1、 1 毕业论文 开题报告 生物工程 天然红色素抗菌性能的初步研究 1 选题的背景和意义 天然色素指的是来源于动物、植物、微生物的色素，绝大多数天然色素无毒和无副作用，安全性高，且具有一定的生物活性，成为色素发展的趋势 1。随着社会及科技进步，天然色素在食品、药品、化妆品及保健品业使用逐渐普及，使用技术逐渐提高，逐渐成为美化社会生活不可缺少的一部分。 目前大多数天然色素来源于植物，但由于植物生长周期长且受 季节、气候、产地等因素的影响，提取工艺复杂，致使天然色素价格昂贵，推广应用受到局限。 开发新品种的天然色素，探索新的 天然色素来源，对 原有天然色素的生产工艺进行改进，扩大天然色素的应用范围，
2、降低天然色素的生产成本，已成为生产中需要迫切解决的问题。 灵菌红素 (prodigiosin， PGs)又名灵菌素、灵杆菌素。是一族具有三吡咯环骨架结构的天然红色素，可由多种微生物产生。自 1929 年 PG 首次从黏质沙雷氏菌中分离出来以后 2，人们对其的研究就一直在不断地进行当中。早期研究表明此类结构的物质具有抗细菌、抗疟疾，抗真菌和抗原生动物的活性。随着研究地不断深入，近年来研究者们惊奇地发现其还具有很强的免疫抑制活性和抗癌抗肿瘤活性，这引 起了研究人员们极大地兴趣和关注。大多数抗癌药物由于靶向问题，对肿瘤细胞和人体正常细胞都具有杀伤作用。在治疗肿瘤的同时对人的肝肾带来巨大损伤。不同于这
3、些药物的是， PG 对 57 种不同的人癌细胞有抗性作用，而在相同的作用剂量下对正常细胞无任何毒害作用 3。鉴于此， PG 的研究具有了独特的优势并有着诱人的市场前景，正逐渐成为医学界抗肿瘤领域的新宠。 PG 作为一种具有良好抗菌性能的天然微生物色素，其在作为功能性天然材料方面也具有一定的应用前景。 PG 的体外抑菌试验表明，其对金葡球菌 (耐青、红霉素菌株 )和福氏志贺氏菌有很好 的抑制效果 4。此外，它对引起 Chagas 疾病的锥虫有很大的杀伤作用。 Chagas疾病是由锥虫 Trypanosoma cruzi 所引起的原生动物传染病。在南美国家非常盛行，此前只发现苄硝唑可以治愈。 Pa
4、tricia 等人在研究 PG 与苄硝唑对 V79 纤维原细胞系的细胞毒性时发现， PG 比以往使用的杀锥虫药有更强的杀锥虫活性。 Cang 等 5以沙雷菌发酵生产的 PG 做抗菌实验，结果表明，对芽孢杆菌具有显著地杀灭作用。 PG 结构类似物具有显著的抗2 Trichophytonspp.等真菌的活性，在临床测试中表现出对 Coccidmycosis 引起的一种地方性真菌传染病有良好的治愈作用。 本研究将定性和定量的考察灵菌红素对常见细菌的抑菌性能和抑菌的稳定性，以期为灵菌红素在纺织、食品、养殖等产业中的应用奠定一定的理论基础。 2 相关研究的最新成果及动态 2.1PG 的生物活性 2.1.
