1、第一篇 组成人体的细胞第四章 细胞培养人体是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。但是如果把活细胞拿到体外 （ in vitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。活细胞离体后于模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养使之生存并增殖和进行生理活动，这一过程就称为细胞培养（cell culture）或细胞培养技术（ cell culture technique） 。第一节 细胞培养概述一、细胞培养的基本概念细胞培养是从体内组织取出细胞并在体外模拟体内环境下，使之生存、生长、繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。二、体外
2、培养细胞的条件模拟细胞在体外能否生存以及生活质量的好坏严格依赖于所提供的这种人工模拟环境是否与体内的生理环境一致或相似。概括说来，这种人工模拟的生存环境主要包括营养、温度、渗透压、pH 等几方面的因素。（一）营养需求体外培养细胞时，营养需求是满足其生存、生长增殖的首要条件。而细胞培养基便是在体外培养细胞时供给细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质。1细胞对营养的需求 离体培养细胞对营养的需求基本上与在体相同，主要包括氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、蛋白质、脂类等几个方面。（1）氨基酸既是细胞合成蛋白质的原料，也是细胞重要的能量来源，氨基酸的种类及数量影响着细胞的密度、增殖、活力等诸多方面。几乎所
3、有的细胞均需要下列 12 种氨基酸：精氨酸、缬氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、胱氨酸。（2）用于细胞培养糖类物质主要有葡萄糖和半乳糖，其中以葡萄糖最为多用。糖类物质是细胞最主要的能量来源，同时也是生物合成核酸、氨基酸、脂类物质重要的碳源。（3）无机盐对于基础培养基渗透压的调节至关重要，同时还对细胞跨膜电位的调节、细胞附着以及一些酶的活性调节具有重要作用。经常添加的无机盐离子主要有钠、钾、镁、磷、钙等。（4）维生素是诸多细胞代谢活动重要的辅酶，严重影响着细胞的活力与增殖。生物素、叶酸、烟酰胺、核黄素、维生素C、维生素B 12、吡哆醇等都是培养基需
4、要添加的成分，尤其以B族的维生素常见。（5）血清是一个包含大量蛋白以及多种生长因子、激素、氨基酸、糖、胰蛋白酶抑制剂、脂类物质、无机盐、微量元素等的非常复杂的混合物。最常用的血清主要有胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、新生牛血清（newborn calf serum，NCS）、小牛血清（calf serum，CS ）、马血清、猪血清以及人血清。（6）脂肪酸和脂类物质也常有血清提供，尤其被一些特定的细胞系所必需。例如，用于培养胆固醇依赖的杂交瘤的培养基就需要添加一定量胆固醇。（7）微量元素常被添加给那些无血清培养基，以弥补因未添加血清所造成的微量元素缺失或不足，主要有锌
5、、铜、硒等。其中硒对于清除培养基中的由代谢产生的自由基具有重要作用。2培养基 用于细胞培养的培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为天然培养基和合成培养基。（1）天然培养基：在细胞培养技术发展的早期，所用的细胞培养基多是来自于淋巴液、血浆、血清以及各种组织提取液，常被称为天然培养基。目前最普遍使用的天然培养基是血清，以胎牛血清、新生牛血清和小牛血清最为常见。但这种天然的培养基常被作为添加剂与合成培养基合用，常见的血清添加比例为 5% 20%。（2）合成培养基：是在对细胞培养时所需各种营养仔细研究的基础之上，根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。包括碳水
6、化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。基本培养基。早期研制的合成培养基单独使用虽能使细胞生存但往往不能很好的生长增殖，需要添加一定量的血清才能成为真正的“完全培养基” ，故常将其称为基本培养基，常见的 MEM、DMEM、RPMI1640、199 等均属此类；无血清培养基。无血清培养基是一种不需要添加血清就可维持培养细胞存活、生长、增殖的合成培养基。无蛋白培养基。目前，这种无蛋白培养基的研制是对通过添加植物水解物来代替动物激素、生长因子等的作用来饲养细胞的；限定化学成分培养基。限定化学成分培养基同样是一种不含动物蛋白的培养基，和无蛋白培养基不同点在于其没有添加植物水解物
7、，而是使用了一些已知结构和功能的小分子化合物。因此，这种培养基的所有成分都是明确的，是目前研究细胞分泌产物的一种最佳培养基。（二）温度体外培养的细胞需要在一定的温度条件下才能存活，不同细胞适宜的培养温度常由动物种类所决定。比如，哺乳类动物细胞包括人类细胞的理想培养温度多在 36 37；鸟类细胞适宜的培养温度在 38.5；昆虫细胞的培养温度在 25；冷血脊椎动物的培养温度在 1825。培养温度的不适当会严重影响细胞的存活及生长状态。通常，细胞对低温可有较长时间的忍耐限度，甚至可在低于适宜温度一定范围内生长，但如果培养温度高于适宜温度时（如在 39条件下培养人类细胞），细胞常会在几 h 内便死亡。
