1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 球状细菌纤维素的制备 所在学院 专业班级 纺织工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 摘要 ： 与其它天然植物纤维素相比，细菌纤维素具有高结晶度、高纯度、高聚合度、高持水性和高复水性等独有的优良性质， 细菌纤维素作为一种 新兴的生物材料受到科学界的广泛关注。随着科学技术的发展，对细菌纤维素的研究也愈发深入，从细菌纤维素合成方法、发酵条件、培养基优化、影响因素、诱变育种的等方向为细菌纤维素的工业化发展进行研究。影响细菌纤维素细菌合成的因素有很多，包括培养基成分、温度、时间等。 本文主要研究木醋杆菌生产细菌纤维素的条件和方法对产物的结构
2、、性质及用途的影响等。 关键词： 细菌纤维素；木醋杆菌；振荡培养；结构 II Globular bacterial cellulose preparation Abstract： Compared with other natural plant cellulose, bacterial cellulose high crystallinity, high purity and high degree of polymerization, high water and the high water holding such unique unique properties bacterial
3、cellulose as a new biological materials attention by the scientific community.With the development of science and technology, the research of bacterial cellulose also sends thoroughly, from bacterial cellulose synthesis method, fermentation conditions, medium optimization, influence factors, mutatio
4、n breeding for the direction of development of the industrialization of bacterial cellulose.Influence bacterial cellulose bacteria synthesis on a number of factors, including medium composition, temperature, time, etc.This paper mainly studies wood vinegar coli production bacterial cellulose conditi
5、ons and methods of the product structure, properties and applications affecting etc. Keywords: Bacterial cellulose; acetobacter xylinum; shaking training; structure III 目 录 1 绪 论 . 5 1.1 概述 . 5 1.2 细菌纤维素的特点 . 5 1.2.1 与植物纤维素的差异 . 1 1.2.2 细菌纤维素的结构特征与性质 . 2 1.3 菌 种 的 选 育 和 优化 .3 1.3.1 产 细 菌 纤 维 素 的 菌种
6、.3 1.3.2 菌 种 的 筛 选 及 优化 .5 1.4 细菌纤维素的生物合成 .5 1.4.1 细 菌 纤 维 素 的 合 成 途径 .5 1.4.2 细 菌 纤 维 素 的 合 成 方法 .6 1.5 合成细菌纤维素的影响因素 .7 1.5.1 培养基的成分、体积的影响 .7 1.5.2 PH 值的影响 .7 1.5.3 培养温度和时间的影响 .7 1.5.4 不同发酵方法对细菌纤维素的影响 .8 1.6 功能及应用 .8 1.6.1 在食品上的应用 .8 1.6.2 在医药上的应用 .9 1.6.3 其它方面的应用 .9 2 实验部分 . 10 2.1培养细菌纤维素的培养液设计 .
7、10 2.1.1 实验 原料 . 10 2.1.2 设备 .10 2.1.3 培养液的配置 .10 2.1.4 细菌的接种 .10 2.1.5 测试实验 .10 3 结果与讨论 .12 3.1 摇 床 对 产 量 的 影响 .12 3.2 细菌 细菌纤维素膜红外光谱的分析 .12 3.3 扫描电镜观察细菌纤维素的结构 .13 3.4 不同培养方式生产的细菌纤维素的吸水性和复水性分析 .13 IV 3.5 X射线衍射分析 .14 4 总 结与展望 .15 参考文献 .17 致 谢 . 19 5 1 绪 论 1.1 概述 纤维素是地球上最 丰富的生物多聚物 ,是植物生物量的主要组成部分。地球上每年
