1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 醋酸杆菌低温发酵条件研究 所在学院 专业班级 高分子材料与工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 摘要 ： 细菌纤维素是在一定的条件下， 某 些 种 类 微生物合成的纤维素的统称 。这些微生物包括 醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等 的细菌 ，其中最典型的是醋酸杆菌属的木醋杆菌， 它具有最高的纤维素生产能力，被确认为研究纤维素合成、结晶过程和结构性质的模型菌株。 细菌纤维素作为一种新型的生物合成材料受到科学界的广泛关注。在食品工业、生物医学、声学器材和石油开采等方面得到了广泛应用。随着科学技术的发展，对细菌纤维素的研究也愈
2、发深入，从细菌纤维素合成方法、发酵条件、培养基优化、影响因素、诱变育种的等方向为细菌纤维素的工业化发展进行研究。影响细菌纤维素细菌合成的因素有很多，包括培养基成分、温度、时间等。本文主要是研究木醋杆菌在低温条件培养条件下产生的细菌 纤维素的形态，结构等方面的影响。 关键词 ： 细菌纤维素 木醋杆菌 细菌培养 II The study of the low-temperature fermentation conditions by Acetobacter xylinum Abstract： With Under certain conditions， Bacterial cellulose i
3、s a general terms of the cellulose ,which is produced by some kinds of microbe. These microbe as well as Bacteria belongs to acetic acid bacteria genera, soil coli genera, rhizobium genera and eight fold aureus genera, etc. The most typical case is Acetobacter xylinum. It has the highest cellulose p
4、roduction capacity, identified as the Model strains for the study of Cellulose synthesis, crystallization process and structural properties. his article is the generalization about the conditions and method of Bacterial cellulose cultivating bacterial cellulose and the properties, applications of pr
5、oducts, development prospects and so on . Bacterial cellulose biosynthesis as a new material by the scientific communitys attention. In the food industry, biological medicine, acoustic equipment and oil drilling, etc can be widely used. With the development of science and technology, the research of
6、 bacterial cellulose also sends thoroughly, from bacterial cellulose synthesis method, fermentation conditions, medium optimization, influence factors, mutation breeding for the direction of development of the industrialization of bacterial cellulose. Influence bacterial cellulose bacteria synthesis
7、 on a number of factors, including medium composition, temperature, time, etc. This paper is mainly research in low-temperature conditions wooden vinegar coli produced under the culture condition of bacterial cellulose form, the influence of structure, etc. Keywords: Bacterial cellulose Acetobacter
