1、基因工程复习题 绪论 基因工程： 按照人们的的愿望，进行严密的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种在较短时间内趋于完善，创造出更符合人们需求的心的生物类型，这就是基因工程。又称重组 DNA 技术或遗传工程 基因工程的操作步骤可简单概括为： 分、切、接、转、筛、增 基因工程特点： 在分子水平表达和细胞水平操作表达 构建克隆载体是基因工程技术路线 中的核心环节 基因工程工具酶 指体外进行 DNA 合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需的酶，包括 DNA 聚合酶、限制性核酸内切酶、修饰酶和连接酶 。限制性核酸内切酶和连接酶是基因工程关键的工具酶。现在常用的
2、DNA 连接酶只有 2 种，即大肠杆菌 DNA 连接酶和 T4DNA 连接酶 现代分子生物学领域理论上 三大发现 和 三大发明 对基因工程的诞生起决定作用： 三大发现： （ 1） DNA 是遗传物质（ 2）揭示了 DNA 分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理（ 3）遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定 三大发明： （ 1）限制性核酸内切酶的发现与 DNA 切割（ 2） DNA 连接酶的发现与 DNA 片段的连接（ 3） DNA 重组基因工程载体的研究与应用 实验中为什幺要筛选白斑，即原理是什么？ 有外源 DNA 片段插入到位于 lacZ的多克隆位点后，就会破坏肽链的读码框，从而不能形成有功能
3、活性的半乳糖苷酶，因此含有重组质粒的克隆往往是白色菌落 DNA重组试验中为什么用 IPTG 不用乳糖？ 因为培养基中的乳糖会被诱导合成的 半乳糖苷酶所催化降解，从而使其浓度不断发生变化。常用异丙基 硫代半乳糖苷（ IPTG）、硫甲基半乳糖苷 (TMG) 第一章 核酸的制备 知识点： 生物体内的 DNA 绝大部分 是 B-DNA形式存在 ，（ A、 B、 Z-DNA） 如何获得 完整的 DNA分子或大的 DNA片段 ，是 DNA 制备中的一项 关键技术。 每一 种生物 DNA 的复制总是从特定位点起始，这个位点具有一点的核苷酸序列。将此核苷酸序列区称为 复制起始位点 DNA 的转录应包含 转录启
4、动子 和 转录区 -1 +1 +2 +1 处为 起录点。 在 原核生物结构基因 的起录点下游不远处，总有一个 5 AGGAGG 3的序列，转录出 mRNA 上的 5 AGGAGG 3序列，与核糖 30s 亚基 16srRNA3端是 5 CCUCCU 3互补成为 30s 亚基识别和结合 mRNA 的位点，把此序列称为 SD序列。 真核生物基因转录区部不有 SD 序列的互补序列 几乎所有 真核生物 的染色体 DNA都是线形 DNA,部分原核生物的染色体 DNA 也是以线形存在的。而大部分 原核生物 的染色体 DNA 和全部线粒体 DNA、叶绿体 DNA 以及细菌的质粒 DNA 全是 环状 DNA分
5、子。 环状 DNA 分子一般以 超螺旋形式 即 ccc-DNA， DNA 一条链的一个磷酸时为 开环 DNA 分子（ oc-DNA） DNA 两条链中相对应的两个磷酸二酯键同时断开时为线形 DNA（ l-DNA） 拷贝数： 指某目的基因在某一生物群体或个体中存在的个数 . 单拷贝就是该基因在基因组中只有一个 ,多则指有多个。 不 同构型质粒 DNA 电泳图 核 酸分离纯化是原则： a 保持核酸分子以及结构的完整性 b 防止核酸的生物降解 核 酸分离纯化的一般程序： 材料的选择与预处理破碎细胞与提取分离纯化 DNA纯化 最常用的方法是乙醇沉淀（同时含有 Na 离子）、 DNA 沉淀可用玻璃棒挑或
6、者离心沉淀 DNA 凝胶电泳的影响因素：带电颗粒的物理性状，支持物介质，电泳强度，缓冲液离子强度 凝胶染色 ： EB 液 /SYBR Green /Goldview 核酸分子杂交技术基本原理： 具有一定同源性的两条核酸（ DNA 或 RNA）单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原 则高度特意地复性成双链 DNA的化学降解测序： 经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影检测后可以读出待测 DNA 分子的碱基序列（ 5 3） DNA序列的读取是逆电泳方向进行的 Sanger 双脱氧链终止法读取 的碱基序列是待测 DNA 模板的互补链，而非模板链本身 DNA纯化过程中的缺点： 加剧 DNA