8、因此，定期检查细胞培养箱的温度非常重要。（三）渗透压离体的细胞必须生长在等渗的液体环境中才能维持细胞的正常形态结构，并有助于细胞对出入细胞的物质进行调控。渗透压的大小主要由培养基中各种盐成分的浓度决定。尽管大多数细胞对渗透压都有一定的耐受性，但适宜的渗透压常会因细胞的种类及物种来源不同而异。例如，培养人类细胞的理想渗透压为 290 mOsm/kg；培养大多数哺乳类动物细胞的理想渗透压多在 260-mOsm/kg320 mOsm/kg 范围内；培养小鼠细胞的理想渗透压多在 320 mOsm/kg 左右。（四）气相及 pH体外培养的细胞对气体环境也有一定的要求。多数细胞在培养时需要 O2 的存在，
9、但 O2 的分压多维持在略低于大气中的 O2 分压的水平，这是因为过高的O2 分压会造成细胞的损伤。CO 2 也是细胞培养所需要的，其与培养基 pH 值的维持密切相关，CO 2 浓度的升高会引起培养基 pH 值降低。体外培养细胞时的气体环境常由 95的空气和 5的 CO2 构成，针对培养对象的不同， CO2 的浓度常在 210之间变化。适宜大多数细胞生长的培养基pH多维持在7.0-7.4之间，而细胞在培养过程中所释放出的代谢产物尤其是CO 2会造成培养基pH值的迅速下降，很不利于细胞的继续生长。为了尽可能长时间的将培养基的pH 值稳定在适当范围，常借助CO2碳酸氢盐缓冲体系或有机缓冲体系（如H
10、EPES）来解决这一问题。下面的反应式可以用来说明CO 2-碳酸氢盐缓冲体系的作用原理。NaHCO3 + H2O Na + + OH- + H2O+CO2上式说明，只要维持 CO2 的浓度处于一个相对恒定的状态，上述反应就会保持平衡，此时培养基中的 OH-的浓度也就会相对稳定，换言之，培养基的 pH也相对恒定。同时，这也是为什么在培养细胞时要维持一定浓度 CO2 的重要原因之一。（五）无毒无污染体外培养的细胞必须生长在无毒无污染的环境中，这时因为体外生长的细胞一般情况下对有毒有害物质无任何解毒能力，抵抗力也极差。细胞毒性物质的存在常会导致培养细胞的死亡。除有毒化学物质的污染危害外，细菌等微生物
11、的污染，以及不同细胞间的交叉污染也是细胞培养时必须要避免的事情。可通过严格的过滤除菌或灭菌处理，并使用抗生素来降低污染的发生机率。在细胞培养中最常使用的抗生素是青霉素（常用浓度是 25g/ml 100g/ml）与链霉素（25g/ml 100g/ml）。不同类型细胞间的交叉污染主要由操作不当引起，在对不同细胞进行操作时应避免使用同一瓶培养基或使用同一个吸管。第二节 培养细胞的生物学特性一、体外培养细胞的分型体外培养细胞时，主要有两种培养体系：一种是贴附依赖型，一种是悬浮型。（一）贴附依赖型大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖型细胞，依据培养细胞在体外的形态大致可将其分为以下四种类型。1上皮细胞型
12、 细胞多呈扁平不规则多角形，中央有圆形细胞核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。此型细胞多起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等。例如，来源于人类胚肾的 HEK293 细胞，来源于人类肝脏组织的 HEPG2 细胞，来源于人类子宫颈的 Hela 细胞就属此类。2成纤维细胞型 胞体多呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形细胞核，呈放射状生长。除真正的成纤维细胞外，起源于中胚层间充质的组织的心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等均呈本型形态。另外，也常将一些与成纤维细胞形态类似的培养细胞归为此类。常见的成纤维性细胞如源自小
13、鼠胚胎的 NIH 3T3、小鼠结缔组织的 L929、中国仓鼠卵巢的 CHO、叙利亚地鼠肾脏的 BHK-21 等。3游走细胞型 多呈散在生长，一般不连成片，具有活跃的游走或变形运动能力，且方向不确定。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞进行严格区别。4多型细胞型 一些细胞，如神经细胞由于难以确定其稳定的形态，常归于此类。（二）悬浮型有一些类型的细胞在体外培养时不需要贴附，而是悬浮生长。这些细胞的胞体常呈圆形，多见于一些造血系肿瘤细胞，其特点是生长速度较快、传代方便。常见的 U937 、HL60、K562 造血系肿瘤细胞均属此类。二、体外培养细胞与体内细胞的差异细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞
14、间相互作用的影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，体外培养的正常细胞已成为一种在特定条件下生长的细胞群体。它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也出现了一些不同于机体细胞的性状，主要表现在：失去原有组织结构和细胞形态。如，体外培养的肌肉细胞表现出纤维化的特点；分化减弱或不显，出现类似“返祖”现象（去分化），细胞的形态功能趋向单一化，或在生存一定时间后衰退死亡；发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系，或变成具有恶性性状的细胞群。三、培养细胞的生长特点（一）贴附大多数哺乳动物细胞在体外生长时需附着在一定底物如塑料、胶原、玻璃或其他细胞做成的饲养层细胞上才能生长、分裂。