8、由植物产生的纤维素达亿万吨。除植物外 ,某些低等动物可产生动物纤维素 (Tunlcin) ,某些细菌能以异养方式产生胞外细菌纤维素 (Bacterial cellulose ,以下简称 BC)1。 1886年 ,A.J.Brown2就首次报告了由木醋杆菌 (Acetobacterxylinum)能够合成一种胞外凝胶状的物质 ,但由于无合适的实验手段及纤维素的产量较低 ,因此一直未受到足够重视。 BC引起人们更多的注意还在 20世纪后期 ,使用 A. xylinum作 为一 种模型细菌 ,深入研究 BC合成是从 Hestrin等 3开始的 ,他证明了静止和冻干的醋酸细菌细胞在有葡萄糖和有氧时能够
9、合成纤维素 ;Colvin4在含 A.xylinum 细胞抽提物、葡萄糖和 ATP 样品中观察到有纤维素的合成。 BC属于初级代谢的特殊产物 ,与植物纤维素 (PC)一样 ,BC主要也是起到一种保护层的作用。能够产生 BC的细菌主要有 Acetobacter,Rhizobium, Agrobacterium , 和 Sarcina等 5。 BC产生菌中研究最多、产量最高的细菌是产醋酸的 Acetobacter xylinum ,为革兰氏阴性 ,宽 0.6 0.8um ,长 1.04.0um ,以单个、成对或链状存在 ,菌落呈圆形 ,不透明 ,突起 ,淡棕色 ,表面粗糙 ,为好氧型 ,它已被作为
10、细菌纤维素基础和应用研究的模式微生物 6。近十几年来 ,随着人们对纤维素生物合成机理认识的加深 ,以及细菌纤维素在食品、造纸、医药、扬声器材等方面的成功应用 ,关于 BC的研究已成为当今新的微生物合成材料研究的热点之一。 1.2 细菌纤维素的特点 1.2.1 与植物纤维的差异 （ a） Howorth 结构式 （ b）椅状结构式 （ c）纤维素间氢键的排列形式 图 1 纤维素的结构 细菌纤维素和植物纤维素在基本结构上，都可视为由吡喃葡萄糖单体以 -1， 4 糖苷键连接而6 成的直链多糖，又称为 -1， 4 萄聚糖，见图 1（ a），相邻的吡喃葡萄糖的 6 个碳原子并不在同一平面上，而是呈稳定的
11、椅状立体结构，见图 1（ b），在高等植物的二级细胞壁中，聚合度约为700014000，而一级细胞壁则仅为 500 个左右的聚合度，直链多糖的长度与单体数目多寡无关。数个邻近的 -1， 4 葡聚糖链由分子链内与链间氢键稳定结构而形成不溶于水的聚合物（ c），细菌纤维素与植物纤维素的主要差别在于前者不掺杂有其它多糖，如半纤维素或木质素，而后者则含有此类物质。 天然纤维素可分为 型和 型，由 X-射线分析，醋酸菌所产生的纤维素属于 型。醋酸菌所产生的纤维素并非形成细胞壁的一部分，而是由位于细胞壁上约有 5080个孔往外分泌纤维素，先由 1015条直链多糖聚合成 1.5nm的胶状聚合物，然后再由上述
12、聚合物形成走向与菌体长轴平行的纤维束。醋酸纤维素以 2m/min 的速率进行纤维素束的合成。如醋酸 纤维素的单体数随培养时间而有所不同，初期约含 2000个单体，而到稳定期可达到 4000个单体。 1.2.2 细菌纤维素的结构特征与性质 早在 1940年 7，人们就用电镜观察到细菌纤维素由独特的束状纤维组成，这种束状纤维的宽度大约为 100nm，厚度为 38nm，每一束由许多微纤维组成，而微纤维又与其晶状结构相关，其基本模型如图 3所示；就细菌纤维素的大小而言，与植物纤维，人工合成纤维等相比有很大的差异，如图 2所示，其大小仅为人工合成纤维 1/10。 图 2 天然纤维素与人工纤维素直径的对比
13、 7 图 3 细菌纤维素形成的模式图 细菌纤维素的理化特性： BC 在显微镜下观察到的形态随培养条件的不同而有很大的差异。静止状态下 ,BC 一般积累在营养肉汤表面或富氧液体的分界面 ,这种 BC 叫 S - BC;在搅拌状态下 ,形成的 BC 叫 A - BC ,两者的形态、三维结构、纤维宽度、结晶度均有所不同。近年发现细菌产生的纤维素 ,其结构和理化特性等皆与植物纤维素有较大的差异。与植物纤维相比 ,BC 是由超微纤维组成的超微纤维网 ,其超微纤维直径仅为植物纤维的 1/ 100 ,其杨氏模量 (弹性模量 ) 与铝相当 ,所以BC 是一种 更理想的可生物降解的生物多聚物 8 。 BC 有许
14、多独特的性质。如 : (1) BC 是一种 “纯纤维素 ”,有高化学纯度和高结晶度 ,植物纤维主要由纤维素组成 ,但参杂其它许多糖类 ,如半纤维素或木质素。 (2)BC 的弹性模量为一般植物纤维的数倍至十倍以上 ,并且抗张强度高。 (3)BC 有很强的持水能力、有较高的生物适应性和良好的生物可降解性。 (4) 生物合成时可调控。采用不同的培养方法 ,如静态培养和动态培养 ,利用醋酸菌可以得到不同高级结构的纤维素。并且 ,通过调节培养条件 ,也可得到化学性质有差异的 BC9 。为了改 进 BC 的特性使得它更适合医学上的用途 ,Marit Seifert 等 10在 BC 培养基中加入一些多聚体