7、的丢失和损伤的可能性。 Sanger 中载体的存在不但不会影响测序的结果，反而有利于测序的进行，因为在实际操作中，引物往往不得与待测 DNA 的 3端互补，而是与载体克隆位点的两侧序列互补，这样可以测定完整的 DNA 序列 T DNA D DNA oc DNA l DNA ccc DNA DNA测序 通常包 括克隆、测序反应和读序三个步骤， 1、 DNA 的分离与抽提：方法； 1.酚 氯仿抽提法 使用酚的优点： 1. 有效变性蛋白质； 2. 抑制了 DNase 的降解作用。 用酚氯仿抽提细胞基因组 DNA时，通常要在酚 -氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 1.减少 蛋白质变性操作过程中产生的 气泡
8、 。 2.异戊醇有 助于分相 ，使离心后的上层含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定 2.盐析法 3.氯化铯密度梯度离心法 4.固相萃取法 2、 DNA 提取常见问题，原因分析及其对策 问题一 ： DNA 样品不纯，抑制后续酶解和 PCR反应。 原因 ： 1.DNA 中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 2.DNA 在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 3.DNA 中残留有金属离子 对策 ： 1.重新纯化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前） 2.重新沉淀 DNA，让酒精充分挥发 3.增加 70乙醇洗涤的次数（ 2-3 次） 问题二 ： DNA 降解。 原因
9、： 1.材料不新鲜或反复冻融 2.未很好抑制内源核酸酶的活性 3.提取过程操作过于剧烈， DNA 被机械打断 4.外源核酸酶污染 5.反复冻融 对策 ： 1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 2.液氮研磨或匀浆组织后 ，应在解冻前加入裂解缓冲液 3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的 DNA 时，可增加裂解液中螯合剂的含量 4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 6.将 DNA 分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 问题三 ： DNA 提取量少。 原因 ： 1.实验材料不佳或量少 2.破壁或裂解不充分 3.沉淀不完全 4.洗涤时 DNA 丢失 对策 ：
10、1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 2.动植物要匀浆研磨充分； G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加 PK 的用量） 4.低温沉淀，延长沉淀时间 5.加辅助物，促进沉淀 6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒 3、 p63 猪肝脏总 RNA 的提取？ RNA 提取常见问题，原因分析及其对策 猪肝脏总 RNA 的提取： 一、准备试剂： 氯仿，异丙醇， 75乙醇，无 RNase 的水或 0.5SDS（溶液均需用 DEPC 处理过的水配制）。 二、操作步骤： 1. 匀浆处理：将组织在液氮中磨碎，每 50-100mg 组织加入 1ml TRI
11、zol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过 TRIzol体积 10。 2. 将匀浆样品在室温（ 15-30 ）放置 5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。 3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于 2-8 10000g离心 10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量 DNA，上清中含有 RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。 5. 每使用 1ml TRIzol 加入 0.2ml 氯仿，剧烈振荡 15 秒，室温放置 3 分钟。 6. 2-8 10000g离心 15 分钟。样品分为三层：底层为
