1、1MicroRNA-9-1 慢病毒载体的构建及其对小鼠骨髓间质干细胞诱导分化为神经细胞的影响 *景黎君，贾永林，鲁晶晶，韩 瑞，王舒阳，李尽义，彭 涛，贾延劼 （郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州 450052）摘 要 目的： 探讨 microRNA-9-1 在体外诱导小鼠骨髓间充质干细胞（ MSCs）向神经细胞分化中的作用。方法: 构建小鼠 microRNA-9-1 慢病毒载体（microRNA-9-1-LV）并感染小鼠 MSCs，筛选最适感染复数（MOI） ；实验分为未感染组、感染组（感染microRNA-9-1-LV 组） 、阴性对照组（感染 FU-RNAi-NC-LV） ；采用
2、-巯基乙醇诱导感染后小鼠 MSCs 分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察 MSCs 感染后荧光表达情况；采用免疫细胞化学染色检测神经元烯醇化酶（NSE） 、神经微管结合蛋白（ MAP-2）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达变化； PT-PCR 检测 MAP-2 mRNA 的表达变化；MTT 方法检测细胞存活率。结果：(1) 阳性克隆 PCR 证明小鼠 microRNA-9-1 慢病毒载体构建成功，孔稀释法测定病毒滴度为 11012 TU/L。(2) 倒置显微镜下观察小鼠 microRNA-9-1 慢病毒载体感染成功，MOI 值为 20，感染 4 d 时感染率最高，细胞存活率较高，感染率可达
3、91.3% 4.2%。(3) -巯基乙醇可以诱导 MSCs 向神经细胞分化，其中以感染组诱导效果最佳，NSE 和 MAP-2的表达率显著高于其它各组（P0.05） ；感染24 h，感染组MTT值显著下降，与各对照组MTT值比较均有显著差异（P0.05） ，各对照组之间无显著差异。感染48 h、72 h、96 h后MTT值虽较24 h有所上升（P0.05 ） ，但与其他组 MTT比较仍有显著差异（P 0.05） ，见表3。4 -巯基乙醇体外诱导 MSCs 分化为神经细胞未感染组MSCs诱导5 h，部分细胞出现神经细胞改变，胞体收缩呈多角形或圆形，突起细长，有数个分支，部分在局部形成网络。感染mi
4、cro-RNA-9-1-LV组诱导后，细胞形态变化更为迅速和显著，诱导5 h多数细胞胞体收缩呈圆形、锥形，细胞突起细长，交织成网，形成较典型的神经细胞结构，少量细胞脱落、死亡。阴性对照组和未感染组类似，见图3。5 免疫细胞化学染色法感染组诱导5 h，NSE和MAP-2的表达率分别为87.2% 2.0%和85.5% 0.8%，显著高于其它各组（P0.05）。各组 GFAP表达率均小于1%，无显著性差异，见图4、表4。6 RT-PCR 结果3组分别诱导分化5 h均表达MAP-2 mRNA，未转染组和阴性对照组无显著差异，感染microRNA-9-1组表达MAP-2 mRNA较前2组明显增高，有显著
5、差异，见图 5、图6。讨 论1 慢病毒载体感染技术慢病毒基因转导载体包容量大，能够感染任何类型神经细胞，其携带的目的基因可整合到宿主细胞基因组使外源基因获得长期稳定表达，且不编码病毒蛋白，在中枢神经系统中也不会引起免疫反应 5。在人和小鼠脑组织中成熟的microRNA-9有3种不同形式，microRNA-9-1、-9-2和-9-3 ，其原始转录本分别位于 3、13、7 号染色体上。通过用维甲酸处理小鼠P19细胞发现，microRNA-9-1在诱导后有明显变化，经历急剧上升至迅速下降过程，且处理后神7经特异性标志物MAP-2逐渐上升，提示microRNA-9-1在神经分化中起着重要调控作用和生物
6、指示作用 6。据此本研究采用采用三质粒表达系统即pGC-LV载体、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体来构建慢病毒载体，建立microRNA-9-1增强体外模型，并探讨其在MSCs诱导分化为神经细胞中的作用。2 MicroRNA-9 在 MSCs 向神经细胞分化中的作用MicroRNA 可以作为发育开关以及微调发育程序来调控生物体内多种发育过程 7。MicroRNA-9 是脑组织特异表达的一种小 RNA，它在小鼠胚胎干细胞和肿瘤细胞的分化中其重要调控作用 8。研究发现，microRNA-9 在神经干细胞向神经元分化过程中起重要调控作用 9，通过影响转录激活因子 STAT3 信
7、号通路来促进神经分化 5。通过 Fgf 信号通路调控中脑后脑交接区（midbrain-hindbrain boundary，MHB）的组织活性 10。 Krichevsky 等 4研究发现在胚胎发育的第 5 阶段 microRNA-9/9*表达较高，此阶段是神经元前体向神经元和胶质细胞分化的关键时期，抑制神经前体细胞中 microRNA-9 表达可使神经元数量减少 29% - 31%。 MicroRNA-9 调控着由胚胎干细胞衍生来的神经祖细胞的增殖和迁移，由其直接调控的一个靶基因可以编码一种 19 kD 的磷酸蛋白 stathmin，该蛋白特异性在神经祖细胞上表达，可以增加微观的不稳定性，从
8、而促进细胞定向迁移 11,12。本研究发现感染 microRNA-9-1 慢病毒载体的 MSCs 向神经细胞分化效率增加，考虑可能和 microRNA-9 的上述作用有关。MSCs 是一种成体干细胞，可以向骨、软骨、脂肪等多种组织分化，研究发现其可以向神经细胞分化 13,14。与神经干细胞定向分化所不同，MSCs 分化为神经细胞是一种横向分化方式，其调控因子目前了解较少。Greco 等 3发现在人 MSCs 分化为神经细胞过程中，microRNA 在其中起着重要调控作用。但与神经干细胞分化机制是否相同，microRNA-9 是否参与分化过程尚未见报道。本研究首次采用感染 microRNA9-1
9、 慢病毒载体，构建microRNA-9-1 增强模型，观察其在 MSCs 诱导分化中的作用。本研究发现，microRNA-9-1慢病毒载体可高效感染小鼠 MSCs，感染后报告基因 GFP 可稳定表达。本研究 MTT 结果发现，感染 microRNA-9-1 慢病毒后，MSCs 存活率下降，但感染仅含有报告基因的慢病毒载体后 MSCs 存活率变化不大，表明 microRNA-9 在 MSCs 保持细胞自我更新、分裂、凋亡等生理功能中起到一定作用。本研究发现，与未感染和感染仅含有 GFP 的慢病毒的 MSCs 相比感染 microRNA9-1 慢病毒后，MSCs 向神经细胞分化效率显著提高，神经细
10、胞早、中期标志物 NSE 和成熟神经细胞特异性标志物 MAP-2 表达均明显增高，且未见 GFAP 表达。这提示 microRNA-9-1 可能在 MSCs 横向分化神经细胞中起作用，提高 microRNA-9-1 的表达，可以促进 MSCs 向神经8细胞分化。单独感染 microRNA-9-1 慢病毒并不能使 MSCs 向神经细胞分化，还必须在诱导剂（-巯基乙醇等）的作用下才能分化。这说明 microRNA9-1 在 MSCs 在横向分化为神经细胞过程中不是唯一的，可能是对一些信号途径调控，如 Notch 信号途径 15，从而提高诱导效率。但是具体机制尚不明确。综上所述，本研究采用慢病毒感染
