高级生物化学试题.doc

1、 1 为什么说蛋白质的一级结构决定其高级结构？ 一级结构也就是氨基酸序列，像是一些碱性氨基酸或是带电荷氨基酸会对蛋白质的 2 级结构产生决定性的作用， 由于组成蛋白质的 20 种氨基酸各具特殊的侧链，侧链基团的理化性质和空间排布各不相同，当它们按照不同的序列关系组合时 ，就可形成多种多样的空间结构和不同生物学活性的蛋白质分子。 比如脯氨酸经常出现在肽链的折叠处； 基酸的性质决定了他们的疏水或亲水，这样折叠时亲水的基团在外，疏水的在内 。样下来组成蛋白一级结构的氨基酸间形成像氢键、二硫键这样的次级键，导致了蛋白 2 级结构的形成，如 a 折叠、 b 片层等。三级结构又是由 2 级结构所决定的，多

2、个 2 级结构形成结构域，而 4 级结构又是由几个 3 级结构组成的，所以说蛋白质的一级结构决定了高级结构。 2 试论述蛋白质二级结构的三种基本类型的特点有哪些 ? -螺旋 蛋白质中常见的一种二级结构，肽链主链绕假 想的中心轴盘绕成螺旋状，一般都是右手螺旋结构，螺旋是靠链内氢键维持的。每个氨基酸残基（第 n 个）的羰基氧与多肽链 C 端方向的第 4 个残基（第 n+4 个）的酰胺氮形成氢键。在典型的右手 -螺旋结构中，螺距为 0.54nm，每一圈含有 3.6 个氨基酸残基，每个残基沿着螺旋的长轴上升 0.15nm。 螺旋的半径为 0.23nm。 特点 肽链以螺旋状盘卷前进，每圈螺旋由 3.6

3、个氨基酸构成，螺圈间距（螺距）为 5.44 埃； 螺旋结构被规则排布的氢键所稳定，氢键排布的方式是：每个氨基酸残基的 NH 与其氨基侧相间三个氨基酸残基的 C=O 形成 氢键。这样构成的由一个氢键闭合的环，包含 13 个原子。因此， -螺旋常被准确地表示为 3.613 螺旋。螺旋的盘绕方式一般有右手旋转和左手旋转，在蛋白质分子中实际存在的是右手螺旋。 -折叠 在折叠中，两条以上氨基酸链（肽链），或同一条肽链之间的不同部分形成平行或反平行排列，成为“股”。肽平面之间呈手风琴状折叠，股与股之间会通过氢键固定，但氢键主要在股间而不是股内。氨基酸残基的 R 侧链分布在片层的上下。 折叠层并不是平的，因

4、为侧链的存在使得它看上去像手风琴一样波纹起伏。这样每一股会更紧密排列，氢键更容易建立。氢 键的距离为 7 埃。在蛋白质结构中折叠通常会用箭头表示。肽链的氮端在同侧为顺式，两残基间距为 0.65nm；不在同侧为反式，两残基间距为0.70nm。反式较顺式平行折叠更加稳定。 能形成折叠的氨基酸残基一般不大，而且不带同种电荷，这样有利于多肽链的伸展，如甘氨酸、丙氨酸在折叠中出现的几率最高。 -转角 也是多肽链中常见的二级结构，连接蛋白质分子中的二级结构（ -螺旋和 -折叠），使肽链走向改变的一种非重复多肽区，一般含有 2 16 个氨基酸残基。含有 5 个氨基酸残基以上的转角又常称之环（ loops）。

5、 常见的转 角含有 4 个氨基酸残基，有两种类型。 转角 I 的特点是：第 1 个氨基酸残基羰基氧与第 4 个残基的酰胺氮之间形成氢键；转角 II的第 3 个残基往往是甘氨酸。这两种转角中的第 2 个残基大都是脯氨酸。 由四个连续的氨基酸残基构成， 主链骨架本身以大约 180 返回折迭。 第一个氨基酸残基的 CO 与第四个氨基酸的 NH 形成氢键，从而稳定转折的构象 3 如何将分子量相同的单链 DNA 与单链 RNA 分开，你能够设计出哪几种方法？分别叙述之。 DNA， RNA 不同： 1.两性解离： DNA 无，只有酸解离（ P），碱基被屏蔽（在分子内部形成了 H 键）。 RNA 有，有 P