12、黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。 RNA 主要在水相 中，水相体积约为所用 TRIzol 试剂的 60。 7. 把水相转移到新管中，如要分离 DNA 和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的 RNA。每使用 1ml TRIzol 加入 0.5ml 异丙醇，室温放置 10 分钟。 8. 2-8 10000g离心 10 分钟，离心前看不出 RNA 沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 9. 用 75乙醇洗涤 RNA 沉淀。每使用 1ml TRIzol 至少加 1ml 75乙醇。 2-8 不超过 7500g 离心 5分钟，弃上清。 10. 室温放置干燥或真空抽干
13、 RNA 沉淀，大约 晾 5-10分钟即可 .不要真空离心干燥，过于干燥会导致 RNA 的溶解性大大降低。加入 25-200l 无 RNase 的水或 0.5SDS，用枪头吸打几次， 55-60 放置 10分钟使 RNA溶解 .如 RNA 用于酶切反应，勿使用SDS 溶液。 RNA 也可用 100的去离子甲酰胺溶解， -70 保存。 问题一： RNA 的降解 （ 1）新鲜细胞或组织的 RNA 降解 RNA 降解： 1.裂解液的质量 2.外源 RNase 的污染 3.裂解液的用量不足 ； 4.组织裂解不充分 5.另外某些富含内源酶的样品 (如脾脏，胸腺等 )，很难避免 RNA 的降解。建议在 液
14、氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 （ 2）冷冻样品的 RNA 降解 1.样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至 -70冰箱保存。样品要相对小一点； 2.先用液氮研磨，再加裂解液匀浆； 3.样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。 问题二： OD260 /OD280 比值偏低 （ 1）蛋白质污染；（ 2）苯酚残留；（ 3）抽提试剂残留；（ 4）设备限制。 问题三：电泳带型异常 （ 1）非变性电泳 ： 上样量超过 3ug，电压超过 6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致 28S 和 18S 条带分不开。 （ 2）变性电泳条带变淡 ： EB 与单
15、链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些； （ 3） 甲醛的质量不高 问题四：下游实验效果不佳 （ 1） RNA 降解 ；（ 2）抽提试剂的残留 ；（ 3） 样品中杂质的残留 ；（ 4） DNA 污染 。 4、已知单链 RNA的序列，分别用 sanger 和化学裂解法测定其序列，写出操作过程。？ Sanger 双脱氧链终止法： 原理： DNA 复制是以一条链为模板，按碱基配对原则复制 新合成的链 复制可以在体外进行 2和 3双脱氧的 ddNTP 会使复制终止（双脱氧链终止） DNA聚合酶能够利用单链 DNA作模板，合成出对应的 DNA互补链，但在反应过程中，如果 2，
16、 3 双脱氧链核苷酸三磷酸底物掺入到寡核苷酸链的 3端， DNA链的延伸反应即被终止。在 4 个反应体系中分别加入一种 ddNTP 反应底物（ ddCTP、ddATP、 ddGTP、 ddTTP）以及 DNA 模板、合成引物、 DNA聚合酶、一定浓度是 dNTP（ dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTP，其中有一种是带 32P 放射性标记的），使 DNA链的合成随机终止于某一特定 ddNTP。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳和放射自显影技术读出待测 DNA模板的碱基序列。 步骤： 1.分离待测核酸模板 2.在 4只试管中加入适当的引物、模板、 4种 dNTP(包括放射性标记 dATP，例如
17、?32 PdATP 和 DNA 聚合酶（如以 RNA 为模板，则用反转录酶），再在上述 4只管中分别加入一种一定浓度的 ddNTP(双脱氧核苷酸 )。 3.与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理 )结合的引物，在 DNA 聚合酶作用下从 5端向 3端进行延伸反应， 32P 随着引物延长掺入到新合成链中。当 ddNTP 掺入时，由于它在 3位置没有羟基，故不与下一个 dNTP 结合 ，从而使链延伸终止。 ddNTP 在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的 DNA链。 4.用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离 4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种 ddNTP(如 ddATP)，则该
