1、 作者简介：李丽红，女，硕士 Tel:（0311）85992995 E-mail：玉竹中新高异黄酮类化合物及其生物活性研究李丽红 *，任风芝，陈书红，郑智慧，高月麒，张华，贺建功（华北制药集团新药研究开发有限责任公司天然药物室，河北 石家庄 050015）摘要：目的 研究玉竹的生物活性成分。方法 利用各种柱色谱及高压液相色谱等方法进行分离和纯化，根据理化性质和光谱数据对化合物结构进行鉴定；并应用高通量筛选模型对化合物进行评价。结果 从玉竹中分离得到三个高异黄酮类化合物，确定结构分别为 5，7-dihydroxy-6-methoxyl-8-methyl-3-(2，4-dihydroxybenzy
2、l)chroman-4-one（） ，5，7- dihydroxy-6-methyl-3-(2，4-dihydroxybenzyl)- chroman-4-one（II）,5 , 7-dihydroxy- 6-methoxyl-8-methyl-3-(4 -methoxybenzyl)chroman- 4-one（）, 三个化合物均显示了较强的抗肿瘤活性和抗炎活性。结论 化合物 IIII 为未见文献报道的新化合物，其抗肿瘤和抗炎活性为首次报道。 关键词：玉竹；高异黄酮；化学成分；抗肿瘤；抗炎；人白细胞弹性蛋白酶Study on the new homoisoflavonoids and the
3、ir bioactivity from Polygonatum odoratum (Mill.)Druce LI Li-hong*, REN Feng-zhi, CHEN Shu-hong, ZHENG Zhi-hui, GAO Yue-qi, ZHANG Hua, HE Jian-gong（Department of Natural Product Drug Discovery, Shijiazhuang 050015）ABSTRACT: OBJECTIVE To study the bioactive constituents of Polygonatum odoratum (Mill.)
4、Druce. METHODS The compounds were separated by column chromatography and HPLC. On the basis of physicochemical properties and spectral data , their structures were confirmed. High through-put screening method was used to explore the activity of these compounds. RESULTS Three compounds were isolated
5、and identified as 5，7-dihydroxy-6methoxyl-8-methyl-3-(2，4-dihydrox-ybenzyl)chroman-4-one (), 5，7-dihydroxy-6-methyl-3-(2，4-dihydroxybenzyl)-chroman-4-one (II), 5, 7-dihydroxy-6-methoxyl-8- methyl-3-(4-methoxybenzyl)chroman-4-one (). These compounds showed significant anti-tumor and anti-inflammatory
6、 effect CLUSION Compounds IIII were new homoisoflavonoids. Their anti-tumor and anti-inflammatory effects were reported for the first time.KEY WORDS: Polygonatum odoratum (Mill.)Druce; homoisoflavonoid; Chemical Constituents；anti-tumor; anti-inflammatory; human leukocyte elastase玉竹为百合科(Liliaceae)黄精属
7、(Polygonatum)植物玉竹( Polygonatum odoratum(Mill.)Druce)的干燥根茎，为常用中药。最早以葳蕤之名始载于神农本草经 ，列为上品。玉竹味甘性平，能养阴润肺，益胃生津，用于燥热、伤阴、热伤和胃阴之症，有提高免疫力、强心、降血糖、降血脂等功效 1, 其综合利用经济价值正逐渐引起人们的重视。主要含有多糖、皂苷、甾醇、黄酮类等成分。我们对玉竹的化学成分进行了研究，从中得到多个高异黄酮类化合物，其中三个为未见文献报道的新化合物 。本文主要对三个新的高异黄酮类化合物及其抗肿瘤活性进行报道。1 仪器与材料Volian INVOA 500 型（TMS 内标）核磁共振波
