没食子酰基 -D-吡喃葡萄糖， 6-氧 -二聚没食子酰基 -1,2,3-三氧 -没食子酰基 -D-吡喃葡萄糖，槲皮素 -3-氧 -L-吡喃鼠李糖，槲皮素 -3-氧 -(2-氧 -没食子酰基 )-L-吡喃鼠李糖。这些多酚类物质有的具有较强的抗脂质过氧化活性，有的具有很强的抗毒肝素活性。郭丽冰等 3从白蔹乙醇提取物的三氯甲烷中首次分离得到槲皮素。 （ 2） 有机酸类 郭丽冰
13、等 3用硅胶柱层析从白蔹的乙醇提取物中分离得到脂肪酸三十烷酸和二十八烷酸。邹济高 4分离得到十六烷酸和富马酸。此外，白蔹还含有酒石酸，龙脑酸等。 2 （ 3） 三萜、甾醇及其苷类 郭丽冰等用硅胶柱层析从白蔹乙醇浸膏的乙酸乙酯提取物中分离得到 -谷甾醇、豆甾醇和豆甾醇 -D-葡萄糖苷。邹济高等 4分离得到羽扇豆醇。 （ 4） 其他 白蔹中的蒽醌类主要有大黄素甲醚、大黄酚和大黄素等。 Lee 等用活性追踪法，从白蔹的甲醇提取物中分离得到具有抗肿瘤活性的 momordins，包括 momordin I， Id 和 Ie。白蔹中还含有卫茅醇、淀粉和黏液质等。 白蔹的提取分离： 干燥生药 5.0 kg
14、,用体积分数为 70 %的乙醇溶液加热回流提取 3 次 ,每次 2 h ,提取液减压浓缩回收溶剂 ,得浸膏后加适量水混悬 ,分别用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取 3 遍 ,减压浓缩回收溶剂 ,得到石油醚部分 23 g ,氯仿部分 45 g ,乙酸乙酯层浸膏 40 g ,正丁醇部分 35 g ;乙酸乙酯可溶部分经硅胶柱色谱分离 ,氯仿甲醇梯度洗脱 ,再经重结晶、 Sephadex LH 20 柱色谱等纯化手段得化合物 1 ( 50 mg) 、 2 ( 10 mg) 、 3(6 mg) 、 4 (5 mg) 、 5 (8 mg) 、 6 (15 mg) 、 7 (100 mg)和8 (
15、90 mg) 。 1.1.2.白蔹的药理作用 (1) 抗菌活性 抗菌是白蔹的主要活性，目前研究的较多。白蔹含有大黄素甲醚、大黄酚、大黄素、富马酸、没食子酸等多种抗细菌和真菌成分，与其临床应用相一致 4。白蔹的水浸液对同心性毛癣菌、奥杜盎氏小芽胞癣菌、腹股沟和红色表皮癣菌等真菌有不同程度的抑制作用 5。水煎剂用平板稀释法对金黄色葡萄球菌有抑制作用。 水浸剂（ 1 3）在试管内对同心性毛癣菌、奥杜盎氏小芽胞癣菌、腹股沟和红色表皮癣菌等皮肤真菌有不同程度的抑制作用。水浸剂 用试管稀释法， 1： 15 的浓度对共心性毛癣菌、奥杜盎小孢子菌、腹股沟表皮癣菌等有抑制作用。根醇提物醋酸乙酸酯可溶部分，对四氯
16、化碳致小鼠肝损伤具有保护作用， 300mg/kg 显著抑制谷丙转氨酶（ SGPT） 6、谷草转氨酶（ SGOT）活性的升高。 将蛇葡萄根、白蔹等 4 味中药的 70%乙醇提取物制成外用蛇葡萄根霜剂，体外抑菌实验表明，此霜剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌有不同程度的抑制作用 7。口腔微生物通过腐败消化口腔内的滞留物质产生挥发性硫化物（ VSCs）及其它异味物质导致口臭。朱彩莲等 8通过 测定挥发性硫化物，发现白蔹对临床采集的牙周病口臭患者唾液细菌的抑菌率为 45%。 (2)辅助镇痛作用 白蔹煎剂本身无镇痛作用 9，但可显著增强黑附片和炙川乌的镇痛作用，拮抗黑附片、炙川乌和炙草乌时对离体