15、贴附之前的细胞一般为球体样，在一些特殊的能促进细胞贴附的物质如型胶原、血清扩展因子的帮助下，细胞先吸附到底物上，随后与底物附着并伸展成一定的形状。不同细胞的贴附能力不同，如巨噬细胞、成纤维细胞等的贴附能力较强，能在数 min 至数 10min 内贴附到固相表面；而神经元、羊水细胞等的贴附能力则较弱，一般需要数 h 乃至更长的时间才能贴附到固相表面。（二）接触抑制与密度依赖性对于相当一部分体外培养的贴附细胞来说，随着细胞不断的生长与分裂，当相邻两个细胞彼此靠近时，其中之一或两个细胞便会停止移动而不至于重叠起来，转而朝向未生长有细胞的空间生长，这种现象被称为接触抑制（contact inhibit
16、ion）。而进一步的生长会使细胞密度变得越来越大直至形成一个细胞单层，在此过程中，细胞与培养基接触的面积也会因此而减少，此时，细胞的分裂便会停止，但细胞还会存活一段时间，这种现象被称为密度抑制（density inhibition）或密度依赖性。通常，细胞的这种密度依赖性与培养基中血清的浓度关系密切。与体外培养的正常细胞不同，转化细胞或恶变的肿瘤细胞的接触抑制特性降低或丧失，导致细胞重叠生长。同时，转化细胞或恶变的肿瘤细胞的密度依赖性调节也常常降低，对血清的依赖性也降低，可以生长到一个较高的终末细胞密度。四、体外培养细胞的生长过程体外生长的培养细胞受营养条件、生长空间等因素的限制，当细胞增殖达
17、到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液进行扩大培养，此过程称传代（subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。加之很多细胞特别是正常细胞，其在体外的生存也不是无限的过程，这就使得细胞在体外培养时的生长过程与体内有着一系列不同的生存特点。（一）培养细胞的生命期培养细胞生命期（life span of culture cells）是细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本一致。体外培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况密切相关。比如，来源自人胚的二倍体成纤维细胞可在体外连续传代 3050 代，约 150
18、300 个细胞增殖周期，相当于一年左右的生存时间。相比之下，那些来自成体或衰老个体的细胞的生存时间则较短，如体外培养的肝细胞或肾细胞一般仅能传几代或十几代。通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为三个阶段。1原代培养期 原代培养也称初代培养，是从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。2传代期 传代期通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称
19、做细胞系（cell line）。一般情况下，正常体细胞在传代 10-50 次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。3衰退期 处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。以上主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性（immortality）或恶型性（malignancy）的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系（infinite cell line）或连续细胞系（continuous cell line）。（二）培养细胞的一代生存期所谓培养细胞的“一代生存期”，是从细胞
20、接种后到再次传代培养之前的这一段时间，它与细胞世代（generation）或倍增（doubling）时间不同。例如，某一细胞系为第 60 代细胞，即指该细胞系已传代了 60 次。就培养细胞的一代生存期而言，细胞通常可以倍增 36 次。培养细胞的一代生存期，一般可被分为三个阶段。1潜伏期 以贴壁生长的培养细胞为例，刚刚经历传代接种的细胞，常在培养基中呈现悬浮状态，此时细胞的细胞质回缩，胞体呈圆球形。紧接着，悬浮细胞便会贴附于底物表面上，此过程称贴壁。各种细胞贴附速度并不相同，这与培养细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。待细胞贴附于支持物后，细胞便开始进一步伸展成极性细胞，但这距离细
21、胞进入生长和增殖期还有一定时间，称为潜伏期（latent phase）。细胞潜伏期的长短与细胞接种密度、细胞种类以及培养基性质等密切相关。通常，原代培养细胞的潜伏期较长，约需 2496h 或更长时间，而连续细胞系和肿瘤细胞的潜伏期则较短，仅 624h。另外，细胞接种密度大时潜伏期常会变短。2对数生长期 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多，便标志着潜伏期的结束和对数生长期（logarithmic growth phase）的开始。对数生长期是细胞增殖分裂最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量的多少常作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志，一般用分裂指数（mitotic index，MI）来表示：分裂