6、I。 2.粘度大： DNARNA，粘度由分子长度 /直径决定， DNA 为线状分子， RNA 为线团。 3.碱的作用： DNA 耐碱 RNA 易被碱水解。 4.显色反应：鉴别 DNA 和 RNA 浓 HCl 浓 HCl RNA - 绿色化合物 DNA - 蓝紫色化合物 苔 黑酚 二苯胺 啡啶溴红（荧光染料）和溴嘧啶都可对 DNA 染色，原理是卡在分子中， DNA的离心 和电泳显色可用它们。 5.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇来沉淀溶液中的 DNA 和 RNA。 DNA溶于苯酚而 RNA 不溶，故可用苯酚来沉淀 RNA。 6.紫外吸收：核酸的 m 260nm，碱基展开程度越大，紫外

7、吸收就越厉害。 当 A 1 时， DNA： 50ug/ml， RNA 和单链 DNA： 40ug/ml，寡核苷酸： 20ug/ml。 用 A260/A280 还可来表示核酸的纯度： 1.8， DNA 很纯； 2RNA 很纯。 7.沉降速度：对于拓扑异构体（核苷酸数目相同的核酸），其沉降速度为： RNA 超螺旋 DNA 解链环状 DNA 松弛环状 DNA 线形 DNA 也就是在离心管中最上层是线形 DNA，最下面是 RNA。 8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳，泳动速度主要由分子大小来决定，因此，电泳是测定核酸分子量的好方法。 9.DNA 分子量测定最直接的方法：用适当浓度的 EB（溴嘧啶）染

8、色 DNA，可以将其他形式的 DNA 变成线形 DNA，用电镜测出其长度，按 B-DNA 模型算出 bp 数，根据核 苷酸的平均分子量就可计算出 DNA 的分子量 1、用碱分解：能分解的是 RNA，不能分解的是 DNA 2、用专一性酶分解：如 RNase1 只分解 RNA， DNase1 只分解 DNA 3、用酸水解，然后进行单核苷酸层析：含 U 的是 RNA，含 T 的是 DNA 4、颜色反应： RNA 与地衣酚生成鲜绿色化合物， DNA 与二苯胺生成蓝色化合物 1。 DNA 溶于苯酚而 RNA 不溶 ,故可用苯酚来沉淀 ,是最简单的方法。 2。利用吖啶橙的变色特性可鉴别 DNA 和 RNA

9、。吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定，非固定细胞核酸，或作溶酶体的一种标记。观 察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体。虽然测定 DNA 和 RNA 含量时较难获得好的重复性结果，但该方法已被许多实验室广泛采用。 用化学方法水解核酸能够得到什么产物取决于核酸分子中磷酸二酯键和 N-糖苷键对酸、碱的相对稳定性。 RNA 中，核糖与碱基之间的 N-糖苷键对碱稳定， RNA 主链中的磷酸二酯键一般也对碱稳定，因此 RNA 通常应该不被水解。但是， RNA 分子由于核糖上有 2 -羟基，存在邻接基团参与效应，在碱催化下， RNA 分子中的磷酰基发生转移，生成 2 ， 3 -环状单核

10、苷酸中间产物，环核苷酸再进一 步水解成 2 -核苷酸和 3 -核苷酸。 DNA 则一般不被碱水解。 碱水解 RNA 时， A、 C、 G、 U、 I、 T 的单核甘酸和几种甲基化碱基是稳定的， m1A 转变为 m6A，m3C 转变为 m3U，而 m7G、 m1I、 tC6A、 m6tC8A 会被碱破坏。修饰组分 2 -O-甲基核糖核苷酸由于不能形成 2 ， 3 -环核苷酸，因此该处的磷酸二酸键不被碱水解，产物中出现 NmNp和 NmNmNp 等寡核苷酸。大肠杆菌 16S rRNA 中的 m62Am62Ap 也有很强的抗碱性，用 1molL NaOH， 37 水解 9 小时后仍有 38%残存，而