8、谱仪，ZMD Micromass 型质谱仪（Microm 公司） ；waters996 型高效液相色谱仪； HPLC 制备色谱柱（Venusil XBP C-18，10m ，10 mm250mm） ；Sephadex LH-20(GE 公司)；柱层析用硅胶（300400 目，青岛海洋化工厂） ；薄层层析用硅胶板（美国默克公司） 。显色剂：10%硫酸乙醇溶液。除色谱纯乙腈外其余试剂均为分析纯。玉竹药材购自石家庄乐仁堂大药房，经鉴定为黄精属植物玉竹的干燥根茎。2 提取与分离玉竹根茎 13kg 经 95乙醇提取 2 次，每次两小时，提取液浓缩至无乙醇味。浓缩液经水稀释，不溶部分用甲醇溶解。甲醇溶部分
9、经硅胶柱色谱，石油醚丙酮洗脱，分为 4 部分。第二部分经硅胶柱色谱，石油醚乙酸乙酯洗脱，得到各流份。流份 1 经 Sephadex LH-20 柱色谱，制备液相得到化合物（15mg） ；流份 3 经硅胶柱色谱， Sephadex LH-20 柱色谱， ，制备液相得到化合物（8mg） ，II（10mg） ；。化合物结构如下所示：OOOHHOOHHOH3COCH3HOH3COOH OOHO2344a5678a9162345 OCH3OH3COOH OCH3O 3 结构鉴定化合物为淡黄色针状结晶(甲醇- 水)，紫外（254nm ）下显红棕色斑点， 10硫酸-乙醇显色后呈桔红色。ESI-MS 显示准分
10、子离子峰为 317M+1，结合 1H-NMR， 13C-NMR 推断其分子式为C17H16O6。 1H-NMR（CD 3OD，500MHz）谱显示， 4.22(1H, dd, J = 4.0, 11.4Hz，H-2)，4.10(1H, dd, J =7.0, 11.4Hz，H-2，)，2.80（ 1H，m ，H-3 ）, 3.08(1H, dd, J =5.0, 13.5Hz，H-9)，2.50(1H, dd, J =10.0, 13.5Hz，H-9)五组脂肪氢信号，为二氢高异黄酮 2-，3- ， 9-位五个氢的特征信号峰； 6.82 (1H, d, J =8.5Hz，H-6) ， 6.20(
11、1H, d, J =2.5Hz，H-3)，6.17（1H, dd, J =2.5, 9.0H z，H-5）呈 ABX 偶合系统，为二氢高异黄酮 B 环间位取代的特征信号峰； 3.66（3H ， s, 6-OCH3） ，1.90（3H，s，8-CH 3）为一甲基信号峰。 1H-NMR 谱中未显示其他取代基的氢信号，推测该化合物的其余位置均为羟基取代，结构中应有四个羟基的存在。 13C-NMR（CD 3OD，125MHz ）谱显示， 200.4 为一羰基信号， 158.9，158.5，157.6，158.3 为连羟基碳信号，进一步证实了羟基取代基的存在；2 个脂肪碳 28.8（C-9）,46.6（
12、C-3）,一个亚甲基碳信号 70.9（C-2）为二氢高异黄酮的特征信号峰；其余碳数据见表1。HMBC 谱中可看到， 1.90（-CH 3）与 158.5（C-7） ，153.1（C-8a）,129.0（C-6） ，105.1（C-8）相关，可确定该甲基连在碳 8 位；结合 HMBC 谱（见表 2）对其余取代基位置进行了确定并对其碳、氢信号作了归属，确定该化合物结构为 5，7-dihydroxy-6methoxyl-8-methyl-3-(2，4-dihydroxybenzyl)chroman-4-one。化合物为淡黄色针状结晶(甲醇- 水)，紫外（254nm ）下显红棕色斑点， 10硫酸-乙醇
13、显色后呈桔红色。ESI-MS 显示准分子离子峰为 345M+1，结合 1H-NMR， 13C-NMR 推断其分子式为C19H20O6。 1H-NMR（CD 3OD，500MHz）谱显示， 4.14(1H, dd, J = 4.0, 11.4Hz，H-2)，4.01(1H, dd, J =7.0, 11.4Hz， H-2)，2.88（1H，m，H-3）, 3.08(1H, dd, J = 5.0, 13.5Hz，H-9)，2.52(1H, dd, J =10.0, 13.5Hz，H-9)五组脂肪氢信号，显示该化合物为二氢高异黄酮类化合物。 6.80 (1H, d, J =8.5Hz，H-6) ，
14、6.24(1H, d, J =2.5Hz，H-3)， 6.17（1H, dd, J =2.5, 9.0H z，H-5）为二氢高异黄酮 B 环间位取代的特征信号峰；1.87 （3H，s ，6-CH 3）为一甲基信号峰。 13C-NMR（CD 3OD，125MHz ）谱显示， 200.2 为一羰基信号， 165.9，162.8，162.3，157.5，158.3 为连氧碳信号。其余碳数据见表 1。该化合物的氢谱碳谱数据与化合物 I 相似，只有由于取代基的不同而引起的信号差别。HMBC 谱中可看到 1.87（-CH3）与 165.9（C-5） ，105.1 （C-6）,162.8（C-7） ，94.
