1、咪唑安定对豚鼠噪声性聋的保护作用作者：温健，景桂霞，高艳凤，王伟，许珉【摘要】 目的 通过检测豚鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和耳蜗中活性氧含量研究咪唑安定对噪声性聋的保护作用。方法 雄性杂色豚鼠 40 只，随机分为正常对照组(C 组)、咪唑安定组(M组)、生理盐水组(S 组)和噪声性聋组(D 组)，每组 10 只。M 组、S 组和D 组每天接触倍频程连续噪声(中心频率为 4kHz，强度为 100dB SPL)3h，连续 3d。M 组于噪声暴露前 24h、即刻及噪声暴露中肌肉注射咪唑安定0.1mg/kg；S 组在相同时间肌肉注射等量的生理盐水；D 组为单纯接触噪声对
2、照组。C 组不接触噪声仅肌肉注射咪唑安定，注射时间及剂量与 M 组相同。所有动物均于噪声暴露前及暴露后立即检测听性脑干反应(ABR)阈值，在噪声暴露前和噪声暴露第 3 天处死前，取血测定血清中 SOD 活性、MDA 含量，于第 3 天测完 ABR 阈值后，立即断头处死豚鼠，取出双侧耳蜗，测定其活性氧含量。结果 噪声暴露后，M 组的 ABR 阈移(1.61.5)及活性氧含量(291.102.30)u/mL显著低于 S 组和 D 组41.73.3，44.33.9；(348.523.60)u/mL，(315.566.70)u/mL， P0.05。M 组在噪声暴露后血清 SOD 活性下降、MDA 含量
3、升高，但其幅度明显小于 S 组和 D 组。结论 咪唑安定可减少噪声暴露后耳蜗中增多的活性氧含量，从而产生对噪声性耳蜗损伤的保护作用。 【关键词】 耳蜗；活性氧；噪声性聋；咪唑安定ChinaABSTRACT: Objective To investigate the protective effects of midazolam on noise-induced hearing loss in guinea pigs by testing reactive oxygen species (ROS) level in the cochlea and plasma SOD and MDA. Meth
4、ods Totally forty male pigmented guinea pigs were randomly divided into four groups: control (C) , midazolam (M), normal saline (S) and noise-induced deafened (D) groups, with ten guinea pigs in each. Groups M, S and D were exposed to a continuous noise (4kHz , octave band, 100dB SPL) 3h every day f
5、or 3 consecutive days. Group M was treated with midazolam, which was administered intramuscularly (0.1mg/kg) 24h before noise exposure, and immediately upon and during noise exposure. Group S was exposed to noise and treated with the same volume of normal saline intramuscularly, the time of injectio
6、n was the same as that of Group M. Group C was not exposed to noise, but was treated with midazolam intramuscularly, the time of injection and the dosage were the same as those of Group M. Group S was exposed to noise and treated with normal saline intramuscularly ,the time of injection was same wit
7、h that of Group M.Group D was exposed to noise only. All animals received auditory brainstem response (ABR) threshold recording before and immediately after noise exposure. Blood was collected when the guinea pigs were killed after the last ABR threshold recording, and serum SOD activity and MDA con
8、tent were detected. Both the cochleae were removed and prepared for ROS assay. Results After noise exposure, ABR threshold shift (1.61.5) and ROS content (291.102.30)u/mL in Group M were significantly lower than those in Groups S and D 41.73.3, 44.33.9; (348.523.60)u/mL, (315.566.70)u/mL, P0.05. Ser