5、1 抗肿瘤作用 Montaner 等 6的研究表明， PG 能诱导人结肠腺癌细胞株 DLD-1 和 SW-620 及人胃癌细胞株 HGT-1 凋亡，对转移性肿瘤细胞株 SW-620 更为有效，其诱导结肠癌细胞凋亡呈剂量依赖性，主要表现为细 胞收缩、染色质缩合、肌动蛋白微丝结构重组等。 2.1.2免疫抑制剂活性 选择性免疫抑制包括在自体免疫性疾病治疗和临床器官移植中能抑制信号传递，预防 T 细胞激活。临床上将 PG 与 CyA 结合用于解除器官移植急性排斥反应，作用效果好 6，对其潜伏期和临床应用有待进一步的研究。 2.1.3 抗菌作用 PG 具有抗细菌（ antibacterial）、抗真菌（
6、 antifungal）的生物活性。 PG 结构类似物具有显著的抗 Trichophytonspp.等真菌的活性 7，在临床测试中表现出对 Coccidmycosis引起的一种地方性真菌传染病有良好的治愈作用 8。 2.1.4 抗疟疾活性 PG 对引起查格斯疾病的锥虫（一种寄生虫）有很大的杀伤作用，其杀锥虫活性（ IC50=5 mol）是经典杀锥虫药 Nifurtimox 活性（ IC50=150 mol）的 30倍。 PG可作为生物农药用于防治 Botrytis cinerea等引起的樱草属植物病害 . 2.1.5抗肿瘤活性及其可能的作用机理 PG 具有有效的抗肿瘤活性，美国国立癌症研究所
7、(NSI)Melvin 等发现 PG 在平均 ICso为 2 Ivmol L-1时对包括白血病、肺癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、卵巢癌在内的八种癌细胞株中的 57种不同的人癌细胞均有抗性作用。研究者们认为PG 的这种抗癌特性与其诱导细胞凋亡的活性密切相关，目前就其机理提出了四种可能：作为 pH 调节器；作为细胞分裂周期抑制剂；作为 DNA 裂解因子；作为胞外信号调节激酶调节器 9I。 3 2.1.6抑制癌细胞浸润转移活性 癌细胞转移是造成癌症患者死亡的主要原因。 PG 可促进细胞浓集，同时抑制细胞附着于胞外基质 (ECM)并抑制癌细胞浸润转移 10l。 2.2 PG 的生
8、产现状和发展趋势 当前 PG 的生产以生物合成为主。 PG 是微生物的次级代谢产物，可由多种细菌和放线菌产生，包括链霉菌属 (Streptomyces)、沙雷氏菌属 (Serratia)和假单胞菌属 (Pseudo mona5)，其中关于沙雷氏菌属 (Serratia)的研究最多。在对其代谢途径的研究发现， PG 是通过一条二叉的途径合成的。该途径的关键步骤是最后一步酶促缩合反应，即 2一甲基一 3一戊基吡咯(MAP)和 4 一甲氧基一 2， 2 7 一二吡咯一 5 一羧甲基乙醛 (MBC)在酶的作用下缩合生成PG(Prodigiosin)，而催化此反应的关键酶是 PG 缩合酶 (Prodig
9、iosin condensing enzyme，PCE)E33l。另外，在对其生产条件的研究得知，发酵液中碳源、氮源、温度、 pH、通氧量以及微量元素均为影响 PG产量的重要因素。 长期以来，通过生物发酵法生产 PG的产量始终不高。 1973年， Williams以粘质沙雷氏菌 (S marcescens)Nima 株为出发菌株，摇瓶发酵培养 96h 后得到 PG 的最高产量为0 02359 L_134； 1979 年， Alonzo 等人以 S marcescens 为出发菌株 ，通过调节培养基的碳源与氮源的比例，利用摇瓶培养 48h 得到 PG 的最高产量为 0 19 L-111； 198
10、1 年，Katsumt Nakamura等人专利报道了以 S marcescens R-2为出发菌株，摇瓶培养 48h得到 PG的最高产量为 0 1719 L一 1E36“1； 1994年， Sole等人以 S marcescens为出发菌株，通过调节培养基的 pH，利用摇瓶培养 48h得到 PG 的最高产量为 0 29 L_111|。由予 PG 更多更奇妙的活性为人们所发现，其生产亦愈来愈为人们所重视。近年来，随着研究的深入，PG 的产量较以前有了大幅的提高。 2000 年， Cang S等人以一株可以利用乙醇的S marcescens$389为出发菌株，通过摇瓶培养 48h，使得 PG的产
11、量一举提高了数十倍，达2 959 L-138； 2001年， Jungdon B等人以 Serratia sp KH-95(KFCC 10970)为出发菌株，尝试利用反应器扩大发酵合成 PG，通过一系列的工艺条件优化，在有内置吸附剂的生物反应器中， PG产量达到前所未有的最高点，为 13 19 L_112。 Nakashima 等研究用细菌 -proteobacterium 生产 PG 时发现 -proteobacterium 同样具有 quorumsensing（ QS）系统， N-acyl homoserine lactones（ N - A H L ）是此系统的一种关键性物质，在发酵中通