11、通常 RNA 用 0.3molL NaOH ， 37 作用 18 小时即可完全水解。 一 噬菌体裂解途径和溶源化途径的调控 溶源途径 噬菌体感染 E. coli 后，将其基因组整合到细菌染色体上，随着细菌染色体的复制而复制。 整合有噬菌体基因组的细菌称为溶源菌，这一过程称为溶源途径。溶源化细菌一般不被同种噬菌体再行感染，这一现象称为免疫性。 溶菌途径 噬菌体感染宿主后也可以利用细菌细胞内的养料进行繁殖，最终使宿主裂解而死亡，这一过程称为溶菌途径。 溶源化的细菌受某些外界物理或化学因素 (如紫外线、丝裂霉素 C 等 )的作用原噬茵体便脱 离细菌染色体而进行自主复制，于是细菌裂解，游离出大量的噬菌

12、体，这一过程称为诱导。 蛋白质分离主要根据五种原理：分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对配体分子的生物学亲和力等。 DNA 的基因表达调控 抗终止作用 Phage 的转录调控决定了它的裂解途径或溶原途径，它于其它体系比较的最大特点在于抗终止。 抗终止蛋白可解除弱终止子的作用而使转录进行进行。如 PN 作用于 tL1 和 tR1。 PN 在左操纵子上的作用部位称为 NutL（ N-utilization site）， PN 在右操纵子上的作用部位为 NutR， Nut紧邻终止子 处。 抗终止蛋白结合于 nut，当 RNA pol 转录通过 nut 位点时， RNA pol 与 nut 位点的 p

13、N 结合，使 RNA pol 构象发生改变，而不为弱终止子终止。当 nutL 突变时， N 不能抑制 tL1 位点的终止。说明 N 蛋白参与可抗终止（ tL1 和 tR1）， N 蛋白为可扩散的碱性蛋白（ 14kD）它识别特异的 nut 位点，故其不能使细菌转录终止。 噬菌体基因组调控区有 6 个启动子， PL、 PR1 分别负责启动向左向右的转录， PE、 PM 是转录 C基因的两个启动子， PRE 主管建立溶源 (repressor for establishment of lysogeny)， PRM主管维持溶源 (repressor for maintenance of lysogen

14、y)。 PRE 的启动需要 C、 C蛋白， PI 启动转录 int 基因（整合酶）， PI 的起始也需要 C /C蛋白， PR2(或 PR)是 最强的启动子，负责后期一切基因的转录。 PL、 PE、 PM、 PI 是启动左向转录，而 PRl、 PR2 则启动右向转录。 噬菌体进入溶源或溶菌途径决定于 C与 cro 的相对量 。 phage 以原噬菌体形式整合在宿主染色体上。 C蛋白占有 OR2、 OR1 位点，促进了 RNA pol 与 C基因启动子（ PRM)的结合，从而有利于向左转录（ 溶源化 ）。 C蛋白占有 OR2、 OR1 位点，抑制 cro 基因转录，从而不利于向右转录（不利溶菌途

15、径）。当细胞营养丰富时，寄主蛋白酶降解 C使 C对 C合成的促进作用消失，进入 溶菌途径 。 噬菌体进行溶源循环时， DNA 整合到宿主染色体上，随染色体复制而复制，当溶源菌受紫外线或丝裂霉素 C 处理后，会发生 SOS 反应，激活 recA蛋白， recA 蛋白有蛋白水解酶活性，分解 C蛋白。将 C蛋白在第 111 和 112AA 间打断而使 C从 DNA 上脱离，于是 RNA pol 便有机会 与 Cro 基因的启动子结合（ OR1、 OR2 同位点），使转录向裂解方向进行。 裂解途径早期， cro 蛋白与 OR3 结合而阻止了 C基因表达 . 1 离子交换原理及应用 电渗析器 主要组成部