18、管中各种长度的 DNA 都终止于该种碱基 (如 A)处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的 DNA 3 末端都为同一种双脱氧碱基。 5.放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中 DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。 Sanger 双脱氧链终止法的技术要点 制备单链 DNA 模板，即待测序的 DNA 链 制备 一小段模板链 特殊的 DNA 多聚酶 制备 2和 3双脱氧的 ddNTP 化学降解法测序： （ 1） 待测模版 DNA分子的制备：一般用限制性内切核酸酶将待测 DNA分子切割成 250300bp 的片段，然后用碱性磷酸酶除去 DNA片段 5端的磷酸根，最后用 T4 多核苷
19、酸激酶和 r32PATP，使 DNA 片段的 5端带上放射性核酸标记。 （ 2） 化学降解待测模版的 DNA 分子：纯化并碱变性待测 DNA 片段，回收其中的一条单链，分装在 4 支试管中进行上述 4组特异性切割反应。 4组反应分别产生大小不同且具有共同标记末端的寡核苷酸片段混合物。 （ 3） 待测模版 DNA分子的序列分析：通过聚丙烯酰胶凝胶电泳将上述 4组反应的寡核苷酸片段进行分离，经放射自显影后即可从 X光片上读出 DNA 序列。 5、 P87 实验设计： DNA 片段之间的连接 答： 如 平末端的连接： 直接用 T4DNA 连接酶 先用末端脱氧核苷酸转移酶给平末端 DNA 分子加上 P
20、olydA polyT 尾巴后，再用 DNA 连接 用衔接物连接平末端 DNA 分子 DNA接头连接法 DNA 序列测定法： DNA 的化学降解测序法 1、 不对称粘性末端： 两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率；载体与外源 DNA 连 接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源 DNA 可以定向插入到载体中。 2、 对称性粘性末端； 线形载体 DNA 常需磷酸酶脱磷处理；载体与外源 DNA 连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源 DNA 的串联拷贝；外源 DNA 会以两个方向插入到载体中。 6、在进行 DNA 重组研究时，如何防止 DNA酶的污染。 1. 所有的玻
21、璃器皿均应在使用前于 180的高温下干烤 6hr 或更长时间。 2. 塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用） 3. 有机 玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在 3% H2O2 室温 10min，然后用 0.1% DEPC 水冲洗，晾干。 4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC，在 37处理 12hr 以上。然后用高压灭菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经 0.22 m滤膜过滤除菌。 5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤
22、换。 6. 设置专用实验室，所有器械等应为专用。 7、核酸纯度与浓度分析 纯度：纯净核酸： OD260/OD280 1.7-2.0 OD260/OD230 2.0 有蛋白质或酚污染 OD260/OD280 1.7 有 RNA 污染或 DNA 降解 OD260/OD280 2.0 或 OD260/OD230 2.0 浓度：若 OD260 1 时， dsDNA 浓度约为 50 g /ml 则 质粒 DNA 浓度 ( g/ l )=稀释倍数 OD260 50 第二章 基因工程工具酶 大肠杆菌可具有 4 种表型： R+KM +K 野生型，具有完整的限制和修饰功能 R- KM +K 限制缺陷型，不能降解
