1、 毕业设计（论文） （ 20XX 届本科） 题 目 ： 凡纳滨对虾线粒体控制区群体遗传学分析 学 院： 水产与生命学院 专 业： 生物科学（海洋生物方向 ） 班 级： 姓 名： 学 号： 指导教师： 20XX年 XX 月 目录 摘要 .3 ABSTRACT. 3 1绪论 . 4 2 材料与方法 .4 2.1研究样品来源及总 DNA的提取 .4 2.2 mtDNA控制区基因序列的扩增及测序 .4 2.3 线粒体控制区序列的整理与分析 .5 3 结果 .5 3.1凡纳滨对虾线粒体 DNA测序结果 .5 3.2凡纳滨对虾单倍型及单倍型多样性 .5 3.3凡纳滨对虾群体间的遗传分化与遗传距离 .7 3
2、.4 基于 mtDNA控制区序列的凡纳滨对虾分 子系统树 .9 4 讨论 .10 4.1凡纳滨对虾种群遗传多样性 .10 4.2凡纳滨对虾的遗传距离和遗传分化 .10 4.3 线粒体 DNA标记鉴别不同凡纳滨对虾养殖群体的可行性 .10. 5.结论 .11 参考文献 .11 凡纳滨对虾的线粒体控制区群体遗传学分析 摘要 ： 本研究通过对 4个凡纳滨对虾群体即 G1、 G2、 S1、 S2的线粒体 DNA(mtDNA)控制区部分基因序列的测定，系统的分析了其遗传多样性，对比他们之间 系统进化关系。在 4个凡纳滨对虾群体共 40个样本的线粒体控制区序列中共检测到 17种单倍型，其中群体 G1和 G
3、2单倍型数量最多，分别为 8个和 6个。 S2群体单倍型数最少，仅有 1个， S1和 S2群体的单倍型个数均为 1个。 4个群体单倍型多样性（ H1）在 0.4160.0900.9730.022 ，其中遗传多样性最高的为 G1群体。 AMOVE分析结果显示，来自群体间的遗传差异（ 57.03%）略高于群体内的变异（ 42.97%）。各群体的遗传分化 Fst值均为正值， 其中 GD组与其他群体之间差异最大。用 MEGA5.0基于遗传距离构建系统进化树，结果表明 5个凡纳滨对虾群体中， S1和 S2遗传距离最近（ D=0.017），聚为一支， G2群体聚为一支， G1群体单独聚为一支， 4个凡纳滨
4、对虾群体中， 4个群体共享单倍型 H1，此外， S1和 S2共享单倍型 H2， G1和 G2共享单倍型 H11，可能是由于其在选育过程中亲本的遗传背景存在交叉，而 G2群体与其他群体遗传距离较远，可能与选择群体样本的地理位置差异相关。 关键词 ：凡纳滨对虾；线粒体 DNA控制区基因序列；遗传多样性；单倍型 Genetic analysis for Mitochondrial control region groups of Vannamei Abstract: The survey have compared and analyzed the relationship between the
5、genetic diversity and systematic revolution by tasting he gene sequence of control region section of mtDNA of G1, G2, S1, S2 (4 group of Litopenaeus Vannamei). 17 kinds of haplotype was detected in the sequence of mitochondrial control region of the 4 group of Litopenaeus Vannamei in the 40 samples,
6、 and the groups of G1 and G2 had the maximum haplotype amount, sep arately are 8 and 6. Besides, the S2 and S1 group had the least haplotype amount, which both only have 1. The diversity of the haplotype (H1) of the 4 groups was between 0.4160.090 and 0.4160.090, plus the highest group was G1. The a
7、nalysis result of AMOVE showed that the genetic difference that came from dissimilar groups (57.03%) was higher than which came from the same group (42.97%). The Fst values (the genetic differentiation of each group) were all positive, and the differentiation within the G2 group and others is the mo