8、xylinum bacilliculture III 目 录 1 绪 论 . 1 1.1 概述 . 1 1.2 细菌纤维素的特性及结构特征 . 1 1.3 菌种的选育和优化 . 3 1.4 细菌纤维素的生物合成 . 4 1.5 合成细菌纤维素的影响因素 . 5 1.6 细菌纤维素的应用 . 6 2 实验设计 . 8 2.1 设备及其他药品 . 8 2.2 培养条件 . 8 2.3 培养细菌纤维素的培养基 . 8 2. 4 细菌的接种 . 8 2.5 实验结果 . 8 3 细菌纤维素的性能测试分析 . 9 3.1 概述 . 9 3.2 细菌纤维素性质测定 . 9 3.3结果总结 . 12 3 总
9、结与展望 . 14 4 参考文献 . 15 1 1 绪 论 1.1 概述 纤维素是地球上最丰富的生物合成高分子材料，每年由植物产生的纤维素达亿万吨 ,是植物生物量的主要组成部分，与人类的生活关系密切，不仅是纺织工业和造纸工业的主要原料，还可以用来制造新型高性能功能磁疗和高分子复合材料，在许多技术领域发挥重要作用。但是除 植物外，某些低等动物可产生动物纤维素，某些细菌能以异养方式产生胞外细菌纤维素 .1886年 ,A.J.Brown就首次报告了由木醋杆菌能够合成一种胞外凝胶状的半透明物质为纤维素 1，但由于无合适的实验手段以及纤维素的产量较低，因此一直未受到足够重视。在 20 世纪后期，细菌纤维
10、素才得到人们的重视，而深入研究 BC合成是从 Hestrin 等开始的，他证明了静止和冻干的醋酸细菌细胞在有葡萄糖和氧时能够合成纤维素； Colvin 在含 A.xylinum细胞抽提物、葡萄糖和 ATP样品中观察到有纤维素的合成 2。细菌纤维素（ BC） 属于初级代谢的特殊产物，与植物纤维素（ PC）一样，主要也是起到一种保护层的作用。近十几年来，随着人们对纤维素生物合成机理认识的加深，以其优良性能，在食品、生物医药、造纸、化工、精纺、石油开采以及环保等方面的成功应用，关于 BC 的研究已成为当今新的微生物合成材料研究的热点之一。 1.2 细菌纤维素的特性及结构特征 1.2.1 细菌纤维素的
11、一般特性 细菌纤维素和植物或海藻产生的天然纤维素具有相同的分子结构单元 ,但相比之下， 细菌纤维素有许多独特的性质 3。 细菌纤维素与植物纤维素相比无木质素、果胶和半纤 维素等伴生产物，具有高结晶度（可达 95%，植物纤维素的为 65%）和高的聚合度 (DP值 2000 8000)； 超精细网状结构。细菌纤维素纤维是由直径 3 4纳米的微纤组合成 40 60 纳米粗的纤维束，并相互交织形成发达的超精细网络结构； 细菌纤维素的弹性模量为一般植物纤维的数倍至十倍以上，并且抗张强度高； 细菌纤维素有很强的持水能力 (WRV)。未经干燥的细菌纤维素的 WRV值高达 1000 以上，冷冻干燥后的持水能力
12、仍超过 600。经 100 干燥后的细菌纤维素在水中的再溶胀能力与棉短绒相当； 细菌纤维 素有较高的生物相容性、适应性和良好的生物可降解性； 细菌纤维素生物合成时的可调控性。 1.2.2 细菌纤维素的理化特性 在显微镜下观察到的形态随培养条件的不同而有很大的差异。静止状态下，细菌纤维素一般积累在营养肉汤表面或富氧液体的分界面，这种细菌纤维素叫 S-BC；在搅拌状态下，形成的叫 A- BC，两者的形态、三维结构、纤维宽度、结晶度均有所不同。近年发现细菌产生的纤维素，其结2 构和理化特性等皆与植物纤维素有较大的差异。与植物纤维相比，细菌纤维素是由超微纤维组成的超微纤维网，其超微纤维直径仅为植物纤维
13、的 1/100，其杨氏模量（弹性模量）与铝相当，所以细菌纤维素是一种更理想的可生物降解的生物多聚物。采用不同的培养方法，如静态培养和动态培养，利用醋酸菌可以得到不同高级结构的纤维素。并且，通过调节培养条件，也可得到化学性质有差异的细菌纤维素 4。为了改进 细菌纤维素 的特性使得它更适合医学上的用途， Marit Seifert等在细菌纤维素培养基中加入一些多聚体如羧甲基纤维（ CMC）、甲基纤维素（ MC）等，可提高 细菌纤维素 的含水量。加入 2%的 CMC，发酵结束后离心得到的冻干、肿胀状态的 BC-CMC，其含水量达 96%，而标准状态下得到的细菌纤维素含水量只有 73%。 Yam-an