12、过控制 N-AHL 的浓度可提高 PG 的产量 13。 20 世纪 80 年代以来，4 人们开始从基因水平研究 PG 的生物合成途径及其调节， 1983 年 Feitelson 等克隆了天蓝色链霉菌与 PG合成相关的基因簇， Thomason等则首次将分离得到的 Serratia PG生物合成基因转入欧 文氏菌（ Erwinla carotovora）质粒，成功表达并得到了 PG。随着生物操作技术的发展和对 PG 的深入研究，人们将更加清晰地认识 P G 的产生和作用机制，大量生产制备PG，用于替代在癌症及免疫治疗中对人体有害作用的化学药物，造福于人类。 随着 PG应用的逐渐推广和其市场需求的
13、不断增大，其合成研究也在不断发展。尽管全合成生产 PG产量高且价格低廉，但相较于全合成，生物合成更具优势。通过生物合成生产PG 安全可靠，符合人们对绿色天然的追求。然而，生物合成也有产量较低、分离困难等自身的缺点。因此，如何改造菌株 ，优化发酵工艺，寻求一条经济可行的生物合成 PG的途径，将成为今后 PG研究的热点。 3 课题的研究内容及拟采取的研究方法、研究难点及预期达到的目标3.1 课题研究内容 3.1.1.通过平板抑菌圈法测定灵菌红素对不同微生物抑菌性； 3.1.2.测定灵菌红素对各菌最小抑菌浓度 MIC； 3.1.3.测定灵菌红素在不同时间、不同温度、不同 pH 下的抑菌稳定性能。 3
14、.2 研究方法 3.2.1 灵菌红素的制备 采用本实验室保存的沙雷氏菌，经活化后发酵，待发酵完成后取出发酵液，倒入离心管，摇匀， 0 10000r/min 离心 10min，弃上清液，然后用移液枪移取适量丙酮于离心管中，用枪头搅拌沉淀，使吸附于菌体上的色素完全溶于丙酮中，再在 0 10000r/min 离心 10min，得到灵菌红素丙酮溶液。使用旋转蒸发仪蒸发大部分丙酮，余下自然风干，收集色素并于干燥暗处保存。 3.2.2 平板抑菌圈法定性测定灵菌红素对常见微生物的抗菌性能。 待测菌种活化，制成了一定浓度的菌悬液。菌液含量采用分光光度计法及稀释法测定。取 0.1ml 菌悬液 涂布平板，再于平板
15、中央加入经灵菌红素浸泡的滤纸片， 37 1倒置培养24h， 记录抑菌圈大小，初步判断抑菌效果。 3.2.3 液体倍数稀释法测定 灵菌红素对各菌的 MIC 用液体倍数稀释法测定最小抑菌浓度（ Mininum Inhibitory Concentration MIC），即液体5 培养基按每管 3ml 分装试管，再加入不同量的灵菌红素溶液，配成一系列浓度梯度的培养基。每支试管培养基接种 0.15ml 的待测菌液，于 37恒温震荡培养箱中培养 24h，另取加入与灵菌红素等量的二甲亚砜试管作为对照。以肉眼观察培养基澄清，无细菌生长时的最低浓度为 MIC。 3.2.4 灵菌红素抑菌的稳定性研究 （ 1）不
16、同 PH 值对灵菌红素抑菌性的影响 在 6 根试管中加入 3ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基，用 0.1%的柠檬酸和 2%的 NaOH 溶液调节 PH 为 4、 5、 6、 7、 8、 9，再按待试菌种的 MIC 浓度加入灵菌红素溶液，接种待测菌悬液 0.15ml，将上述试管放入摇床， 37培养 24 小时，观察细菌的生长情况，确定灵菌红素在不同的 PH 条件下的抑菌稳定性。 （ 2）不同温度对灵菌红素抑菌稳定性的影响 将灵菌红素溶液置于 20 度、 40 度、 60 度、 80 度、 100 度条件下水浴加热 30min，再分别加入 3ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，接种待测菌 悬液 0.15m
17、l，将上述试管放入摇床，37培养 24 小时，观察细菌的生长情况，确定灵菌红素在不同的温度条件下的抑菌稳定性。 （ 3）不同作用时间下灵菌红素抑菌性测定 将 1ml 的灵菌红素溶液和 0.1ml 的菌悬液混合，分别处理 1、 3、 6、 12h 后，将其倒入无菌平板涂布，以无菌水作为对照， 37 度倒置培养 24h，观察菌落生长情况，计算其抑菌率。 3.3 研究难点 3.3.1.在测最小抑菌浓度时，灵菌红素产生菌粘质沙雷氏菌对实验产生的影响； 3.3.2.在测灵菌红素对各菌抑菌圈大小时，灵菌红素加入的量不好控制，过多 或过少都会对实验结果产生不利影响。 3.4 预期目标 3.4.1 灵菌红素对
18、不同微生物抑菌性能； 3.4.2 灵菌红素对不同微生物的 MIC 值； 3.4.3 灵菌红素在各种条件下的稳定性。 4 论文详细工作进度和安排 2010 年 12 月，任务书下达 2010 年 12 月 -2011 年 1 月，查阅文献，完成文献综述和翻译 2011 年 1 月 -2011 年 2 月，灵菌红素抑菌性能研究 6 2011 年 3 月 -2011 年 4 月，天然红色素抑菌性能比较 2011 年 4 月 -2011 年 5 月，灵菌红素抑菌性能研究 2011 年 5 月 -2011 年 6 月， 论文撰写，完成答辩 5 参考文献 1 Han S B, Lee C W, Yoon
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