8、st. The result of the systematic revolution tree built by MEGA5.0 based on the genetic distance discovered that in the 4 groups of Litopenaeus Vannamei: S1 and S2 had the closest genetic distance of 0.017, so they gathered to be a branch; moreover, G2 and G1 gather to be branches respectively; whats
9、 more, the H1 was the shared haplotype in the 4 groups; furthermore, the G1 and G2 shared the H2 haplotype, whereas the SN and SF shared H11. Probably because of the overlap of their parents genetic background when breeding selection, while the G2 group was far from other groups in genetic distance,
10、 perhaps it was connected with the diversity of the geographic position of chosen group samples. Key words ： Litopenaeus vannamei;Control-region gene sequence of mtDNA;Genetic Diversity;Haplotype 1 绪论 ： 凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei),俗称南美白对虾 ,太平洋白对虾 ,原分布于南美太平洋沿岸水域 1 ,为世界上公认的优良养殖对虾品种之一。近几年来 ,凡纳滨对虾出现群体遗
11、传性状变异 ,优良性状丢失、品质下降、生长缓慢。为保护和充分利用优良种质 ,有效解决人工养殖过程中出现的病害流行、个体小型化、产量和质量下降等问题 ,我国每年都从美国引进良种亲虾 。为了恢复和优化种质 ,有效解决人工养殖过程中出现的病害流行 、 个体小型化、产量和质量下降 等问题 ,中国先后进行了多次原始种的引种。在这种情况下 ,有必要对引进品种的种质资源及引种后的人工繁殖、选择育种对群体遗传多样性水平的影响进行了解 ,为今后合理开发、保护和利用凡纳滨 对虾的种质资源以及遗传改良奠定基础 。 日前凡纳纳滨对虾在世界范围的养殖已经非常广泛，研究其用于养殖及生态多样越来越丰富。目前关于凡纳滨对虾遗
12、传多样性及其相关分析的成果多来自于以限制性片段多态性（ RFLP），随机扩增多态性 DNA（ RAPD），序列特异 性扩增区（ SCAR），线粒体 DNA标记 (mtDNA)，扩增片段长度多态性（ AFLP），简单序列重复（ SSR），表达序列标签 (EST)，单核苷酸多态性（ SNP）等分子标记分析技术为主的研究 3-6，目前，生物线粒体 DNA(mtDNA)已然成为研究动物系统天然进化和种群、种群遗传学的主要 研究对象。通过分析 、鉴定 凡纳滨对虾 mtDNA全序列或部分基因片段，全部分析结果其物种进化与遗传关系的 已被广泛应用到南美白对虾的 研究领域中 ,其中有关 12S rRNA、 1
13、6S rRNA、 COI， D-loop等基因片段的研究较多 7-11。 凡纳滨对虾本身具有丰富的遗传多样性和遗传杂合水平 12，而 mtDNA具有独特的优点： DNA分子量小、单拷贝数高；结构和组织简单而高度保守；母系遗传，缺乏重组； DNA突变率高 13-14。通过对凡纳滨对虾 mtDNA控制区基因序列多态性展开研究，可以有效了解群体的遗传结构、变异程度、基因流动及系统发育进化等方面的情况，更为探究线粒体 DNA控制区作为一种基因条形码来识别不同群体的遗传关系是否有效提供理论依据 15。本研究正是以此为基础，以凡纳滨对虾为研究对象，设计引物得到凡纳滨对虾线粒体 DNA控制区序列，分析检测控
14、制区 DNA序列作为一种基因识别标记在凡纳滨对虾不同养殖群体多态性研究 中的可行性，大多数作为凡纳滨对虾选育群体的遗传育种选优、种群测评 和生物多样性提供有利的科学方法。 2 材料与方法 2.1研究样品来源及总 DNA的提取 本研究材料样本取自美国塞班岛凡纳滨对虾养殖基地 (S1、 S2群体 )，美国关岛凡纳滨对虾养殖基地 (G1、 G2群体 )(表 1)。实验样品成年虾 100对每组， 95%酒精密封于样本瓶中，带回实验室后于 4 冰箱保存备用。 每群体随机挑选 10尾 取眼柄 进行 DNA的 提取 。 本研究使用海洋动物组织基因组 DNA提取试剂盒 (天根生化科技（上海）有限公司 )提取凡
15、纳滨对虾基因组总 DNA。提取得到 DNA样品经 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测纯度，紫外分光光度计测定浓度，保存于 -20 冰箱备用。 2.2 mtDNA控制区基因序列的扩增及测序 依据 Genbank中已公布的凡纳滨对虾线粒体 DNA全序列来设计引物，正向引物：F-82(5 -TCAGTATAACCGCGGCTGCTGGCAC-3) ； F-150(5 -CATTTATTTA ATTAGTACTA GGTACTGAG-3) ； F-260(5 -TTACATGTACCATTGACCTA AAAKTG-3) ； F-276(5 -CCTAA AAKTGAAAGAAYAAGCTAGG-3) 。
