1、对山东地区 TTV 基因片段的检测及其部分核酸序列测定作者：于建国 商庆华 任 浩 肖德明 尹燕明 白 薇 戚中田 张光曙 【关键词】 输血传播 关键词: 输血传播，病毒;肝炎，非甲戊型;核酸，序列 摘 要:目的 了解山东地区输血传播病毒（TTV）分离株感染状况及基因变异的情况. 方法 应用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测山东地区 26 例非甲戊型肝炎和 12 例肝细胞癌患者血清中的 TTV DNA，对阳性扩增的产物进行测序，并分析其基因变异情况. 结果 26 例非甲戊型肝炎患者检出 TTV DNA 阳性者 11 例（42%）.对其中 2 例（TTVSD4，TTVSD5）进行 PCR
2、产物直接测序，并与日本株（AB008394）相比较，其核苷酸序列同源性分别为 99.9%和 100%.而 12 例肝细胞癌患者中 TTVDNA 阳性 3 例（25%） ，对其中 1 例（TTVSD6）测序，与日本株（AB008394）相比较，其核苷酸序列同源性为 99%;TTVSD4、TTVSD5 和TTVSD6 之间的核苷酸同源性均为 99%. 结论 山东地区非甲戊型肝炎和肝细胞癌患者中 TTV 感染率较高，测序结果表明其与日本株（AB008394）有较高的同源性. Keywords:transfusion transmitted virus;nonA-E hepatitis;Nucleot
3、ide sequence Abstract:AIM To investigate the prevalence of TTV infec-tion and genetic variation of TTV isolate in Shandong Province.METHODS TTV DNA were amplified and de-tected by RT-PCR methods from sera of patients with nonA-E hepatitis（n=26）and hepatocellular carcinoma（n=12）.The positive PCR prod
4、ucts were sequenced and analyzed for genetic variation.RESULTS TTV DNA were detectable in11of26patients（42.3%）with nonA-E hepatitis.Two of them（TTVSD4，TTVSD5）were sequenced and compared with known sequence of TTV isolates in Japan（AB008394）.The nucleotide homology was99%and100%.TTV DNA was positive
5、in3of12patients（25%）with hepatocellular carcinoma.One of them（TTVSD6）was sequenced and com-pared with AB008394.The nucleotide homology was99%.CONCLUSION TTV infection is high in the nonA-E hepati-tis and hepatocellular carcinoma patients in Shandong province.The secquence results showed that the TTV
6、 isolate in Shandong province has high homology with TTV isolate AB008394in Japan. 0 引言 以往研究认为，TTV 感染具有致病性，同输血或血制品密切相关，可能是导致肝功能长期损害的又一致病因子.为探讨山东地区非甲庚肝炎和肝癌患者 TTV 感染状况和基因变异的情况，并阐明 TTV 在人类肝炎中的作用、地位及其传播途径，我们检测了非甲戊型肝炎和肝癌患者血清中 TTV 的感染率，并对其中 3 例 TTV 阳性患者进行序列分析. 1 对象和方法 1.1 对象 1998-03/2000-09 解放军第 88 医院、济南军
7、区肝病研究所、泰安市中心医院和泰山医学院附属医院临床与病理确诊为非甲庚肝炎患者 26（男 19，女 7）例，平均年龄（371.4）岁.患者有输血或输血制品、手术、拔牙、针灸、注射以及与肝炎患者密切接触史者 17 例.这些非甲戊型肝炎排除甲庚型肝病毒、EBV、CMV 感染.肝癌患者12（男 8，女 4）例，平均年龄（348.8）岁.其中有输血或输血制品、手术、拔牙、静脉注射史者 10 例.临床排除甲庚型肝炎病毒、EBV、CMV 感染.空腹抽血 5mL，分离血清，分装后置-80冰柜保存备用，采血同时进行流行病学调查. 1.2 方法 1.2.1 TTV DNA 提取 取血清 100L 加 300L
8、裂解液13.3mmol L-1 Tris-HCL，pH8.0，6.7mmol L-1 乙二胺四乙酸（EDTA） ，6.7g L-1 十二烷基硫酸钠（SDS） ，133mg L-1 蛋白酶 K.70水浴 1h，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于 20L1TE 中. 1.2.2 PCR 扩增 参照 TTV 日本株序列设计 2 套引物，由上海生工生物工程有限公司合成.分别为:S1:5-CCATTCACAGACAGAGGAGAAGGC-3 ，S2:5-CTAATAAGAAGTCCCTTTACAGACCC-3，AS1:5-GGAGTGGGTTTCGGGGCAGGG-3，其中，S1/AS1 为外引物，S2/
9、AS1 为内引物，预期扩增片段为 323bp;S3:5-CAATAGAGTCCCTAGAA-GCTTA CA-3，AS3:5-GGTAACAAG-GTAGGGTTGATATC-3，S4:5-GGAACTCA-CATTCCATACCTG-3，AS4:5-GTTTGACTC-CCAGGATTCG-3 ，其中 S3/AS3为外引物，S4/AS4 为内引物，预期扩增片段为 329bp.PCR 试剂购自Progema 公司.PCR 扩增条件:取模板 5L，10Taq 缓冲液5L，dNTP0.1mmol L-1 和 Taq 酶 1U，引物浓度均为 0.3mol L-1 ，共 50L 反应体积;取第 1 次
