1、遗传性肌肉疾病的诊断方法和策略,方 琪苏州大学附属第一医院 副院长博士生导师、 教授、 主任医师,肌病分类,肌营养不良先天性肌病:中央轴空病、杆状体肌病、还原体肌病等遗传性包涵体肌病代谢性肌病糖原累积病脂质沉积病线粒体肌病内分泌性肌病炎性肌病其它继发于药物、毒物等,遗传代谢性肌病,获得性肌病,杆状体肌病,中央轴空病,皮肌炎：束周萎缩征,肌肉疾病的重要诊断方法,1、临床症状、体征 2、血生化检验3、电生理检查 4、肌肉MRI5、肌肉活检病理 6、基因检测,MRI目前主要在炎性肌病 的诊断和病情评估中有很好的应用。如多发性肌炎（PM）MRI表现：T1为等或低信号，T2为高信号,T1相为等信号,T2
2、相为高信号,肌活检适应症：肌肉疾病，脊髓前角或周围神经病，凡诉肢体无力、肌肉萎缩或肌肉疼痛者，都可送检,肌活检的适应症,肌源性：多发性肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎、肌痛综合症等；肌营养不良者，肌红蛋白尿等。,肌活检的适应症,神经源性：中枢性运动神经元病，脊髓性肌萎缩，青年单侧上肢远端肌萎缩（平山病）等 周围性恢复缓慢的GBS，糖尿病性周围神经病、Isaacs综合症（也称持续性肌纤维兴奋或神经性肌强直，已发现12号染色体基因突变，可导致周围神经钾离子通道异常，表现为肌肉疼痛、抽搐、痉挛，卡马西平对部分患者有效）,肌活检的适应症,代谢和内分泌性肌病：糖元沉积性肌病，脂肪沉积性肌病，线粒体肌病、甲亢性肌
3、病等中毒性和外伤性肌肉病变：肌活检可根据萎缩的程度，同型肌纤维群化的多少，判断受损神经和肌肉的病变程度、范围，并给出预后判断,NADH染色：同型肌纤维群组化,ATP染色（PH9.3）：选择性II型肌纤维萎缩,肌肉活检部位的选择,上肢重 选肱二头肌下肢重 选股四头肌外侧头肌下肢远端重 选腓肠肌和胫前肌躯干病变选腹直肌,肌肉活检部位的选择,肌源性病变：急性病变 选最重的部位，慢性病变 选4度肌力部位神经源性病变：要求取与中枢或周围神经支配相一致的节段，以保证查到病变,肌肉活检部位的选择,避免选取肌电图、针灸针刺或肌肉注射损伤部位，遗留的纤维结缔组织对损伤的修复易误诊为局限性肌病,取材后制片,液氮快
4、速冷冻恒冷箱切片零下20左右厚度8-10um，5-10张备作常规、酶组织或免疫组化染色,肌纤维类型的组织化学和酶组织化学区别 组织化学 型肌纤维 a型肌纤维 b型肌纤维 HE 深红 红 红肌球蛋白ATP酶 预培育液pH 9.4 +（淡色） + （深色） + （深色） 预培育液pH 4.6 + + + （中间）NADH-TR + + +SDH + + +MGT + + +PAS + + +油红O / 苏丹黑 + 肌磷酸化酶 + + +,型肌纤维也叫红肌纤维、慢缩肌纤维，耐力好，主要在维持姿势中起作用；型肌纤维也叫白肌纤维、快缩肌纤维，爆发力好，主要在运动中起作用；,各种染色方法的作用,HE染色下
5、型肌纤维呈深红色，型肌纤维呈淡红色；好的HE染色片可以看到不同的肌组织结构，是病理诊断的可靠依据。 ATP酶染色法可以很好的区分两型肌纤维，预培育液PH4.6时，型肌纤维呈深色，型肌纤维呈淡色。,各种染色方法的作用,琥珀酸脱氢酶（SDH）染色，此酶定位于线粒体，线粒体肌病时，活性增高。 改良Gomori三色染色对各种特征性肌病有重要价值，如线粒体肌病中可见破碎红纤维；杆状体肌病中可见杆状小体；周期性瘫痪或先天性肌强直症中出现红染的肌小管聚集,各种染色方法的作用,PAS染色可观察和研究肌糖原累积病中糖原的含量及分布油红O染色主要用于显示中性脂肪，能将较小的脂肪滴显示出来，诊断脂质沉积性肌病,肌肉
6、病的病理诊断中，除了酶组织化学染色，免疫组织化学染色 也起到非常重要的作用,Dystroglycan:抗肌萎缩蛋白糖蛋白复合物； Dystrophin：抗肌萎缩蛋白；Dysferlin：肢带型肌营养2B不良相关蛋白；Calpain：钙蛋白酶； Laminin：层粘蛋白,比如大家熟知DMD表现为：Dystrophin蛋白缺失,Dystrophin缺失,Dystrophin存在,Dystrophin部分缺失,DMD,BMD,正常,肢带型肌营养不良2B型表现为：Dysferlin蛋白缺失,Dysferlin缺失（LGMD2B）,Dysferlin存在（LGMD2A）,病理诊断在肌肉病诊断中意义重大，