15、8 （C-8）相关，可确定该甲基连在碳 6 位；结合 HMBC 谱（见表 2）对其余取代基位置进行了确定并对其碳、氢信号作了归属，确定该化合物结构为 5，7-dihydroxy-6-methyl-3-(2 ，4-dihydroxybenzyl)-chroman-4-one 。化合物为淡黄色针状结晶(甲醇- 水)，紫外（254nm ）下显红棕色斑点， 10硫酸-乙醇显色后呈桔红色。ESI-MS 显示准分子离子峰为 347M+1，结合 1H-NMR， 13C-NMR 推断其分子式为C18H18O7。 1H-NMR（CD 3OD，500MHz）谱显示， 4.20(1H, dd, J =4.5, 11
16、.5Hz，H-2) ，4.03(1H, dd, J =7.5， 11.5Hz，H-2)，2.75（1H，m，H-3）, 3.07(1H, dd, J =4.5, 14.0Hz，H-9)，2.52(1H, dd, J =10.0, 14.0Hz，H-9)五组脂肪氢信号，为二氢高异黄酮 2-，3- ， 9-位五个氢的特征信号峰； 7.08（2H, d, J =8.5Hz, H-2,6） ，6.79（2H, d, J =8.0Hz, H-3,5）呈 AABB偶合系统，推测 B 环 4 取位； 3.65（3H, s, 6-OCH3） ，3.69（3H, s, 4 -OCH3）为两个甲氧基信号峰， 1.
17、90（3H ，s ，6-OCH 3）为一甲基信号峰。1H-NMR 谱中未显示其他取代基的氢信号，推测其余取代位置均为羟基取代。 13C-NMR（CD 3OD，125MHz ）谱显示， 199.4 为一羰基信号，159.9，159.0，158.6，152.9 为连氧碳信号，其余碳数据见表 1。HMBC 谱中可看到， 3.69（-OCH 3）与 159.9 相关，而与 159.9 相关的还有 7.08 (2H, d, J =8.5Hz)， 6.79 (2H, d, J =8.5Hz)，由此可确定 3.69（-OCH 3）连在 B 环的 C-4(159.9)。结合 HMBC 谱，对化合物其余部分信号
18、进行归属。确定该化合物结构为 5, 7-dihydroxy-6-methoxyl-8-methyl-3-(4-methoxybenzyl)chroman-4-one。表 1 化合物 I-III 的 13C-NMR (CD3OD，125MHz) 数据Position I II III Position I II III2 70.9 70.6 70.3 1 116.8 116.9 131.33 46.6 46.5 48.0 2 157.6 157.5 131.14 200.4 200.2 199.4 3 103.5 103.5 115.04a 102.4 102.6 102.3 4 158.3 1
19、58.3 159.95 158.9 165.9 159.0 5 107.5 107.4 115.06 129.0 105.1 129.0 6 132.6 132.6 131.17 158.5 162.8 158.6 6-OCH3 61.5 - 61.58 105.1 94.8 105.2 6-CH3 - 6.9 -8a 153.1 162.3 152.9 8-CH3 7.2 - 7.29 28.8 28.3 33.0 4- OCH3 - - 55.6表 2 化合物 I-III 的 HMBC 数据H Compound I Compound II Compound III2-H C-9, C-3，
20、C-4, C-8a C-9, C-3,C-4 , C-8a C-9, C-3,C-4 , C-8a6-OCH3 C-6 - C-66-CH3 - C-5 , C-7 ,C-8 , C-6 -8-CH3 C-8, C-7, C-6 ,C-8a - C-8, C-7, C-6 ,C-8a8-H - C-7, C-8 , C-6, C-4 -3-H C-1, C-5, C-4 C-1, C-5, C-4 -5-H C-1, C-3 C-1, C-3, C-4 -6-H C-4, C-9 C-4, C-3 -2, 6-H - - C-3, C-4, C-53, 5-H - - C-2, C-4, C-
21、64- OCH3 C-44 化合物的抗肿瘤活性评价实验材料：人白血病细胞 K562，人肺癌细胞 A549，人结肠癌细胞 HCT-15采用常规 MTT 法。收集处于对数生长期的上述各肿瘤细胞，用 0.25%的胰蛋白酶消化细胞，然后用 10%的 RPMI1640 培养液调整细胞浓度为 1.0105/ml，接种于 96 孔细胞培养板，每孔 100ul，分别加入不同浓度的化合物 I-III，阴性对照药为磷酸盐缓冲液 , 阳性对照药为顺铂。每组均设 3 个复孔。置于37，5% CO2 培养箱中培养 72h，于培养结束前 4h，各培养孔加入 10ul MTT（5mg/ml），培养结束后，吸去培养上清，每孔