16、分是 离子交换膜 。 利用待分离分子的荷电性质和分子大小的差别，以外电场电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作。离子交换膜 分为阳膜，阴膜。阳膜只充许阳离子通过而阴离子被阻挡；阴膜只充许阴离子通过而阳离子被阻挡。 电渗析应用 工业上多用于海水、苦咸水淡化、废水处理 生物分离中可用于氨基酸和有机酸等 小分子的脱盐和分离纯化。 （ 2）离子交换层析 原理： 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的 含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。 常用的离子交换剂 ： 离子交换纤维素、离子交

17、换葡聚糖和 离子交换树脂 应用： 离子交换层析 的应用 1）水处理 用于水中的各种阴阳离子的去除。目前，离子交换树脂的最大消耗量是用在火力发电厂的纯水处理上，其次是原子能、半导体、电子工业等。 2）食品工业 离子交换树脂可用于制糖、味精、酒的精制、生物制品等工业 装置上。 3）制药行业 制药工业离子交换树脂对发展新一代的抗菌素及对原有抗菌素的质量改良具有重要作用。 4）合成化学和石油化学工业 在有机合成中常用酸和碱作催化剂进行酯化、水解、酯交换、水合等反应。 5）环境保护 离子交换树脂已应用在许多非常受关注的环境保护问题上。 6)分离纯化小分子物质 离子交换广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸

18、、氨基酸、抗生素等小分子物 质的分离纯化。 7)分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。 (3)离子交换色谱 原理 以 离子交换树脂作为固定相 ，选择合适的 以离子交换树脂作为固定相，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法 离子交换色谱的应用 料液处理量大分离过程具有浓缩作用 应用范围广，可在较高流速下操作 应用范围广，可在较高流速下操作 非特异性吸附小，产品回收率高 离子交换剂种类多，选择余地大，价格低廉 蛋白肽核酸分离纯化的主要手段 2 吸附的原理及应用 1) 物理吸附

19、，是指 吸附剂 与吸附质之间是通过分子间引力（即 范德华力 ）而产生的吸附，在吸附过程中物质不改变原来的性质，因此吸附能小，被吸附的物质很容易再脱离，如用 活性炭吸附 气体，只要升高温度，就可以使被吸附的气体逐出 活性炭 表面。 2) 化学吸附 ，是指吸附剂 与吸附质之间发生化学作用，生成 化学键 引起的吸附，在吸附过程中不仅有引力，还运用化学键的力，因此吸附能较大，要逐出被吸附的 物质需要 较高的温度，而且被吸附的物质即使被逐出，也已经产生了 化学变化 ， 不再是原来的物质了，一般 催化剂 都是以这种吸附方式起作用。 疏水性吸附色谱 原理 : 利用表面偶联弱疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相根

20、据蛋白质与疏水性吸附剂 剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行的分离纯化方法 吸附层析 原理 : 以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。 载体 ： 硅胶 氧化铝 羟基磷石灰 应用： 分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物质 3常用的膜过滤方法、原理及应用 方法 : 超滤 (UF)：过滤精度在 0.001-0.1 微米，属于二十一世纪高新技术之一。是一种利用

21、压差的膜法分离技术，可滤除水中的 铁锈、泥沙、悬浮物、胶体、细菌、大分子有机物等有害物质，并能保留对人体有益的一些矿物质元素。是矿泉水、山泉水生产工艺中的核心部件。超滤工艺中水的回收率高达 95%以上，并且可方便的实现冲洗与反冲洗，不易堵塞，使用寿命相对较长。超滤不需要加电加压，仅依靠自来水压力就可进行过滤，流量大，使用成本低廉，较适合家庭饮用水的全面净化。因此未来生活饮用水的净化将以超滤技术为主，并结合其他的过滤材料，以达到较宽的处理范围，更全面地消除水中的污染物质。 纳滤 (NF)：过滤精度介于超滤和反渗透之间，脱盐率比反渗透低，也是一种需 要加电、加压的膜法分离技术，水的回收率较低。也就