7、但有一定创伤性；且病理诊断在某些情况下不能做出准确诊断： 1、病理表现类似的肌病，如表现为肢带型肌营养不良综合症的各种肌病； 2、遗传咨询或遗传干预，需要依靠准确的基因诊断； 3、部分症状前诊断。,近20年余来基因诊断技术与方法日新月异。拿DMD来说，自从1987年KOENIG等人克隆了整个DMD基因14kb的cDNA开始，DMD基因检测取得了突破性进展,之后，基因检测技术不断进步。如Southern blotting、PCR、多重PCR、荧光原位杂交（FISH）、限制性片段长度多态性连锁分析（RFLP） 、多重连接探针扩增技术（MLPA）、基因芯片等。,随着测序技术的进步，尤其是二代测序的出
8、现，许多以往检测不到的点突变以及未知的新突变都能得到解决。并且，二代测序较一代sanger测序而言，有费用更低、通量更高、速度更快的优点。,部分遗传肌肉病及相关基因,病例分析,例1,7岁男孩行走不稳进行性加重5年余。足月顺产，1岁半会走，易跌倒否认家族史。查体：屈颈3；四肢近端4，远端5。腓肠肌假肥大Gower征（）辅检：CK 12800 U/L；肌电图肌源性损害。临床诊断：DMD?,患者,对照,Dystrophin,HE,杜氏肌营养不良(DMD),例1,患者肌肉HE染色显示：肌纤维大小明显不等，小纤维多呈圆形，可见坏死伴吞噬及再生纤维。肌间质增生明显。免疫组化显示：Dystrophin完全缺
9、失。,杜氏肌营养不良(DMD),多重PCR结果：可见1号样本45、47、48、50、51外显子缺失，基因诊断明确,DMD/BMD,发病率高：占出生男婴的20-30/10万，中国每年新增2000例。遗传方式特殊：为X-连锁隐性遗传。主要是男孩发病。激素治疗可改善，但无特效治疗，易诊断遗传咨询意义重大,DMD不同检测方法比较,1、多重PCR-目前很少用2、多重连接探针扩增技术(MLPA)-适用缺失重复（65%）- ￥ 2000-30003、一代测序(Sanger测序)-适用点突变和小的插入和缺失（33-34%）-￥6000-100004、DMD -NGS-适用缺失重复和点突变（98%）- ￥ 40
10、00-6000,二代测序技术(NGS)在DMD/BMD诊断中已经可以很好的应用了。,二代测序技术可以一次性检测DMD相关几乎所有突变,临床症状、体征、家族史、血生化（肌酶、甲功、乳酸、血糖、免疫、酶、代谢物等）,肌肉MR肌电图,肌肉活检病理,基因检测,某些单基因遗传肌病可以直接进行基因检测,例2,23岁女性。进行性四肢无力4年。父母近亲婚配，其弟有类似病史。查体抬头肌力5，双上肢3-4-4-5，双下肢3-4-4-4翼状肩，跟腱挛缩。辅检CK3000-4000u/LEMG：肌源性损害。临床诊断：？,例2,肢带型肌营养不良(LGMD2A),HE,Dysferlin,免疫组化显示Dysferlin存
11、在。Western Blot 提示Calpain3完全缺失,基因检测发现CAPN3存在致病突变：该基因2号外显子对应的编码区第25位碱基有CT的突变；20-25号外显子有缺失。通过多重连接探针扩增技术(MLPA)验证患者父母，确定突变不在同一染色体。,肢带型肌营养不良症2A型是一种常染色体隐性遗传病，由钙蛋白酶3（calpain-3）缺乏引起的，是肢带型肌营养不良症的常见类型。发病年龄2-40岁，临床主要表现为肩甲带肌、骨盆带肌的无力和萎缩。,肢带型肌营养不良(LGMD2A),肢带型肌营养不良症基因相关研究近年进展迅速,LGMD2A,国外有学者认为对于LGMD2A诊断，只有基因检测才是可靠的。
12、,LGMD2A型,1、LGMD2A型的致病基因CAPN3， CAPN3(Calpain3)是钙蛋白酶基因家族的成员之一,有2个变异剪接体,CAPN3a(p94)全长约50kb,含有24个外显子,预测的多肽链含有821个氨基酸残基,分子量为94kd。2、在国外最常见的肢带型肌营养不良，在中国为第二常见。3、因为CAPN3是个钙蛋白酶，很多突变，引起蛋白功能丧失，但不引起蛋白表达量的变化，所以部分患者用免疫组化或者WB 都无法确定是否存在问题。4、国外对于2A诊断，基因检测为金标准。,根据100例临床排除DMD和LGMD2B的病例检测结果中，临床最容易漏检的肢带肌营养不良为LGMD2A。这主要因为