22、加入 10%的 SDS 100ul，震荡 10min，使结晶物充分溶解，放置过夜，最后用酶标仪于 490nm 波长处测定各孔 OD 值，进行细胞增殖分析，统计数据并进行 t 检验。实验结果显示，化合物 I-III 对 K562、A549 和 HCT-15 细胞生长有明显的抑制作用。化合物 I-III 对肿瘤细胞的 IC50 值见下表：表 3 化合物 I-III 对肿瘤细胞的 IC50 值（IC 50：ug/ml ）化合物 K562 A549 HCT-15I 12.5 32.7 19.1II 10.0 29.8 15.6III 13.2 35.3 21.4顺铂 2.48 5.02 2.375 化
23、合物的抗炎活性评价人白细胞弹性蛋白酶（human leukocyte elastase ，HLE ）活性测定原理是以化学标记的多肽-nitroanilide 为底物，测定酶反应前后 OD 值的变化。反应式如下：多肽-nitroanilide 多肽 + nitroanilide由于产物 nitroanilide 在 405nm 处有特定吸收，因此测定酶反应前后 405nm 附近处 OD 值的变化可间接测定 HLE 的活性。HLE 活性测定过程：在 96 孔板的样品孔中加入测试样品的 DMSO 溶液，加 HLE 酶液和缓冲液共100l；对照孔用 DMSO 代替样品溶液；空白孔用 DMSO 代替样品
24、溶液并用缓冲液代替酶液。使用1420 Victor2 多标计数仪在 410nm 波长下，读取每孔 OD 值（样品本底 A1）；加入底物 100l，37保温反应 120 分钟后再次读取每孔的 OD 值（A2），并计算样品的抑制率。实验结果显示，化合物 I-III 对 HLE 的抑制作用呈现较好的浓度依赖性的关系，其 IC50如下： 表 4 化合物 I-III 对 HLE 的 IC50值（IC 50：ug/ml）化合物 I II IIIIC50 18.1 12.8 16.26 讨 论HLE高 异 黄 酮 类 化 合 物 是 黄 酮 化 合 物 中 特 殊 的 一 类 ， 这 类 化 合 物 在 植
25、 物 中 较 少 见 ， 主 要 分 布 于 百 合 科 植 物 中 。 我 们 从 百 合 科 玉 竹 中 分 植 物 离 得 到 了 多 个 该 类 化 合 物 ， 活 性 评 价 显 示 所 得 的 高 异 黄 酮 对 多 种 肿 瘤 细 胞 增 殖具 有 明 显 的 抑 制 作 用 ， 同 时 具 有 很 强 的 抗 炎 作 用 。人 白 细 胞 弹 性 蛋 白 酶 是 人 体 中 的 一 种 主 要 的 蛋 白 酶 ， 它 的 直 接 作 用 底 物 是 肺 、 肝 脏 、 肾 脏 等 结 缔 组 织中 的 弹 性 蛋 白 、 胶 原 蛋 白 、 蛋 白 多 糖 等 胞 外 基 质
26、。 弹 性 蛋 白 酶 可 以 破 坏 胶 原 纤 维 及 组 织 基 底 膜 层 ， 在 肿瘤 的 形 成 和 肿 瘤 转 移 方 面 起 关 键 作 用 ， 所 以 弹 性 蛋 白 酶 成 为 抗 癌 新 药 的 作 用 靶 点 3-4。 本 实 验 结 果 显 示 ， 抑制 HLE 活 性 可 能 是 高 异 黄 酮 抗 癌 、 抗 炎 的 机 理 之 一 。玉 竹 在 我 国 分 布 广 ， 资 源 丰 富 ， 并 且 是 药 食 两 用 中 药 材 ， 通 过 本 文 的 研 究 ， 为 玉 竹 在 植 物 抗 癌 药 方 面的 进 一 步 研 究 提 供 了 科 学 依 据 。RE
27、FRENCES 1 Ch P （中国药典）S. 2005 Vol 1：57.2 Jiang Hong Bo, HUANG Jing, GUO Ming Juan, et al. Recent advances in the study of natural homoisoflavonoids J . Acta Pharmaceutica Sina, 2007, 42(2):118.3 Dona, Dell Aica, Pezzato E, et al. Hyperforin inhibits cancer invasion and metastasis J. Cancer Res, 2004, 64(17):6225.4 Sun Z, Yang P. Role of inbalance between neutrophil elastase and alpha 1-antitrypsin in cancer development and progression J. Lant Oncol, 2004,5 (3): 182.