10、 PCR 产物 5L 作模板，其他同第 1 轮.循环条件均为:94预变性 180s，9435s，5635s，7245s，扩增 30 个循环，72延伸 8min.取第 2 次 PCR 产物 15L20g L-1 琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增结果. 1.2.3 序列测定和分析 PCR 产物纯化后用 PE 公司的 ABI Prism377DNA 自动测序仪行 PCR 产物直接测序，测序引物为 S4/AS4，将所测序列通过 In-ternet Blast 进行同源性分析. 2 结果 26 例非甲庚肝炎和 12 例肝细胞癌患者血清中 TTV DNA 阳性检出率分别为 24%（11/26）和 25%（
11、3/12）.对 PCR 阳性产物直接测序，Internet Blast 检索结果表明山东 TTVSD4、TTVSD5 和 TTVSD6 与日本TTV 原型（基因 1a）TA278（AB008394） 1 相应部位核苷酸序列同源性分别为 99%、100%和 99%，此 3 株间核苷酸同源性也达 99%以上（Fig1）. 图 1 略 3 讨论 1997 年，Nishizawa 等2 利用代表差异分析（rep-resentational difference analysis，RDA）技术，从一例输血后肝炎患者血清中成功获得长 500bp 的基因克隆（N22 克隆）.后验证 N22 克隆系无包膜单股
12、 DNA 病毒，基因组全长约 3739bp.随后我国周育森等3 用 PCR 技术从一例急性非甲戊型肝炎患者血清中克隆出 298bp 片段，经分析与日本发表的序列同源性为 98%.1998 年我们成功克隆了 2 株TTVSD1（AF416139） 、TTVSD2（AF416140）部分基因序列4 .经分析证实 TTVSD1 与日本株（ABOO8394）和中国第 1 株（CTTVCHN01）核苷酸序列同源性均为 94%;TTVSD2 与上述日本和中国株相比较核苷酸序列同源性分别为 91%和 93%;TTV 山东 2 株间序列同源性为 91%.提示TTVSD1、TTVSD2 分离株和中国第 1 株与
13、日本株相比较可能归属于一个亚型. 我国是多种肝炎病毒感染发病率较高的国家，有相当部分肝炎患者是经输血或血制品途径感染的.庚型肝炎病毒（HGV/GBV-C）自 1995 年被发现，有关 TTV 论文自 1997 年发表以来，国内外对其致病性一直存有争议5-10 .为了解 TTV 在中国山东地区人群中感染状况，分析其 TTV山东株部分基因结构与特征，进一步开展 TTV 感染预防和疫苗研究.我们参照 TTV 日本株序列设计两套引物，用 RT-PCR 方法检测了 TTV 在非甲戊型肝炎和肝癌患者中的感染情况.为防止因 PCR 操作造成的假阳性，弥补不同区域的引物造成检出率的差异，设计不同区域的两套引物
14、以相互补充，每份标本一式两份，一份直接 PCR，另一份经 MBN（20U）酶切消化后 PCR，同时设立阴阳性对照观察.检测结果表明，26 例非甲戊型肝炎和 12 例 HCC 患者血清中，TTV DNA 阳性检出率分别为 42%（11/26）和25%（3/12）.由此可见山东地区非甲戊型肝炎患者中确存在 TTVDNA，提示 TTV 可能是导致非甲戊型肝炎的病原体.由于肝癌患者易暴露血液（注射、输血、针刺创伤等） ，提示 TTV 感染主要通过输血或血制品途径传播，但是否导致肝细胞癌变，则有待于进一步探讨.鉴于所选病例均有输血史或接触血制品史，表明输血或血制品是导致 TTV 感染的主要途径. 我们应
15、用 RT-PCR 产物直接测序方法，对临床与病理确诊 2 例非甲庚肝炎和 1 例肝癌患者进行核苷酸序列测定，结果发现TTVSD4、TTVSD5 与日本原型 TA278（AB008394，基因 1a）核苷酸序列同源性分别为 99%和 100%，而 TTVSD6 与 TA278 的核苷酸序列同源性也为 99%.表明本地区流行的 TTV 株与 TA278（AB008394）克隆进化距离较近，可能属于同一基因型.本文所报道的 3 株 TTV 分离株间的核苷酸同源性达 99%以上，证明为同一种病毒的不同分离株，应归属一个基因型或亚型.TTV 是一种单股 DNA 病毒，约 3.7kb，含有 ORF1 和
16、ORF2 两个读码框架，编码为770 与 202 个氨基酸.TTV 感染分布广泛，在国内外人群中均存在不同程度感染，感染途径除经血液外，粪口传播也可能是一个重要传播途径11 .自发现 TTV 以来，迄今 4a 多的时间里，国内外已阐明 TTV 全基因结构，证明具有为数众多的基因型，而某些基因型株或变异株 TTV 感染确与肝损害病理生理改变密切相关.临床上，某些肝功能异常改变虽不重要，但足以说明 TTV 持续性感染与肝损害具有一定的致病性12-15 .现已证实，TTV 存在多种混合性感染.一般为多系不同基因型株混合感染，因此进一步探索不同地区不同基因型株 TTV 感染同肝病之间的相互关系是十分重
17、要的. 参考文献: 1Okamoto H，Nishizawa T，Kato N，Ukita M，Ikeda H，Iizuka H，Miyakawa Y，Mayumi M.Molecular Clonin and characteri-zation of novel DNA virus（TTV）associated with posttransfu-sion hepatitis of unknown etiology J.Hepatol Res，1998;10（10）:1-16. 2Nishizawa T，Okamoto H，Konishi K，Yoshizawa Y，Mayumi M.A no
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