17、蛙心的收缩作用 。 3 (3)抗 肿瘤 作用 白蔹的甲醇提取物及从中提取纯化的 momordin 对激活蛋白（ AP-1）活性及肿瘤细胞的增生有抑制作用。 momordin 对肿瘤细胞的抑制活性最强，其 IC50 为 22.8 mg/mL。白蔹的甲醇提取物和 momordin 还对人肿瘤细胞有细胞毒作用， momordinI 细 胞毒作用最强， IC50 为 7.28016.05 mg/mL10。 Kim 等 11研究了 momordinI 对白血病 HL-60 细胞的细胞毒作用，其 IC50 为 19.0 mg/mL，并证明其作用机制是通过降低 Bcl-2:Bax 的比例及激活 caspas
18、e-3，诱导了白血病 HL-60 细胞的凋亡。 许多中药乙醇提取物均有高度酪氨酸酶抑制作用，能阻截皮肤中黑色素的形成。唐海谊等发现，白蔹水提物对酪氨酸酶有很强的抑制作用， IC50 为 0.35 mg/mL。但白蔹的 80%乙醇提取物抑制效果较差，其 IC50 比水提取物的数值高 5.923.8 倍。 此外， 体外试验 证明白蔹 对人子宫颈癌细胞培养系 JTC-26 有抑制作用，抑制率在 90%以上。 (4)兴奋作用 赵翠兰 12观察了白蔹煎剂对小鼠给药前后电刺激的痛阈变化，发现白蔹煎剂对小白鼠有一定的兴奋作用，无镇痛作用。 (5)免疫调节活性 动物实验表明 13， 3 种不同剂量的白蔹醇提物
19、（ 5， 10， 20 g/kg）对小鼠外周血淋巴细胞 ANAE阳性率、 T 细胞增殖能力及巨噬细胞吞噬功能均有促进作用，并随剂量增加作用增强，量效呈正相关。白蔹提取物可增强小鼠 T 淋巴细胞和巨噬细胞的免疫功能， 表明白蔹的抗菌作用与其免疫活性有关，临床用于抗感染治疗可能具有直接抗菌和调节集体免疫功能的双重机制。 1.1.3 临床应用： (1)治疗外科炎症 将白蔹块根去皮研末，取 3 两 (用量根据炎症面积加减 )以沸水搅拌成团后，加 75 95%酒精调成稠糊状，外敷患处，每日 1 次，以愈为度。对于疖、痈、蜂窝织炎、淋巴结炎、各种炎性肿块等急性感染的初期，有显著疗效。共观察 3l 例，除个
20、别病情危急、全身反应严重加用抗菌素外，一般不用其他药物。用药后疼痛减轻，炎症很快吸收或局限。一般经治 2 3 天可愈。 (2)治疗扭挫伤 取见肿消 2 个 食盐适量，捣烂如泥外敷。共治 80 例， 66 例有效。有的经治 4 天就肿消痛减而愈。 (3) 治疗细菌性痢疾 白蔹块根晒干或焙干 , 研成细末 , 装入胶囊 , 每粒 . g, 每次粒 , 日服次急性菌痢天为4 疗程 , 慢性菌痢天为疗程治疗例 , 急性者例 , 痊愈例 , 好转例 , 无效例；慢性者例 , 痊愈 例 , 好转例 , 无效例 (4)治疗癌性发热 葛根、鳖甲各 30 g，白蔹、青蒿各 15 g。水煎服，每日 1 剂，分 2
21、 次温服。治疗癌性发热 16例，治愈率 87.5%14。 (5)治疗支气管扩张咯血 白毛夏枯草 20 g，白芍 12 g，白及 15 g，白蔹、白薇各 9 g。每天 1 剂，加水 550 mL，煎至250 mL，渣加水 350 mL，煎至 150 mL，分 2 次饱腹服。治疗支气管扩张咯血 36 例，显效 24 例，有效 11 例，无效 1 例。总有效率 97. 2%15。 (6)治疗手足皲裂 白芨 15 g，白蔹 30 g，大黄 50 g。炒黄后共研末，用适量的蜂蜜将药末调成糊状，涂抹于患处，每日 3 次。连涂 10 d 为一个疗程 16。 (7)治疗龋齿痛 药物组成：大黄 3 鲍，白 及