23、外源 DNA，但具有修饰功能这类突变株常用于转化实验 R- KM -K 限制和修饰缺陷型，既无限制功能又无修饰功能，常用于转化实验 R+KM -K 修饰缺陷型，缺乏修饰自身 DNA 的功能 限制性核酸内切酶的特点 识别 DNA 分子中 4 8 个碱基的特定序列 呈旋转对称 ,回文结构 切割位点用或 /表示 识别序列在内部、两侧 限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA 中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二脂键断开的内脱氧核苷酸酶 目前发现有限制性核酸内切酶的生物主要是细菌、少数霉菌和蓝藻 限制性核酸内切酶可分为型、型、型酶 限制性核酸内切酶在双链 DNA 上能够识别的特殊核苷 酸序列被称为
24、识别序列。 同裂酶： 来源不同，具有相同的识别序列。同裂酶可以具有不同的或相同的切割位点 同尾酶： 识别序列不同，切割 DNA分子所得的 DNA片段具有相同的黏性末端 对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样切割的结果产生的 DNA 片段称为 黏性末端。 DNA 片段末端的 3端比 5端长称为 3粘性末端， DNA片段末端的 3端比 5端短称为 5粘性末端。 两条多聚核苷酸链上磷酸二脂键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的 DNA 片段是平齐的称为 平末端 DNA分子片段化方法 单酶切 DNA 样 品是环状，完全酶切后产生于识别序列数（ n）相同的 DNA 片段数，并且 D
25、NA 片段的两末端相同 双酶切 环状 DNA 分子完全酶切的结果，产生的 DNA 片段数是两种限制性核酸内切酶序列数之和；线性 DNA 分子，产生的 DNA 片段数是两种限制性核酸内切酶序列数之和 +1。 先较低盐浓度缓冲液的酶进行切割后较高盐浓度缓冲液的酶进行切割；先用最适反应温度较低的酶进行酶切后用较高最适反应温度的酶进行酶切 部分酶切 选用的限制性核酸内切酶对其在 DNA 分子上的全部识别序列进行不完全的切割。原因有底物 DNA 的初读低、识别序列的甲基 化、酶用量的不足以及反应缓冲液和温度不适宜等。 大肠杆菌 DNA连接酶 催化双链 DNA片段互补黏性末端之间连接 ; T4DNA 连接
26、酶 不仅可以催化双链 DNA 片段互补黏性末端之间连接，还可以催化双链 DNA 片段平末端之间连接。 大肠杆菌 DNA 连接酶反应系统中 辅助因子 NAD； T4DNA 连接酶反应系统中 辅助因子 ATP T4-DNA连接酶作用 修复双链 DNA 的单连缺口 连接 DNA DNA 杂交双链上的 DNA 链缺口或 RNA 链缺口，后者反应速度慢 连接完全断开的两个平头双链 DNA 分子，属分子间连接，但速度慢，在高浓度的底物和酶 的作用下方可进行 DNA连接酶的特点： 能催化外源 DNA和载体分子之间连接形成重组 DNA 分子。 DNA 片段连接前后识别序列的变化 碱性磷酸酶的作用： 去除 5
27、磷酸基团，防止自身连接环化，把 5 P 5 OH 影响 DNA连接酶作用的影响： 反应温度、 T4DNA 连接酶的用量、提高外源片段与载体的浓度比值（ 10-20 倍） DNA聚合酶 大肠杆菌 DNA 聚合酶 5 3聚合酶活性 3 5 外切酶活性 5 3外切酶活性 ,其中 5 3聚合酶活性和 5 3外切酶活性有修复功能 ,制作探针 大肠杆菌 DNA 聚合酶大片 段 (klenowDNA 聚合酶 )枯草芽孢杆菌蛋白酶裂解得到 ,该酶失去了全酶 5 3外切酶活性 ,具有 5 3聚合酶活性 3 5 外切酶活性 耐高温 DNA 聚合酶 ,主要用于多聚酶链式反应 (PCR) 反转录酶即依赖于 RNA的
28、DNA 聚合酶 , 5 3聚合酶活性 (cDNA 合成方向 5 3)RNaseH的活性 (3 5RNA 外切酶活性 5 3RNA 外切酶活性 ) 不同组织、不同发育阶段的 CDNA 文库是有所差异的（ ） 一般而言，没有 原核 生物 cDNA 文库， cDNA 文库构建 检测 mRNA 完整性 1、回文结构： 知 识点： 短的回文结构可能是一种特别的信号，如 限制性内切酶 II 的识别位点 （旋转对称） 。较长的回文结构容易转化成 发夹结构 。 回文结构（基数核苷酸）（切下来都是黏性末端。 2、 星号活性： p46 某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶 在酶切同一种 DNA 片段时会产
29、生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性则称星号活性。 导致 Star 活性 产生原因： (1)高甘油含量 (2)限制性内切核酸酶用量过高 (3)低离子强度 (4)高 pH (5)含有有机溶剂 (6)有非 Mg2+的二价阳离子 存在 3、提高平末端 DNA 片段连接效率的方法？ DNA 片段末端同聚物加尾后进行连接 粘性末端修饰成平末端后进行连接 DNA 片段 5端脱磷酸化作用后连接 DNA 片段加连杆或衔接头后连接 4、 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I具有 5 -3 DNA 聚合酶活性、 5 -3外切核酸酶活性、 3 -5外切核酸酶活性 5、逆转录酶具有 RNA 指导的 DNA聚合酶活性、