9、um SOD activity and MDA content were significantly increased in Group M, but the amplitude was less than that in Groups S and D.KEY WORDS: cochlea; reactive oxygen species (ROS); noise-induced hearing loss; midazolam随着现代医学的发展，医用电钻在耳科手术中应用越来越广泛，但耳科电钻噪声引起的内耳听力损伤仍未引起足够的重视。早在 1976 年KYLEN 和 ARLINGER 通过人的
10、颞骨和尸体颅骨研究证实耳科电钻在术侧耳蜗的噪声为 100dB，这种噪声可以导致高频感音神经性听力下降。噪声可对人的听觉系统产生特异的损伤作用，导致听阈升高，严重的则引起噪声性聋。噪声对听觉系统的损伤除造成代谢性损伤外，同时产生机械损伤，两者均导致大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生，ROS 在噪声引起的耳蜗损害中起着十分重要的作用1。ROS 清除剂能减轻噪声引起的听力损害2。CHUNG3研究表明,全身麻醉药异氟醚、氟烷、戊巴比妥能够对小鼠噪声引起的听力损害起到保护作用，推测其机制可能与活性氧的产生减少有关。本研究通过检测豚鼠血清中超氧化物歧化酶(supe
11、roxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和耳蜗中 ROS 含量来研究咪唑安定对噪声性聋的防护作用及其可能作用机制。1 材料与方法1.1 实验动物及分组 选用耳廓反射正常的健康雄性杂色豚鼠 40 只，体重 250300g，随机分为正常对照组(C 组)、咪唑安定组(M 组)、生理盐水组(S 组)和噪声性聋组(D 组)，每组 10 只。正常对照组不接触噪声，只注射咪唑安定；咪唑安定组接受噪声暴露且注射咪唑安定；生理盐水组接受噪声暴露，注射生理盐水；噪声性聋组单纯接触噪声。1.2 噪声条件 自制噪声箱，为自由声场的混响箱，背景噪声40dB
12、 SPL(A)。采用特制动物笼，将每只豚鼠分隔开。噪声箱的两个对角有两个扬声器，特制动物笼放置在两个扬声器之间，与每个扬声器的距离约为 40cm。扬声器与纯音听力计相连(丹麦产 DANPLEXDA74)，由纯音听力计发出中心频率为 4kHz 的倍频程连续噪声，校准后强度为 100dB SPL，且使每只动物所在位置噪声基本一致。咪唑安定组、生理盐水组和噪声性聋组动物每天给与 3h 连续噪声，持续 3d。正常对照组不接触噪声。1.3 给药方法 咪唑安定组于噪声暴露前 24h、噪声暴露前即刻及噪声暴露中 1h肌肉注射咪唑安定 0.1mg/kg(购自江苏恩华药业有限公司)。正常对照组给予注射咪唑安定，
13、其时间与剂量同咪唑安定组；生理盐水组在相同时间肌肉注射等体积的生理盐水。1.4 听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)阈测试 所有动物均于噪声暴露前及暴露后立即测 ABR 阈值(丹麦产Keypoint)。10g/L 氯胺酮(0.5mg/kg)腹腔注射麻醉后，将气导耳机紧贴豚鼠耳廓，分别测定左右耳，记录电极置于豚鼠颅顶，参考电极置于刺激侧耳垂，地线绑于足部。刺激声为短声(click)，强度范围为 0120dB SPL，重复率为 19.4 次/min，平均叠加次数 1000 次，滤波带宽1005000Hz。每只豚鼠以能引出明确的可重复 III 波的最小刺激
14、声压级作为阈值。1.5 血清 SOD 活性和 MDA 含量测定 在噪声暴露前和噪声暴露第 3 天处死前，取豚鼠血约1mL，3000r/min 离心 30min，取血清-80冻存，待测。使用 MDA、SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)，按操作说明测定血清 SOD活性和 MDA 含量。1.6 耳蜗组织 ROS 含量的测定 噪声暴露第 3 天 ABR 测试后，立即将所有豚鼠断头处死。迅速取出双侧听泡，置于 4 PBS 液中，在显微镜下去除蜗壳，取出基底膜连带蜗轴，立即置液氮中，24h 后于-80冰箱保存，用于耳蜗组织 ROS 含量的测定。豚鼠断头处死到将耳蜗组织液氮冷冻的时间平均为 15
15、min，每只之间相差不超过 3min。1.6.1 耳蜗组织匀浆液的制备 自-80冰箱取出保存的豚鼠双侧耳蜗，置于微型玻璃匀浆器中，先加入 0.5mL 匀浆介质，于冰上研磨 15min 后倒入 1mL 的 EP 管中，再用0.5mL 匀浆介质冲洗玻璃匀浆器后倒入 EP 管中，于低温、4000r/min 离心 15min，取上清用于 ROS 含量的测定。1.6.2 耳蜗组织 ROS 含量测定 使用 ROS 测定试剂盒测定(南京建成生物工程研究所提供)。最佳取样量定为 2%，抑制率为 21.35%，符合抑制率在 20%50%的要求。将耳蜗组织匀浆用生理盐水稀释成 20mL/L，取 0.2mL 测定。