14、aka Shigeru等通过在培养基中加入某些化学试剂，可以改变细菌纤维素的结构，比如在培养基中加入抗生素抑制细胞分裂或蛋白质合成，可使木醋杆菌形成的细菌纤维素弹性模量得到提高。 1.2.3 细菌纤维素的化学结构 细菌纤维素 和植物纤维素在基本结构上，都可视为由吡喃葡萄糖单体以 -1,4-糖苷键连接而成的直链多糖，又称为 -1,4-萄聚糖，相邻的吡喃葡萄糖的 6 个碳原子并不在同一平面上，而是呈稳定的椅状立体结构如图 1，数个邻近的 -1,4-葡聚 糖链由分子链内与链间氢键稳定结构而形成不溶于水的聚合物 5，聚合度一般在 16000单体如图 2，细菌纤维素与植物纤维素的主要差别在于前者不掺杂有
15、其它多糖，而后者则含有此类物质。 图 1 椅状立体结构 图 2 16000立体交联结构 天然纤维素可分为型和型，型中又有 和 两种晶形排列方式木醋杆菌产生的细菌纤维素混合物，其天然、水溶性状态下的结构已经研究得比较透彻，用小角度的 X 射线折射和电子显微镜扫描显示，其产生的纤维 素属于型，其中 型约 60%， 型约 40%。无论用黄原胶或者果胶进行发酵，其粗纤维（纤维丝带）或纤维素微纤丝的大小都没有变化，同时包含着一种更小的、由纤维素微丝交联构成矩形半晶体结构，脱水状态下看见的结晶纤维素其晶体会变小、矩3 形晶体结构的无序性也会增加 6。 细菌纤维素和植物纤维素在化学组成和结构上没有明显区别，
16、都是由很多 -D-吡喃葡萄糖通过 -1,4糖苷键连接而形成的一种大分子直链聚合物，但与植物纤维素相比，细菌纤维素在纯度、吸水性、物理和机械性能等方面具有众多优良性能，人们十分重视它在各个领域的 应用研究，尤其是在食品、新型伤口包扎材料、人造皮肤、声音振动膜、高强度纸等领域已进入实用化阶段，在其他领域也显示出十分广泛的商业化应用潜力 7。 1.3 菌种的选育和优化 1.3.1 产细菌纤维素的菌种 目前， 自然界中能够产生细菌纤维素的细菌主要有醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等的细菌 8。其中研究最多、 产量最高的细菌是木醋杆菌。不同的细菌纤维素产生菌有着不同的特征，如表 1。 木醋杆菌
17、以单个、成对或链状存在，菌落呈圆形，不透明，突起，淡棕色，表面粗糙，为好氧型，它已被作为细菌纤维素基础和应 用研究的模式微生物 9。 表 1 细菌纤维素产生菌特点对比 菌种名称 产生纤维素特点 纤维素结晶形式 作用 Acetobacter 胞外膜，纤维束 型或型 保持于有氧环境，可利用天然底物 Agrobacterium 胞外微纤维 型 吸附于植物组织 Rhizobium 胞外微纤维 型 吸附于寄主植物 Pseudomonas 无明显微纤维 型或型 用作废水中絮凝剂 Sarcina 无定性纤维素 型 不明确 1.3.2 菌种的筛选及 优化 10 微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位，是决定该
18、发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。现代发酵工业的迅猛发展，除了发酵工艺改进和发酵设备更新之外，更重要的是由于进行了菌种的选育和改良。用于工业生产的微生物菌种，露具有以下特性： (1)在遗传上必须是稳定的。 (2)易于产生许多营养细胞、孢子或其他繁殖体。 (3)必须是纯种，不应带其他杂菌及噬菌体。 (4)种子的生长必须驻盛、迅速。 (5)产生所需要的时间短。 (6)比较容易分离提纯。 (7)有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 (8)能保持较长良好的经济性能。 (9)菌株对诱变剂处理敏感，从而可能选育出高产菌株。 (10)在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相
19、对地稳定。 4 1.4 细菌纤维素的生物合成 1.4.1 细菌纤维素的合成途径 木醋杆菌纤维素合成机制研究比较透彻。其生物合成主要分为四个步骤： (1)在葡萄糖激酶的作用下将葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖； (2)在异构酶作用下将 6-磷酸葡萄糖转化为 1-磷酸葡萄糖； (3)在 UDPG 焦化磷酸酶作用下由 1-磷酸葡萄糖生成尿苷葡萄糖； (4)最后在纤维素合成酶作用下由尿 苷葡萄糖合成 -1， 4-糖苷链，再装配形成纤维素 11，如图 3。 图 3 木醋杆菌的细菌纤维素生物合成途径 12 1.4.2 细菌纤维素的合成方法 细菌纤维素 的合成是一个很复杂的过程，细菌纤维素合成的前体物为尿苷二磷
20、酸葡萄糖，由葡萄糖合成纤维素的 4个主要酶催化反应步骤分别是：葡萄糖激酶对葡萄糖的磷酸化作用；葡萄糖5 磷酸异构酶将 6-磷酸葡萄糖通过异构作用转化成 1-磷酸葡萄糖；焦磷酸化酶将 1-磷酸葡萄糖转化成尿苷二磷酸葡萄糖；以及纤维素合成酶的合成作用 13。木醋杆菌细胞壁侧有一列 50-80个轴向排列小孔，在适宜条件下每个细胞每秒钟可将 200000个葡萄糖分子以 -1,4-糖苷键相连成聚葡糖，从小孔中分泌出来，最后形成直径 1.78nm的纤维素微纤丝，并随着分泌量的持续增加平行向前延伸，相邻的几根微纤丝之间由氢键横向相互联接形成直径为 3-4nm的微纤丝束，微纤丝束进一步伸长，相互之间仍由氢键相