30、RNaseH 活性、 DNA 指导的 DNA 聚合酶活性。商品化逆转录酶（ AMV AMV 反转录酶（鸟类骨髓细胞性白血病病毒） M MLV 反转录酶（ Moloney 鼠白血病病毒） 6、 p95 为了从生物材料中高效提取 RNA，如何控制 RNA 酶活性，消除 RNA 酶的降解活性？ （一）消除生物材料内源性 RNA 酶的干扰。主要是在组织细胞裂解液中介入 RNA 酶抑制剂和变性剂，如异硫氰酸胍、盐酸胍、尿素。由于 RNA 酶活性的最适 PH接近中性，因此组织细胞裂解液的 PH 偏碱性或偏酸性可部分抑制 RNA酶的活性。 （二）消除制备 RNA 过程中外源性 RNA 酶的干扰，可采取以下措
31、施：对于制备 RNA 所用的试剂，一般应该用 0.1%DEPG 处理过的水配制，在 37处理 12 小时以上，然后高压灭菌并除去残留的 DEPG。对于玻璃器皿用 180干烤 3 小时以上；对于塑料器皿，用氯仿充分冲洗。制备 RNA 的过程在超净工作台中进行。在制备 RNA 时操作者应戴口罩和一次性手套，且勤换手套。 7、 p66 限制性内切核酸酶的作用机制？ 限制性内切核酸酶以环状和线性的双链 DNA 为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的 氢键也随之断开，产生具有 3 -羟基和 5 -磷酸基的 DNA 片段。 8、 DN
32、A 连接酶有哪些连接方法？ 一、具互补粘性末端片段之间的连接二、具平末端 DNA 片段之间的连接三、 DNA 片段末端修饰后进行连接 9、哪些工具酶可用于制备带标记的 DNA 分子（探针）？ 大肠杆菌 DNA 聚合酶 I klenow 酶 T4-DNA 聚合酶 反转录酶 第三章 基因克隆载体 知识点 pSC101、 9.09kb 第一个 成功 用于基因克隆 实验的 天然质粒， 低拷贝型。 colE1（大肠杆菌 E1）高拷贝型 拷贝 数： 一个细胞内这种质粒的数量与染色体的数量之比 质粒还提供复制起始位点和决定复制强度（拷贝数）的一些基因。拷贝数少的（只有 1 数个拷贝）质粒称为 严紧型质粒 ；
33、拷贝数多的（ 10 个以上拷贝）质粒称为 松弛型质粒。 不亲和性质粒（不相容性质粒）： 不能在同一宿主细胞中共存的质粒。 亲和性质粒： 能在同一宿主细胞中共存的不同质粒。 质粒载体的三种共同组分： 复制起点、筛选标记、克隆位点（ 填空 ） 一般人工构建的质粒是单复制子（ 是非 ） 噬菌体在 E.coli 固体、液体培养基中生长不同： 液体：培养物由浑浊变为澄清 固体： 37过夜培养形成一个透明的斑点（噬菌斑） 原因： 一个噬菌斑中的上百万个噬菌体颗粒均由一个噬菌体无性繁殖所产生 噬菌体的主要类型： 插入型（只有一个限制酶切位点可使之插入）、取代型（两个酶切位点）体外重组类型：置换型、插入型 2
34、 个相同的质粒载体可以在同一噬菌体中存在（ ） 由于 cosmid 克隆载体不含噬菌体溶菌生长途径，溶源生长途径和 DNA 复制系统，所以不会产生子代噬菌体，不能通过溶菌周期（ 是非 ） 外源片断克隆在 cosmid 载体中是以大肠杆菌的形式表现出来，而不是噬菌斑（与质粒不同）（ 是非 ） 1、 克隆载体 功 能： 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制功能或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件。 具备条件： 1.具有针对受体细胞的亲缘性和亲和性 2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点 3.具有较高的外源 DNA 装载能力4.具有多种单一的限制性内切酶识别、切割位点
35、5.具有合适的帅选标记 一般特性： 1.对受体细胞的可转移性 2.自主复制功能 3.显著的帅选标记 4.特定的多克隆位点 5.安全性 3、蓝白斑筛选原理（重点） 重组质粒转化宿主细胞后还需对转化菌进行筛选鉴定。利用 互补现象 进行筛选是最常用的一种鉴定方 法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其编码肽链的 DNA 序列，此称 lacZ基因。 LacZ基因编码的肽链是半乳糖苷酶的氨基端的短片段（ 146 个氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的半乳糖苷酶分子。 LacZ基因编码肽链与失去正常氨基端半乳糖苷酶的突变体互