22、是说用纳滤膜制水的过程中，一定会浪费将近30%的自来水。这是一般家庭不能接受的。一般用于工业纯水制造。 反渗透 (RO)：过滤精度为 0.0001 微米左右，是美国 60 年代初研制的一种超高精度的利用压差的膜法分离技术。可滤除水中的几乎一切的杂质（包括有害的和有益的），只能允许水分子通过。也就是说用反渗膜制水的过程中，一定会浪费将近 50%以上的自来水。这是一般家庭不能接受的。一般用于纯净水、工业超纯水、医药超纯水的制造。反渗透技术需要加压、加电，流量小，水的利用率低， 不适合大量生活饮用水的净化。 微滤（ MF） ：过滤精度一般在 0.1-50 微米，常见的各种 PP 滤芯，活性碳滤芯，陶

23、瓷滤芯等都属于微滤范畴，用于简单的粗过滤，过滤水中的泥沙、铁锈等大颗粒杂质，但不能去除水中的细菌等有害物质。滤芯通常不能清洗，为一次性过滤材料，需要经常更换。 PP棉芯：一般只用于要求不高的粗滤，去除水中泥沙、铁锈等大颗粒物质。 活性碳：可以消除水中的异色和异味，但是不能去除水中的细菌，对泥沙、铁锈的去除效果也很差。 陶瓷滤芯：最小过滤精度也只 0.1 微米，通常流量小，不易清洗。 原理 :膜过滤是 一种与膜孔径大小相关的筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以膜为过滤介质，在一定的压力下，当原液流过膜表面时，膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面

24、微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的分离和浓缩的目的。 其他常用膜分离过程 除了以上四种常用的膜分离过程，另外还有渗析、控制释放、膜传感器、膜法气体分离等。 4常用的生化物质分离所用的层析方法，各自原理及应用 吸附层析 原理 :以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由 于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。 载体 ： 硅胶 氧化铝 羟基磷石灰 应用： 分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物质 分配层

25、析 原理 :分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组 分按其各自的分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。 载体 ： 纤维素 硅藻土 硅胶 应用： 各种生化物质的分离鉴定 凝胶层析 原理： 凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是 60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒

26、间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长 ，移动速度慢而后流出层析柱。 基质 葡聚糖凝胶（ sephadex） 琼脂糖凝胶（ sepharose 应用 测定分子量 脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子 除去热原物质 离子交换层析 原理 : 利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同，经过交换平衡达到分离的目的 基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂 应用 主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。 亲和层析 原理 : 亲和层析是应用 生物高分子

27、与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。 基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、 sephadex 应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 ;分离纯化核酸 ;研究酶的结构与功能 聚焦层析 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在 pH 梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 pH 梯度的形成 (由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成 )是 聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成 pH 梯度的层析柱上时 ,由于洗脱液的连续流动，蛋

28、白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的 pH 处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点 pH时被洗出。在聚焦层析过程中 ,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出 ,并且有一定的时间进行聚焦 ,剩余样品还可以加到柱上 ,其聚焦过程都能顺利完成 5 SDS-PAGE 的原理及应用。 原理 : 在电场的作用下，带电粒子能在聚丙烯凝胶中迁移，其迁移速度与带电粒子的大小、构型和所带的电荷有关。十二烷基磺酸钠（ SDS）能与蛋白质的结合，改变蛋白质原有的构象，使其变成近似于雪茄烟形的长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比。在 SDS-PAGE 中， SDS-复合物

29、的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关。在一定浓度的凝胶中，由于分子筛效应，则电泳迁移率就成为蛋白质分子量的函数，实验证实分子量在 15kD 200 kD 的范围内，电泳迁移与分子量的对数呈直线关系，用此法可根据已知分子量白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。同时也可根据不同分离级分的蛋 白条带的多少来判定分离纯化产物的纯度。 应用 : 1. 蛋白质纯度分析； 2. 蛋白质分析量的测定，根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量； 3. 蛋白质浓度的测定； 4. 蛋白质水解的分析； 5. 免疫沉淀蛋白的鉴定； 6. 免疫印迹的第