16、反向引物： R-822(5 -CATTTAWARTTAATATAGAT AGAAT AATTG-3) ；R-981(5 -GATKTATWCTCTAGTATTTWTATGCTTAA-3) ； R-1089(5 -AGTGTCTTCT TTTTGTRTGA AACTT TAATC-3) ； 引物 的合成通过 生工生物工程（上海）股份有限公司合成 完成的 。 将正反 向引物两两交叉筛选，通过设置温度梯度 (53 ， 55 ， 57 ， 59 ， 61 )进行引物 pcr扩增。扩增产物经 1.0% 的 EB-琼脂糖凝胶电泳检测结果，最终确定正向引物 F-276，反向引物 R-1089组合于 55 扩
17、增获得了稳定清晰的条带，可用于全部样品的扩增。 PCR 反应体系为50L ： DNA 模板 2.0 L ；上、下游引物各 1 L ； 2PCR Master MIX25L （ 0.4mM dNTPs；0.1 U/L TaqDNA 聚合酶； 2 Taq Buffer ； 3mM Mgcl2）；补充灭菌的去离子蒸馏水至总体积 50 L 。 PCR 反应条件为： 94 预变性 3 min ； 94 变性 1min， 55 退火 1min， 72 延伸 1min，35 个循环；最后 72 延伸 5 min； 4 保存。扩增产物用 1.0%的 EB-琼脂糖凝胶电泳检测后，直接送生工生物工程（上海）股份有
18、限公司进行测序。 表 1 凡纳滨对虾样品来源与养殖情况 样品群体名称 name 样品来源 source 样品数量 quantity 养殖状态 satuts S1 塞班群岛 10 S1号养殖池 S2 塞班群岛 10 S2号养殖池 G1 关岛 10 G1号养殖池 G2 关岛 10 G2号养殖池 2.3 线粒体控制区序列的整理与分析 将测序所获 mtDNA序列用序列编辑软件 Bioedit v7.0.5.2软件进行比对整理并辅以人工校对，去除两端多余序列后，用 CLUSTL W软件进行多重比对分析，使用 DNAsp v5计算变异位点和简约信息位点，并计算基因核苷酸多样性、单倍型多样性和平均核苷酸差异
19、数；用 Arlequin 3.1软件计算统计碱基组成、多态位点数、转换、颠换和缺失等分子多态性指数，对 4个群体遗传多样性进行 Tajimas D 中性检验；对群体内和群体间的遗传变异进行 AMOVA分子方差分析和遗传分化指数 Fst检验。用 SAMOVA软件计算最大分化指数来确定群体间的最大遗传分组。用 MEGA 5.0软件中的 Kimura Two-Parameter 程序计算群体内和群体间遗传距离，用邻接法（ Neighbor-Joining， NJ）构建基于遗传距离的群体间的分子系统树和单倍型基因类聚图，并对系统树各分支的支持率进行多次抽样检验。 3 结果 3.1凡纳滨对虾线粒体 DN
20、A测序结果 PCR扩增得到凡纳滨对虾线粒体控制区 DNA产物，采用 pcr产物直接测序的方法，共计得到4个凡纳滨对虾群体， 40个不同凡纳滨对虾个体的线粒体控制区 DNA序列。使用 Bioedit软件比对整理并人工校对后，序列平均有效长度 603bp。将所测得序列通过 BLASTn与 NCBI中 Genbank公布的凡纳滨对虾线粒体 DNA序列比对分析，其同源相似性比例为 87.0%，初步确认得到序列为凡纳滨对虾的线粒体控制区片段的目标序列。用于群体分析的线粒体控制区基因序列有效长度 603bp，通过 CLUSTL W软件进行多重比对分析，使用 DNAsp v5计算变异位点和简约信息位点，其中
21、基因保守位点 503个，基因变异位点 100个，简约信息位点 100个。主要变异位点集中在 SN， SF两群体中。 所有序列中的 测得 A、 T、 C、 G的平均碱基含量分别为 34.05%、 48.51%、 10.18%、 7.26%， A+T的含量为 82.56%，明显高于 G+C的含量 17.44%。 3.2凡纳滨对虾单倍型及单倍型多样性 在 4个凡纳滨对虾群体， 40个样本中共检测到 15种单倍型，单倍型在 4个群体的分布比例见表 2，其中 G-21 Da10， G11， G-11这 4个单倍型 样本较多。单倍型最多的群体为 G1和 G2均为 6个 ，其次为 S2(2个 )， S1（
22、1个） ，其中 3个群体 （ S1、 S2、 G1） 共享同一个单倍型 G-21。 4个凡纳滨对虾群体的单倍型多样性和核苷酸多态性分析结果显示，单倍型多样性（ Hd）为0.4160.0900.9730.022 ，核苷酸多样性（ ）为 0.000690.000730.075090.03747 。其中，遗传多样性最高的是群体 SN(Hd= 0. 9730.022, =0.0670.033) ，最低的是 SD(Hd= 0.4160.090, =0.000690.00073) 。对 5个群体遗传多样性进行 Tajimas D 中性检验 (表3)，所有群体的 Tajimas D 中性检验范围为 -1.0