22、相在整个细胞群中所占的百分比。体外培养细胞的分裂指数受细胞种类、培养液成分、营养条件、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数多介于 0.1%0.5%之间，原代细胞分裂指数较低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达 3%5%。对数增生期是细胞一代生存期中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。3停滞期 当细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期（stagnate phase）。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（plateau phase）。处于此期的细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，但随着培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物的积累、pH 值的降低，此时需要进行及时的传代
23、培养，否则细胞会因营养匮乏、中毒等原因，发生形态改变，重则从底物脱落死亡。第三节 原代培养与传代培养一、原代培养将动物机体中待培养组织从机体中取出，然后用各种消化性酶（如胰蛋白酶）消化，或用机械方法处理，将组织分离成单细胞，最后添加适当的培养基培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。原代培养的细胞由于其和机体细胞在形态结构、功能等方面非常接近，常被用作药理实验重要的研究材料。 （一）所需设备与试剂超净工作台、细胞培养箱、离心机、离心管、倒置显微镜、普通光学显微镜、吸管、废液缸、培养瓶、平皿、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、水浴锅（37 ）、添加有 0.02%EDTA 的 0.
24、25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640 细胞培养基（添加有 20的 FBS）、Hanks 液、75%酒精溶液、碘酒等。培养对象：新生小鼠的肝细胞。（二）操作步骤1胰蛋白酶消化法（1）将新生小鼠拉颈椎致死，置 75%酒精泡 2-3s，再用碘酒消毒腹部，用纱布将小鼠包裹后带入超净台内，解剖取肝脏，放入一玻璃平皿中。 （2）用 Hanks 液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物，然后用手术剪将肝脏剪成 1mm3 大小的组织块，再用 Hanks 液洗三次。 （3）将组织块转移至一小青霉素瓶中，视组织块的多少加入 56 倍体积的 0.25% 37 预温的胰蛋白酶消化液中消化。（4）待大部分细胞被
25、消化成为单细胞后，加入 35ml 培养液及时终止胰酶的消化作用。（5）将上述细胞悬液转移至一离心管中，1000rpm ，离心 5min，弃上清液。（6）加入 Hanks 液 5ml，重悬细胞，然后重复上一步骤。（7）加入 12ml 培养基重悬细胞，血球计数板计数细胞密度。（8）在细胞计数的基础之上，利用培养基将细胞密度调整到 5105 个/ml左右，然后将细胞悬液转移（分装）至相应大小的细胞培养瓶中，置细胞培养箱中 37培养。 2组织块法（1）第 1、2 步与胰酶消化法相同。（2）将用 Hanks 洗涤后的组织块直接转移到培养瓶，贴附在培养瓶的底面（凹面，生长面）。（3）将培养瓶翻转，使培养瓶
26、的生长面朝上，然后加入适量培养基至瓶中，应避免培养液与组织块接触。（4）将培养瓶小心转移至细胞培养箱中，37静置 23h，然后轻轻翻转培养瓶，使培养瓶的生长面组织浸入培养液中（勿使组织漂起），继续培养。3注意事项（1）自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件，细胞计数可在有菌环境中进行。（2）75% 酒精泡消毒的时间不宜过长，以免酒精从口和肛门浸入小鼠体内。（3）待到组织块周围长出单细胞层后将组织块剔除，便可收获细胞或进行传代培养。（4） 胰蛋白酶消化的时间长短与组织细胞的幼嫩程度、数量以及酶的活力等因素密切相关，另外在消化过程中应密切观察，及时吹打，避免消化过度。二、细胞传代培养 当细胞在培养瓶长成致密的单层后，通常已经没有足够的生长空间和营养条件满足细胞进一步生长的需求。为使细胞能继续生长，同时使细胞的数量扩大，就必须进行传代再培养。同时，传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法，也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。通常，悬浮型细胞可通过直接补充培养基后再分瓶的方法进行传代，方法相对简单，而贴壁细胞则需经消化后才能分瓶培养。（一）所需设备与试剂超净工作台、细胞培养箱、离心机、离心管、倒置显微镜、吸管、废液缸、培养瓶、移液管、添加有 0.02%EDTA 的 0.25%胰蛋白酶消化液、RPMI 1640 细胞培养基（添加有 10FBS ）、Hanks 液等。