36、补，这种现象称为互补。由互补而形成的有功能活性的半乳糖苷酶，可以用 Xgal（ 5-溴 -4 氯 -3-吲哚 - -D-半乳糖苷）显色测定出来，它能将无色化合物 Xgal 切割成半乳糖和深蓝色的底物 5-溴 -4 靛蓝，因此，任何携带着 lacZ基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种半乳糖苷酶突变体的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在 IPTG(异丙基硫代 -D-半乳糖苷 )诱导后，在含有 Xgal 的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源 DNA 片段插入到位于 lacZ的多克隆位点后，就会破坏肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的半乳糖苷酶相互补的活性肽，而导致不能
37、形成有功能活性的半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。 （ 1） X-gal（ 2） -半乳糖苷酶（可分解 X-gal、从无色变成蓝色）（ 3） lacZ 的 -肽互补（ 4） IPTG 诱导（ lacZ 的 C 端部分和 -肽互补基因都表达） Mcs 有插入蓝斑，无插入白斑 全部都是白斑的原因： 菌落、载体本身受到污染 4、 质粒载体改造构建的指导思想 构建质粒载体一般原则 删除不必要的 DNA 区域 ,提高外源基因的装载量 灭活某些质粒的编码基因及对质量复制产生负调控效应的基因 (提高拷贝数 ) 加入易于识别的选择标记基因 ,检测含有重组质粒的受体细胞。 在选择标记基因内引
38、入具有多克隆街头 ,删除重复的酶切位点 ,使其 单一化 根据外源基因克隆的不同要求 ,分别加装特殊的基因表达调控元件 5、常用的质粒载体类型 （ 1）克隆质粒载体（ 2）质粒载体（大肠杆菌表达型质粒载体、融合型蛋白表达载体 pGEX-3X、非融合型蛋白表达载体 pkk223-3、穿梭质粒载体） 穿梭质粒载体是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以再两种不同的宿主细胞中存活和复制是质粒载体（ 是非 ） 6、噬菌体的克隆步骤： （ 1）通过裂解过程增殖载体（ -DNA 感染 E.coli 提取）由浑浊斑变成澄清（液体培养基）（ 2）载体与外源 DNA 的酶切（ 3）外源 DNA
39、与载体的连接（ 4）重组噬菌体的体外包装（ 5）包装噬菌体颗粒的感染（ 6）筛选 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包转序列，复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体 7、野生型噬菌体的局限性 (1) 结构 -DNA 基因组大而且复杂，具有许多基因克隆常用的限制性酶识别 （ 2）噬菌体外壳只能接纳一定长度的 DNA 分子。 8、噬菌体的构建基本策略 （ 1） 缩短野生型的 -DNA 长度，提高外源 DNA 的有效装载量，根据切除的多少可将 -DNA 分成两大类载体：插入型载体（一个限制酶切位点），取代型载 体（ 2 个限制酶切位点） （ 2） 删除重复是酶切位点，引入单一的多
40、酶切位点街头序列，增加外源 DNA 克隆的可操作性 （ 3） 灭活某些与裂解周期有关基因，使 -DNA 载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的生物污染现象的发生 （ 4） 引入合适的选择标记基因，便于重组噬菌体的检测 （ 5） 建立重组 -DNA 分子体外包装系统 9、 Cosmid 克隆载体（黏性载体 /克斯质粒载体）： 是一类由人工构建的含有 DNA 的 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体 （ 1） Cosmid 克隆载体结合了质粒克隆载体和噬菌体克隆载体的优点，克隆能力： 31-45kb （ 2） Cosmid 克隆载体三部分：质粒复制起点、抗性标记、 c
41、os 位点 （ 3） Cosmid 克隆载体的 特征： 具有噬菌体的特性具有质粒载体的特性具有高装载能力 10、表达载体构建的一般原则 1 阅读框架与外源基因高效表达 2 启动子与外源基因高效表达 （ 1）外源基因在宿主细胞中的有效表达是基因工程的核心问题（ 2）外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤 （ 3）转录起始的速率是基因表带的限速步骤 诱导型表达载体是指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体 3 转录的 有效延伸和终止与外源基因的高效表达 （ 1）除去衰减子 （ 2）插入抗终止的序列 （ 3）强转录终止序列 4 有效的翻译起始与外源基因高效表达 5 终止