23、6661 3.49478，群体 SS(-0.96308)和 GD（ -1.06661）中性检验值为负值，但由于 4个群体的中性检验结果均未达到显著水平 (P0.05)，因此不支持这些群体历史上经过群体扩增，符合中性突变。 表 2 线粒体控制区基因单倍型在 4组 凡纳滨对虾群体的分布 单倍型Haplotype 群体名称 name 总个数（个） S1 S2 G1 G2 Da10 6 6 S-11 1 1 S-12 1 1 G-1 1 1 G-3 1 1 G-11 5 5 G-13 1 1 G-14 1 1 G-21 13 4 8 1 G1 1 1 G2 1 1 G3 1 1 G4 1 1 G7 1
24、 1 G11 5 5 表 3 4组 凡纳滨对虾的遗传变异参数统计 变异参数 Variability parameters 群体名称 Name S1 S2 G1 G2 单倍型数 1 2 6 6 单倍型多样性指数 0.4160.0090 0.5930.101 0.9730.022 0.9660.022 核苷酸多样性指数 0.00690.0007 0.02500.0128 0.06700.0333 0.07510.0375 平均核苷酸差异数 0.41560.3948 15.07136.9318 40.371918.0541 45.276920.2799 Tajimas D检验统计量 0.89527
25、-0.96308 2.99268 3.49478 P值 0.87300 0.17700 1.00000 1.00000 3.3凡纳滨对虾群体间的遗传分化与遗传距离 利用 mtDNA控制区序列比较 4组 凡纳滨对虾群体的遗传分化，根据软件 Arlequin3.1的 AMOVA分析结果表明：相同群体内的差异 (48.66%)稍低于不同群体间的遗传差异（ 51.34%） 。相同群体遗传趋向差异的 FST指数分析结果表明 4个养殖群体之间很可能是存在遗传分化（ Fst值均为正）。采用 MEGA 5.0软件中的 Kimura Two-Parameter程序计算群体间遗传距离 (表 4)，结果表明S1和
26、S2群体之间的遗传关系最近，为 0.024， S1和 G2之间的遗传距离最远，为 0.175。其中 G2和S1， S2， G1，遗传距离均较远，推测可能与 G2群体取样地理位置与其他群体较远有关。 也有可能 因为简单重复序列或微卫星具有变异性，并大量存在于基因组且以孟德尔方式遗传，共显性表达 ， 推测可能与 GD群体取样地理位置与其他群体较远有关。 表 4 4个凡 纳滨对虾群体间遗传分化系数（对角线上）和群体间遗传距离（对角线下） 群体名称 Name S1 S2 G1 G2 S1 0.0010 0.33096 0.02203 0.88811 S2 0.0010 0.0020 0.003553
27、0 47900 G1 0.0360 0 1470 0.1450 0 37655 G2 0.0180 0.1500 0.1500 0.0330 3.4 基于 mtDNA控制区序列的凡纳滨对虾分子系统树 分别根据遗传距离和单倍型构建群体之间的 NJ系统进化树，从遗传距离 NJ进化树（图 1）可知，进化树主要分为 2个分支： S1和 S2遗传距离较近，聚为一支，其次与 G1， G2聚为一支， 这两支聚为一只相聚有一定距离 。从单倍型进化树（图 2）结果中得到：进化树主要分为两个大的分支， S1和 S2共享单倍型 Ga-21，两者的遗传关系较近， G1、 G2单倍型数目较多，除 G2群体外，S1、 S
28、2、 G1群体均存在独立单倍型。 图 1 基于线粒体控制区序列的遗传距离建立的 5个凡纳滨群体之间的 NJ类聚图 AMOVA设计和结果 变异来源 自由度 平方和 方差组分 变异百分比 (%) 种间 3 748.750 24.55722va 85.96 种内 36 144.400 4.0111vb 14.04 总数 39 893.150 28.56833 遗传分化指数 FST： 0.85960 种群具体 FST指数 名称 FST 1 S1 0.87270 2 S2 0.87224 3 G1 0.83937 4 G2 0.85407 群平均成对差异 - 对角线上方 : 种群之间的成对差异平均数（
29、PIXY） 对角线元素：种群内成对差异平均数（ PIX） 对角 线下面 ：修正平均配对差异（ PiXY-（ PIX+ PIY） /2） 距离法：配对差异 1 2 3 4 1 0.53333 1.00000 79.90000 81.16000 2 0.33333 0.80000 78.98000 81.00000 3 69.84444 68.79111 19.57778 20.78000 4 75.30444 75.01111 5.40222 11.17778 - PXY P value - 1 2 3 2 0.00909 3 0.00000 0.00000 4 0.00000 0.00000 0.00000 - Corrected PXY P value - 1 2 3 2 0.00909 3 0.00000 0.00000 4 0.00000 0.00000 0.00000 图 2 基于 Kimura 双参数模型构建的线粒体控制区序列的单倍型 NJ树