22、3 呢，白蔽 3 呢，雄黄 1 鲍。诸药共研细末，装瓶备用。治疗方法：取上药 1 呢 (小儿酌减 )，加食醋少许，调成糊状，数于患侧地仓、颊车穴连线与手阳明大肠经在面颊部循行线的交点处，上盖一层薄膜，再数上纱布，用胶布固定， 24h 后取下。治愈 420例。 将白蔹加入复方中煎汤内服。可治疗各种炎症及腹泻等，还可用于 美容 和减肥。异病同治，灵活运用，充分发挥一药多用的作用 。 1.2 课题提出及研究内容 白蔹 为葡萄科植物自蔹 Ampelopsis japonica（ Thunb） Makino 的干燥块根， 又名白根 、 五爪藤 、山地瓜。性微寒，味苦 ，具有清热解毒、 生肌止痛之 功效。
23、 用于痈肿疮疡、瘰疬、烫伤、扭挫伤；外用于痈、疖、蜂窝组织炎、淋巴结炎等。 药理实验研究表明，白蔹的主要活性为抗菌性，并有抑制黑色素形成等作用。 抗菌是白蔹的主要活性，目前研究的较多。 本实验 的主要目标是测试白蔹乙酸乙酯提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能的基础上，建立定性及定量的测试方法，测定其对两种指示菌的最小抑菌浓度，得到白蔹乙酸乙酯提取物抗菌性能的具体数据，为开发功能性中药材提供理论和实验基础。本实验采用的研究方法：定性实验采用虑纸片法定量实验采用琼脂稀释法进行抑菌试验，采用试管倍比稀释法测定白蔹提取物最低抑菌浓度，评价其体外抗菌活性。 5 2 实验内容 2.1 实验流程 本课
24、题将市售白蔹块根进行粉碎，用乙醇浸渍后再用乙酸乙酯进行回流蒸发提取，将制成的白蔹乙酸乙酯提取物用二甲基亚砜溶剂进行溶解，设置浓度梯度配制不同浓度的白蔹乙酸乙酯提取物溶液。选取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，采用虑纸片法及琼脂稀释法进行抑菌定性试验，采用试 管倍比稀释法进行定量实验测定白蔹提取物最低抑菌浓度。 实验流程如下： 白蔹 指示菌 粉碎、乙醇浸渍制成浸膏 活化 分离浸膏，乙酸乙酯萃取 菌悬液 用二甲基亚砜溶解配制不同浓度的乙酸乙酯提取物 固体 培养基 液体培养基培养 抑菌圈 稀释涂布平板 菌落计数 图 2-1 实验流程示意图 6 2.1 实验试剂 及设 备 2.1.1 主要实验材料及
25、试剂 白蔹，乙醇，乙酸乙酯，牛肉浸膏，琼脂，蛋白胨，氯化钠，蒸馏水，二甲基亚砜，滤纸片。2.1.2 主要仪器设备 电子天平，旋转蒸发器，粉碎机，无菌操作台，烘箱，培养箱，摇床，电热炉，微波炉，灭菌锅，培养皿，试管，烧杯，移液器，容量瓶，玻璃棒。 2.1.3 指示菌 大肠杆菌 （ E.coli） ，金黄葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)。 2.2 实验方法 2.2.1 白蔹的提取 1）粉碎及渗漉提取 a 把 1 千克的市售白蔹块状根用粉碎机粉碎，至粗粉状即可。 b 制作渗漉装置 取干净的应用水桶两个，在其底部凿一个圆形孔，倒置。再取个合适的橡皮塞，将塞子凿一个小孔，以便放下
26、滴管。把带有玻璃滴管的橡皮塞装入倒置的水桶底部，在滴管头部装上橡皮管，渗漉装置制作完成。 c 渗漉提取 将研磨好的白蔹粗粉平均两份倒入两个渗漉桶中，在往里倒入 95乙醇进行渗漉提取，加的过程中并不断搅拌，去除悬 浮液内的气泡，直至液面稍高于白蔹粉末即可停止，静置两周。 2）分离乙醇浸膏 将静置后的乙醇提取物过滤收集，舍去残渣。并将收集好的乙醇提取液用旋转蒸发器进行减压蒸馏提纯浓缩（每进行完一次分离后，都要用 95%乙醇把烧瓶上的少量浸膏冲洗 ，并入下一次蒸馏）。 3）水悬浮和乙酸乙酯萃取 a 悬浮，将全部的粗分离物倒入 1 升的大烧杯中，用少量水经行悬浮，静置。 c 第二步乙酸乙酯萃取 待液面分层后到入 4 瓶 500 毫升装的乙酸乙酯（分析纯）萃取，搅拌片刻，静置。待分层后用虹吸式法提取上层的乙酸乙酯萃取物，放到旋转蒸发仪上进 行分离，分离出的乙酸乙酯倒回大