11、技术，建立 microRNA-9-1 过表达细胞模型，从而促进 MSCs 向神经细胞的分化效率，提示 microRNA-9-1 在 MSCs 诱导分化为神经细胞过程中可能起促进作用。参考文献1 Lagos-Quintana M, Rauhut R, Yalcin A, et al. Identification of tissue-specific microRNAs from mouseJ. Curr Biol, 2002, 12 (9):735-739.2 原清涛 , 邓宇斌, 李树浓. 骨髓间质干细胞诱导分化为神经元及其应用的研究进展J. 中国病理生理杂志, 2004, 20(11):2
12、139-2142.3 Greco SJ, Rameshwar P. MicroRNAs regulate synthesis of the neurotransmitter substance P in human mesenchymal stem cell-derived neuronal cellsJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104 (39):15484-15489.4 Krichevsky AM, Sonntaq KC, Isacson O, et al. Specific microRNAs modulate embryonic stem ce
13、ll-derived neurogenesisJ. Stem Cells, 2006, 24 (4):857-864.5 Simmons A, Whitehead RP, Kolokoltsov AA, et al. Use of recombinant lentivirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus glycoprotein G for efficient generation of human anti-cancer chimeric T cells by transduction of human peripheral blo
14、od lymphocytes in vitroJ. Virol J, 2006, 3:8.6 Ko MH, Kim S, Hwang do W, et al. Bioimaging of the unbalanced expression of microRNA9 and microRNA9* during the neuronal differentiation of P19 cellsJ. FEBS J, 2008, 275 (10):2605-2616.7 Krol J, Loedige I, Filipowicz W. The widespread regulation of micr
15、oRNA biogenesis, function and decay J. Nat Rev Genet, 2010, 11 (9):597-610.8 Delaloy C, Gao FB. microRNA-9 multitasking near organizing centersJ. Nat Neurosci, 2008, 11 (6):625-626.9 Conaco C, Otto S, Han JJ, Mandel G. Reciprocal actions of REST and a microRNA promote 9neuronal identityJ. Proc Natl
16、Acad Sci U S A, 2006, 103 (7):24222427.10 Leucht C, Stiqloher C, Wizenmann A, et al. MicroRNA-9 directs late organizer activity of the midbrain-hindbrain boundaryJ. Nat Neurosci, 2008, 11 (6):641-648. 11 Delaloy C, Liu L, Lee JA, et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human emb
17、ryonic stem cell-derived neural progenitorsJ. Cell Stem Cell, 2010, 6 (4):323-335.12 Nobuko U. microRNA-9 controls a migratory mechanism in human neural progenitor cellsJ. Cell Stem Cell, 2010, 6 (4):294-296.13 Cho KJ, Trzaska KA, Greco SJ, et al. Neurons derived from human mesenchymal stem cells sh
18、ow synaptic transmission and can be induced to produce the neurotransmitter substance P by interleukin-1J. Stem cells, 2005, 23 (3):383-391.14 施雪英 , 陈先文, 胡慧敏, 等. 三七总皂苷和维甲酸联合诱导大鼠 MSCs 分化为神经元样细胞J. 中国病理生理杂志 , 2007, 23(3):612-613.15 Wang Z, Li Y, Kong D, et al. Cross-talk between miRNA and Notch signali
19、ng pathways in tumor development and progressionJ. Cancer Lett, 2010, 292 (2):141-148.10Figure 1. PCR results for constructed microRNA-9-1-LV vector. A: enzyme-digested product. 1: marker; 2: the pFU-GW-RNAi plasmid without digestion; 3: the pFU-GW-RNAI plasmid digested by Xba I and Hpa I. B: PCR for cloned target gene. 1: the group with ddH2O; 2: the group with empty vector; 3: the group with GAPDH; 4: marker; 5-12: the groups with transformants of microRNA-9-1.图 1 慢病毒载体构建 PCR 结果