21、互联接，最后多条微纤丝束聚合形成一种长度不定，宽度为 30-100nm，厚度 3-8nm的纤维丝带，其直径和宽度仅为棉纤维直径的 1/100-1/100014。 细菌纤维素的发酵生产细菌纤维素的发酵生产一 般是在含葡萄糖的复杂营养介质中进行的， Son HJ等采用 Acetobacter sp.V6、在如下培养基 1.5%葡萄糖 ,0.2%(NH4)2SO4, 0.3%KH2PO4, 0.3%NaHPO4.12H2O, 0.08%MgSO4.7H2O, 0.0005%FeSO4.7H2O, 0.0003%H3BO3, 0.00005%烟酰胺，和 0.6%乙醇中摇瓶发酵 8天 BC.的产量最高达
22、 4.16g/L。而采用 Acetobacter sp.A9、在如下培养基 4%葡萄糖， 0.1%酵母膏， 0,7%蛋白胨， 0.8%Na2HPO4.12H2O， Ph6.5，温度 30 ，发酵 7天 BC产量达 3.8g/L，如果在上述培养基中加入 1.4%(v/v)的乙醇，摇瓶发酵 8天， BC产量大幅度提高到 15.2g/L。台湾吴文腾等用 Acetobacter xylinum以改进的气升式反应器取代传统反应器发酵 72小时， BC产率提高 3倍，达0.107g/L/h，产量达 7.72g/L。马霞等采用木醋杆菌静止培养条件下，在基本培养基（ 胰蛋白胨0.5%，酵母粉 0.5%，葡萄糖
23、 2.0%， Na2HPO40.5%,pH6.0,120 灭菌 20min）中添加 醋酸、柠檬酸和乳酸，使细菌纤维素的产量得到提高。其中，添加 0.1%的醋酸，细菌纤维素的产量为 2.75g/L；加入 0.2%的柠檬酸时细菌纤维素产量为 2.15g/L；加入 0.1%的乳酸，细菌纤维素的产量为 2.76g/L。Joseph Gerard等发现添加聚内烯酰胺 -丙烯酸也可显著提高木醋杆菌的 BC产率 15。 采用不同的培养方法，如静态培养和动态培养，利用醋酸菌可以得到不同高级结构的纤维素。通过调节培养条件，也可得到化学性质有差异的细菌纤维素。例如，在培养液中加入水溶性高分子如羧甲基纤维素、半纤维
24、素、壳聚糖、 荧光染料以及葡聚糖内切酶等可获得不同微结构和聚集行为的纤维，而羧甲基纤维素或羧甲基甲壳素的导入使细菌纤维素具有了吸收和交换金属离子的特性 16。 1.5 合成细菌纤维素的影响因素 1.5.1 培养基的成分、体积的影响 术醋杆菌发酵生产纤维素的培养基一般包括；碳源 (如葡萄糖、果糖、蔗糖等 )、氮源 (如酵母提取物、蛋白胨 )、有机酸 (如醋酸、乳酸、柠檬酸等 )、无机盐 (如磷酸氢二钠或含钠、镁离子的盐 )、有时还加入咖啡因、生物素等。培养基体积不同，纤维素产量有明显的差异，若培养基体积过多，不利予微生物吸收氧气，而 木醋杼菌是严格好氧的微生物，因此而降低纤维素的产量。 1.5.
25、2 培养温度和时间的影响 培养温度不宜过高，否则会抑制木醋秆菌的发酵合成，一般为 20 30；随着培养时间的变化，纤维素产量也随之而变化，一般静置培养 6 7 天为宜。发酵时间与残糖量和细菌纤维素产量6 的关系如图 4。 图 4 发酵时间对细菌纤维素产量的影响 17 1.5.3 pH 值的影响 因为如果以葡萄糖为碳源，在发酵过程中葡萄糖就会转化成葡萄糖酸，使发酵液 pH 值下降，从而抑制了纤维素的产生。所以在发酵过程中最好用缓冲溶液来控制 pH 值。一般 pH 值选 4 7。 1.5.4 培养方法 静态培养和通风搅拌培养所产生的纤维素不同：在静态培养条件下，在培养基表面 (气一液交界面 )处产
26、生一厚的凝胶化膜，当培养基表面积一定时，随液层厚度的增加，溶氧能力越来越小，抑制了木醋杆菌继续生产纤维素；而在搅拌培养条件下，木醋杆菌发酵生成的纤维素由于摇动产生的剪切力不会形成片状膜而是成团状。但由于在搅拌培养的条件下，木醋杆菌易转化为不产纤维素的菌种，导致纤维素产量的下降，故木醋菌纤维素在静态培养条件下的产量要优于动态培养条件 18。静态培养和震荡培养对纤维素的产量的影响如 表 2。 表 2 静置培养和震荡培养对纤维素产量的影响 19 试验号 振荡培养时间 /h 静止培养时间 /d 纤维素产量 /(g.L-1) 1 0 14 3.79 2 5 13 3.26 3 10 13 3.84 4 15 13 3.40 5 24 13 2.43 6 48 12 1.07 7 72 11 1.13 8 336 0 1.20 1.6 细菌纤维素的应用 1.6.1 在食品工业中的应用 由于细菌纤维素具有很强的亲水性、黏稠性和稳定性，可作为食 品成型剂、增稠剂、分散剂、抗溶化剂、改善口感作为肠衣和某些食品的骨架，已成为一种新型重要的食品基料和