16、1.7 统计学处理 数据处理应用 SPSS13.0 统计软件包，所有数据经过正态性检验符合正态分布，数据以s 表示。噪声暴露前后组内比较采用配对 t 检验分析，组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析，两两比较采用 SNK-q检验，P0.05 为差异有显著性。2 结 果2.1 各组 ABR 阈移 噪声暴露前，4 组 ABR 阈值之间比较均无显著性差异(P0.05)。正常对照组和咪唑安定组动物噪声暴露后与噪声暴露前 ABR 阈值无显著性差异(P0.05)，而生理盐水组、噪声性聋组噪声暴露后 ABR阈值明显高于噪声暴露前(P0.01)。噪声暴露后，咪唑安定组的 ABR阈移明显低于生理盐水组和噪声性
17、聋组(P0.01)，正常对照组的 ABR阈移也显著低于生理盐水组和噪声性聋组(P0.01)。正常对照组和咪唑安定组之间、生理盐水组和噪声性聋组之间 ABR 阈移的差异均无显著性(P0.05，表 1)。表 1 各组豚鼠的 ABR 阈移（略）与噪声暴露前比较，*P0.01；与咪唑安定组比较，#P0.01；与正常对照组比较，P0.01。2.2 血清 SOD 活性和 MDA 含量变化 生理盐水组和噪声性聋组在噪声暴露后血清 SOD 活性明显下降(P0.05)，血清 MDA 含量则显著增高(P0.01)。咪唑安定组在噪声暴露后同样出现血清 SOD 活性下降和 MDA 含量升高，但其幅度明显小于生理盐水组
18、和噪声性聋组(P0.05)。正常对照组血清 SOD 活性和MDA 含量没有明显变化(表 2、表 3)。表 2 各组豚鼠血清 SOD 活性的变化（略）与噪声暴露前比较，*P0.05, *P0.01；与生理盐水组比较，#P0.05；与噪声性聋组比较，P0.05。表 3 各组豚鼠血清 MDA 含量的变化（略）与噪声暴露前比较，*P0.01；与生理盐水组比较，#P0.05；与噪声性聋组比较，P0.05。2.3 各组豚鼠耳蜗 ROS 含量的变化 咪唑安定组的 ROS 含量低于生理盐水组和噪声性聋组，正常对照组的 ROS 含量也低于生理盐水组(P0.05)。正常对照组和噪声性聋组之间、生理盐水组和噪声性聋
19、组之间 ROS 含量比较无显著性差异(P0.05，表 4)。表 4 各组豚鼠耳蜗 ROS 含量（略）与咪唑安定组比较，*P0.05；与正常对照组比较，#P0.05。3 讨 论ROS 指生物体内氧的某些代谢产物及其衍生的含氧的自由基。需氧生物体内均可产生活性氧，其具有独特的生理作用。细胞有许多抗氧化机制，可以分为酶类和非酶类物质。酶类物质包括 SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)；非酶类物质有很多，包括维生素 C、谷胱甘肽(GSH)、维生素 E 和甘露醇等。正常人体内 ROS 的产生与CAT、GSH-Px、SOD 等保护酶构成的内源性防御系统维持着动态平衡。只有当 R
20、OS 的产生与防御系统的一系列酶的清除作用失衡，ROS 的产生超过了机体的防御能力时，才会对机体造成损害。噪声性聋的机制是一个复杂的多因素过程,研究认为包括机械性、代谢性和血管性原因。耳蜗是有氧代谢非常旺盛的器官，产生大量 ROS，容易受到 ROS 的氧化损伤。声音的过分刺激能导致酶和代谢产物在毛细胞中的再氧化，产生活性氧产物。噪声可造成氧自由基对组织的损伤,直接破坏细胞膜成分,还可通过生物膜及亚细胞器损伤,在末梢组织造成广泛损害。脂质过氧化物还可抑制前列腺素(PGI2)的合成,引起血管收缩和凝血,进一步加重内耳缺血,致组织细胞变性坏死4。近几年来，已有利用维生素 E 与维生素 C 的抗氧化机
21、制来预防噪声性聋的相关报道5-6。自由基对细胞的损害在于攻击细胞膜脂质产生过氧化反应，MDA 则是自由基攻击生物膜引发脂质过氧化反应的产物，其含量可反映脂质过氧化的程度，间接反映细胞受自由基攻击和损伤的程度。体内自由基的清除依靠 SOD 等抗氧化酶系统，测定 SOD 活性可反映组织抗脂质过氧化能力。咪唑安定作为一种新型的非巴比妥类静脉麻醉药已广泛应用于临床。咪唑安定除了具有麻醉镇静作用外，由于其结构上与内源性抗氧化物维生素 E 相近，在生物体中作为供氢体与自由基反应生成苯氧基而清除自由基，具有一定的抗氧化作用。其抑制自由基介导的脂质过氧化作用可能是主要的抗氧化机制7。吴新文等8研究发现临床剂量
22、的丙泊酚和咪唑安定具有清除自由基的作用，增加机体抗氧化能力。咪唑安定能降低组织细胞代谢率9 ，经肝微粒体羟化作用而代谢，可消除体内的OH，可使由OH 引发的脂质过氧化反应减轻。本实验发现噪声暴露后豚鼠血清氧自由基反应代谢产物 MDA 含量明显升高，提示噪声环境下豚鼠血中自由基生成增加，势必影响到耳蜗组织中 MDA 含量，豚鼠听力受损程度与自由基对内耳的氧化损伤密切相关。同时，咪唑安定组血清 SOD 活性高于生理盐水组和噪声性聋组，说明咪唑安定可减少氧自由基生成，提高 SOD 活力，对自由基氧化引起的听力损害有预防和治疗作用。ABR 是反映听功能的一项客观指标。本实验的噪声条件可以使听阈提高 4
23、0dB 左右。由本研究结果可看出，长时间的强烈噪声暴露可引起听阈提高；而注射咪唑安定可起到防止听阈提高的作用，注射生理盐水对噪声性聋无预防作用。通过对耳蜗中 ROS 含量测定，证明咪唑安定有一定的抗氧化活性，可以抵抗体内过多的 ROS，对噪声性聋起到预防作用；生理盐水无抗氧化活性，故没有预防噪声性聋的作用。本实验证实长时间的强烈噪声暴露能引起听阈提高和耳蜗中 ROS含量增高，咪唑安定对噪声性聋有一定的预防作用，噪声性听力损失可能与 ROS 密切相关。这为耳科手术中使用电钻造成噪声性聋的预防提供了科学依据。目前研究还限于动物实验阶段，咪唑安定在临床应用上的剂量还有待于进一步探讨。【参考文献】1O
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