42、密码选择与外源基因高效表达 6 外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达 载体： 原核生物基因克隆载体（细菌质粒载体、噬菌体克隆载体、 Cosmid 克隆载体、 M13 噬菌体载体 ）、酵母基因克隆载体、植物基因克隆载体、人工染色体载体 11、四种常用载体的比较（ 细菌质粒载体、噬菌体克隆载体、 Cosmid 克隆载体、 M13 噬菌体载体 ） 第四章：目的基因的分离与修饰 目的基因的基 本分离制备法 p169： 直接分离法、基因文库分离法、 PCR 扩增法、差示分析法、 DNA 插入诱变法、基因定位克隆、标签测序法、化学合成法。 1、目的基因的制备直接分离法 1 限制性核酸内切酶酶切分离法：单酶切
43、、双酶切、部分酶切 2 基因分离的物理化学法：密度梯度离心法、单链酶解法、分子杂交法 3 双抗体免疫分离编码蛋白的基因 4 利用酶促反转录法直接从特定 mRNA 分离基因 2、基因组文库与 cDNA 文库的主要区别：（重点） 基因组文库克隆的任何基因； cDNA 文库克隆的具有蛋白质产物的结构基因， 基因组文库中的编码的 是真实基因， cDNA 克隆的是不含内含子的基因。 基因组文库克隆的全部遗传信息，不受时空限制； cDNA 文库克隆的是不完全编码的 DNA 序列，受发育和调控因子的影响即受时空限制。 从基因组文库中分离得到的基因片段很难直接用于体外的表达研究。但是它们对真核细胞基因结构的分
44、析、基因表达和调控的研究有着重要作用。 cDNA 文库中筛选分离的目的基因可直接用于表达， cDNA 基因文库不能直接用于基因组 DNA 中的非转录区段的序列研究以及基因编码区外侧控序列的结构基因结构、组织和表达的强有力手段。 3、建库步骤： 基因组 DNA DNA 插入片段 重组 DNA 转化宿主 文库扩增、保存 筛选 mRNA cDNA 载体 DNA 4、噬菌体 cDNA 文库的构建 总 RNA 的分离 总 RNA 的纯化 cDNA 第一链的合成 第二链的合成（方法 p181） 甲基化 加衔接头 载体连接 噬菌体的包装导入 噬菌斑原位杂交 利用聚合酶链式反应（ PCR）技术扩增目的基因 原
45、理：利用聚合酶链式反应（ PCR）技术，在体外特异性扩增某个基因 模板 DNA 变性 引物与 DNA 模板复性 DNA 延伸 PCR 过程： 反应系统加热至 90-95，底物双链 DNA 变性称为两条单链 DNA，作为互补链聚合反应的模板； 降温至 37-60，使两种引物分别与模板 DNA 链的 3一侧的互补序列杂交（复性）； 升温至 70-75，耐热性 DNA 聚合酶催化引物按 5 3方向延伸，合成模板 DNA 链的互补链。在退火下 1min， 引物优先与 DNA 模板复性。 PCR 特点 特异性高 敏感性高：需要的模板量极低，理论上一条模板链 快速： 2-3h 简便：对模板纯度要求低，不需
46、要纯化甚至可直接用细菌 可扩展 mRNA）（反转录） 影响 PCR 的因素： TapDNA 聚合酶、其他耐热 DNA 聚合酶、引物、模板、 dNTP、 Mg离子浓度 引物是人工合成的单链 DNA 小片段，碱基顺序分别与所要扩增的 DNA 双链的 5端相同， 3端序列互补。引物的 3端决定引物的特异性 ， 3端与模板 DNA 一定要配对；引物的 5端决定了 PCR 产物的长度 ，它对扩增特 异性影响不大，因此 5端碱基并没有严格的限制。在 PCR 扩增中，对于引物来说，只要其 3端的序列有足够长度来启动延伸，而 5端含有不匹配的序列，并不影响正常的扩增。 引物 5端修饰：加酶切位点，引入突变位点
47、，插入与缺失突变序列引入启动子序列 PCR 产物积累规律示意图（笔记） PCR 的相关技术 反转录 PCR（ RT-PCR）：是将 mRNA 反转录与 PCR 技术相偶联的一种基因分离技术 已知 DNA 序列的 PCR 扩增（各种方法概念比较） （ 1） 套式 PCR 是指用两对引物扩增同一样品的方法。 （ 2） 多重 PCR 是指利用多对引物同时扩增模板上 的多个靶序列，以确定待检测的基因片段存在与否及其数量。 （ 3） 不对称 PCR：两个引物能浓度比不同 已知 cDNA 一端序列获得全长 cDNA 的 PCR 扩增 （ 1） DNA 末端的快速扩增（ RACE）：指以 mRNA 为模板，反转录合成 cDNA 的第一条链，然后