30、一步； 7. 蛋白质修饰的鉴定； 8. 分离和浓缩用于产生抗体的抗原； 9. 分离放射性标记的蛋白质； 10. 显示小分子多肽 应用： 普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进 行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离 (或迁移率 )，并对各自分子量的对数 (log Mr)作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离 (或迁移率 )，通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测 6. 生物分离中常用的电泳分离方法及应用。 常用电泳技术 :醋

31、酸纤维薄膜电泳 ;聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;琼脂糖电泳 ;毛细管电泳 醋酸纤维薄膜电泳 原理 : 以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细 密的微孔薄膜，厚度以 0.1mm 0.15mm 为宜。带电颗粒在电场的作用下 向着其所带电性相反的电极移动，从而带到分离目的 . 应用 : 特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测 ,已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋 白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。 聚丙烯凝胶电泳 (PAGE) 一般 PAGE、

32、 SDS-PAGE 、 PAGE 等电点聚焦 PAGE 是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶 (PAG)作为支持物，采用 电泳基质的不连续体系 (即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、 pH 的不连续性及电位梯度的不连续性 ) 或 连续体系（一层凝胶、一种 pH 和一种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。 PAGE等电点聚焦 原理 : 在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体 (Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其 pK 和 pI 值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极 pH 值逐步上升的梯度。两性化合物

33、在此电泳过程中，就被浓集在与其 pI 相等的 pH 区域，从而使不同化合物能按 其各自等电点得到分离。 应用： 高效率分离纯化蛋白质 ;测定蛋白质分子量 琼脂糖电泳 琼脂糖凝胶用作电泳的固相支持物具有分子筛效应，其对生物分子的分离作用不仅与其分子的构象及其相对分子质量大小有关，而且与凝胶的浓度也有密切关系，故可根据分离对象分子量大小选择适当浓度的凝胶。琼脂糖电泳常用于核酸分离，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 2OObP 至 5Okb 的 DNA，琼脂糖凝胶还常用作免疫电泳的固相支持物。 毛细管电泳 毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（ 2-75 m）中装入缓冲液，从其一端注入样品

34、，在 毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。 目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、 DNA序列测定及 PCR 产物的分析鉴定等。 膜过滤技术 正文： 膜分离是 20 世纪 60 年代以来发展较快的一项分离技术 ,它具有操作条件温和、无污染、无相变等特点 ,在许多方面都得到了应用 ,象微滤、超滤已应用于生物化工和医药行业中 . 膜分离是根据分子大小不同来实现分离的 ,一般相对分子质量相差 10倍以上的物系才具有分离作用 ,因此它还远远不能满足生 化分离的需要 . 而生物亲和作用是生物分子之间的可逆专一性识别

35、作用 ,具有极高的选性 . 亲和层析法缺点 : 1) 亲和载体价格昂贵 ,使用寿命短 ;2) 色谱柱易堵塞和污染 ,需对原料进行预处理以除去颗粒性杂质 ;3) 难以实现连续操作和规模放大 . 目前亲和层析法仅局限于价值极高的生物活性物质的小批量纯化 . 为克服膜过滤和亲和层析的缺点 ,发展了 亲和膜过滤技术 ,不仅利用了生物分子的识别性能 ,分离低浓度的生物制品 ,而且膜的渗透性及通量大 ,能在纯化的同时实现浓缩 ,此外还有操作方便、设备简单、便于大规模生产的特点 ,发展前景引人 瞩目。 1 膜过滤的分类 1 1 微孔过滤膜 适用在低压 (0 3Mpa)条件下过滤，如应用于制备无菌水、药品、饮