15、如羧甲基纤维 (CMC) 、甲基纤维素 (MC) 等 ,可提高 BC 的含水量。加入 2 %的 CMC ,发酵结束后离心得到的冻干、肿胀状态的 BC - CMC , 其含水量达 96 % ,而标准状态下得到的 BC 含水量只有 73 %。 Yamanaka Shigeru 等 11通过在培养基中加入某些化学试剂 ,可以改变 BC 的结构 ,比如在培养基中加入抗生素抑制细胞分裂或蛋白质合成 ,可使木醋杆菌形成的 BC 弹性模量得到 提高。 细菌纤维素的化学结构： BC和植物纤维素在基本结构上 ,都可视为由吡喃葡萄糖单体以 - 1 ,4 糖苷键连接而成的直链多糖 ,又称为 - 1 ,4 萄聚糖 ,
16、相邻的吡喃葡萄糖的 6 个碳原子并不在同一平面上 ,而是呈稳定的椅状立体结构 ,见图 2 (A) ,数个邻近的 - 1 ,4 葡聚糖链由分子链内与链间氢键稳定结构而形成不溶于水的聚合物 ,聚合度一般在 16000 单体 ,见图 2 (B) ,BC 与植物纤维素的主要差别在于前者不掺杂有其它多糖 ,而后者则含有此类物质 12 。天然纤维素可分为 型和 型 , 型中又有 和 两种晶形排列方式 , Acetobacterxylinus 产生的 BC 混合物 ,其天然、水溶性状态下的结构已经研究得比较透彻 ,用小角度的 X射线折射和电子显微镜扫描显示 ,其产生的纤维素属 于 型 ,其8 中 型约 60
17、 % , 型约 40 %。无论用黄原胶或者果胶进行发酵 ,其粗纤维 (纤维丝带 ) 或纤维素微纤丝的大小都没有变化 ,粗纤维宽度为 500! ,同时包含着一种更小的、由纤维素微丝交联构成面积为10 160! 2的矩形半晶体结构 ,脱水状态下看见的结晶纤维素其晶体会变小、矩形晶体结构的无序性也会增加 13 。也有报道显示不同菌种、甚至同一菌种不同的发酵条件产生的 BC 的化学结构也是不同的 ,Asako Hirai 等 14 采用 Acetobacter xylinum ATCC23769 在不同 pH、不同温度下发酵可分别产生 和 型纤维素。 图 4 细菌纤维素的化学结构 1.3 菌种的选育和
18、优化 1.3.1 产细菌纤维素的菌种 目前， 自然界中能够产生细菌纤维素的细菌主要有醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等的细菌 15 。其中研究最多、 产量最高的细菌是木醋杆菌。木醋杆菌以单个、成对或 链状存在，菌落呈圆形，不透明，突起，淡棕色，表面粗糙，为好氧型，它已被作为细菌纤维素基础和应用研究的模式微生物 16 。 表 1 细菌纤维素产生菌特点对比 菌种名称 产生纤维素特点 纤维素晶种形成 作用 Acetobacter 胞外膜，纤维束 I 型或 II 型 保持于有氧环境可利用天然底物 Agrobacterium 胞外微纤维 I 型 吸附于植物组织 Rhizobium 胞外微纤维
19、I 型 吸附于寄主植物 9 Pseudomonas 无明显微纤维 I 型或 II 型 用作废水中絮凝剂 Sarcina 无定性微纤维 II 型 不明确 1.3.2 菌种的筛选及优化 17 微生物菌种选育在发酵工业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与 否的关键。现代发酵工业的迅猛发展，除了发酵工艺改进和发酵设备更新之外，更重要的是由于进行了菌种的选育和改良。用于工业生产的微生物菌种，露具有以下特性： (1)在遗传上必须是稳定的。 (2)易于产生许多营养细胞、孢子或其他繁殖体。 (3)必须是纯种，不应带其他杂菌及噬菌体。 (4)种子的生长必须驻盛、迅速。 (j)产生所
20、需要的时间短。 (6)比较容易分离提纯。 (7)有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。 (8)能保持较长良好的经济性能。 (9)菌株对诱变剂处理敏感，从而可能选育出高产菌株。 (10)在规定的时 间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定。 1.4 细菌纤维素的生物合成 1.4.1 细菌纤维素的合成途径 木醋杆菌纤维素合成机制研究比较透彻。其生物合成主要分为四个步骤： (1)在葡萄糖激酶的作用下将葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖； (2)在异构酶作用下将 6-磷酸葡萄糖转化为 1-磷酸葡萄糖； (3)在 UDPG 焦化磷酸酶作用下由 1-磷酸葡萄糖生成尿苷葡萄糖； (4)最后在纤维素合成酶作用下由尿苷葡萄糖合成 -1， 4-糖苷链，再装配形成纤维素 18 。