36、料和酒类过滤。 1 2 超滤膜超滤膜 纯水工作压力为 0 3Mpa，一般在常温下进行操作。特别适用于热敏性物质的浓缩与分离。如应用超滤装置对乳制品、生物制品、果酒、果汁的分离和提纯、蛋白质浓缩、饮用纯净水等。 1 3 反渗透膜 能截留盐或小分子量有机物，使水选择性通过或气体通过。如应用在海水脱盐、天然气提纯、回收有机物蒸气、气体分离技术、制备富氧空气、干燥氮气、氧氮分离、氢氮分离、果汁和蔬菜汁加 工等。 1 4 纳滤膜 过滤精度孔径 0 000 5-0 0o5微米，切割分子量为 200 l 000；持留通过纳滤膜的溶质介于传统分离范围的超滤和反渗透之间，如盐类。适用范围为海水淡化、超纯水、多糖

37、、乳酸、酪素和抗菌素浓缩等。 2 膜过滤的应用 2. 1 医药行业中的应用 4 在我国制药业已经使用微滤 (滤膜孔径 0. 22 m)技术对澄清的药液再次除菌、除热原。亦有使用超滤方法去除抗生素中热原物质。 2. 2 食品工业上的应用 传统的食品消毒方法 ,多采用加热杀菌法 ,但会给食品的品质带来不利的影响 ,如变色 、变味、营养损失等。随着人们生活和消费水平的提高以及科学技术的发展 ,一些非加热的消毒技术应运而生 ,并逐渐在实践中得到推广应用 ,过滤即是常用的手段之一。在糖厂、酒厂及清凉饮料厂 ,过滤除菌技术常用于去除粗糖液、酒及水质中可能污染的细菌。 2. 3 检验领域的应用 2.3.1

38、在临床检验中的应用 国内医疗单位 ,在生化检验中使用不同孔径的微孔滤膜分离蛋白质 ,可以选择性地截留血清或体液中各种不同分子量大小的蛋白质。 2.3. 2 微生物限度检查 在检测使用中消毒剂的微生物污染状况时 ,使用滤膜过滤法可去除抑菌物质 ,较真实的 反映实际情况。在检测液体食品和饮料中细菌总数和大肠菌群数、酵母菌、霉菌时 ,采用滤膜过滤的方法 ,灵敏性、准确性较高 ,检出率高 ,可以代替平皿倾注法、多管发酵法。用滤膜过滤法在细菌培养过程中其代谢产物和拮抗物质不易横向扩散 ,有利于菌落的独立生长 ,避免菌落的迁延现象 ,排除了优势菌群的干扰 ,菌落易于分辨 ,提高了实验的准确性。 2.3.

39、3 水质检测 5 滤膜过滤技术在水质微生物检验方面应用很广 2.3. 4 消毒剂鉴定中的应用 在臭氧水对微生物的杀灭效果鉴定中 ,因臭氧水机连续不断的产生臭氧水 ,且臭氧在水中的溶解度 低、极易降解挥发 ,故将新发生的臭氧水直接流到染菌滤膜 (孔径 = 0.45 m)上 ,使臭氧水连续不断的作用至预定时间 ,来测定臭氧水机的杀菌效果。 2.3. 5 微菌落技术中的应用 单克隆抗体应用 作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其 特异性强、纯度高、均一性好 等优点，广泛应用于 鉴别淋巴细胞 、 鉴定病原体 、 肿瘤的诊断和分型 和 体内激素含量的测定 等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。但是单克隆抗体对抗原的识别，与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点 不同，导致检测结果有一定差异。因此，标准化问题还需要进一步研究。 单克隆抗体的制备： （ 1）用抗原反复免疫小鼠，刺激机体诱生抗原特异性 B 细胞。（ 2）取该免疫小鼠脾细胞（含有 B 细胞）与非分泌性小鼠骨髓瘤细胞在 PEG 作用下进行细胞融合。由于哺乳类细胞的 DNA 合成分为从头合成和补救合成两条途径。前者利用磷酸核糖焦磷酸和尿嘧啶，可被氨基蝶呤阻断；后者则在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶存在下利用次黄嘌