13、CAPN3基因编码的是个酶，很多功能的丧失不是表达量降低而是酶活性降低，这个通过免疫组化或者Western都无法检测，这个论据在国外报告的文章也得到充分支持。,对非典型肢带型肌营养不良症（肌活检排除DMD及LGMD2B），二代测序技术能进一步提高检出率。,例3,25岁女性。进行性四肢近端无力4年。激素治疗似有效，但近来自觉症状有加重。查体柯兴面容。抬头3+，双上肢3-4-4-5，双下肢3-4-4-5。双下肢后群肌明显萎缩。辅检：肌酶：CK 4000-20000 U/LEMG：肌源性损害肌肉活检（外院）（股四头肌）急慢性炎症临床诊断：？,HE：多发性肌炎？其他？,例3,HE,Dysferlin,
14、肢带型肌营养不良(LGMD2B),免疫组化显示Dysferlin缺失Western Blot 提示Dysferlin完全缺失,LCA(抗白细胞共同抗原抗体)阳性提示白细胞浸润,免疫病理学改变可作为炎性肌病与肢带型肌营养不良2B的鉴别CD8/MHC-I复合体被认为多发性肌炎的炎性标志性免疫病理学改变,CD8/MHC-I复合体双标记,肢带型肌营养不良(LGMD2B),1、几乎所有的2B型，通过活检均能明确（取决于活检水平）。2、DYSF基因巨大（55外显子），一代测序很难解决。3、在一些远端损害为主的病人，DYSF的活检很多时候不典型。4、临床明确的2B 型，在基因层面几乎都能找到双杂合突变点，而
15、且大部分明确报道过的突变位点（临床符合度大于95%）。,肢带型肌营养不良2B型,临床确诊LGMD2B。测序发现DYSF基因49号外显子对应5512位碱基发生AT突变； 7-43号外显子存在重复。多重连接探针扩增技术 (MLPA)确证DYSF重复存在，同时验证患者父母，确定突变不在同一染色体。,肢带型肌营养不良2B基因检测问题,DYSF基因巨大，所以部分非2B患者，也常能检测到单杂合的突变，存在假阳性问题。A、临床符合，可建议患者进行肌肉活检确认。B、临床不符合：考虑可能为非致病突变。因此，在肢带型肌营养不良2B的诊断中仍需依靠肌肉活检。,临床症状、体征、家族史、血生化（肌酶、甲功、乳酸、血糖、
16、免疫、酶、代谢物等）,基因检测核磁共振、电生理等,肌肉活检病理检查,建议部分单基因遗传肌病诊断流程,例4,47岁男性。进行性四肢乏力3月。3个月前爬山时感双小腿酸胀，持续4-5天缓解。2周后再次出现四肢无力、酸胀，外院查CK 11171480 U/L。无茶色尿。否认家族史。查体抬头、四肢近端肌力5，腱反射（+）。辅检CK 1308 U/L，LDH 668U/LEMG+NCV：肌源性损害临床诊断：？,例4,脂质沉积病,HE,ORO,HE染色显示：肌纤维大小轻度不等，肌纤维形态不规则，部分肌纤维内可见大小不等的空泡及裂隙形成，可见坏死伴吞噬现象，肌间质轻度增生。油红O染色显示：多数纤维脂滴含量明显
17、增多。,ETFTH报道与脂质沉积性肌病相关，为常染色体隐性遗传，理论上必须有两条染色体上都出现致病性突变才有可能致病。该样本在此基因发现两处杂合突变：2号外显子对应的109位碱基发生GA突变； 154位碱基发生CG突变；并验证不在同一条染色体。已有文献报道此两突变为致病性突变。 chr4-159603421，c.109GA参考文献：Liang.Neuromuscul Disord. 2009. chr4-159603466，c.154CG，参考文献：Chien.JIMD Rep.2013.,例5,28岁女性。反复咳嗽、咳痰3月，下肢浮肿1月。自幼运动受限。父母为近亲结婚。查体：呼吸肌无力， 存
18、在睡眠呼吸暂停。四肢近端肌力减退。辅检：CK 500-7000u/L心超：右房、右室增大，左心心肌稍厚。临床诊断：？,例5,糖原累积病,HE,PAS,HE染色显示肌纤维中出现空泡状改变，空泡大小不等；PAS染色深染，分布不均。,GAA基因报道与糖原累积性肌病2型相关，为常染色体隐性遗传，理论上必须有两条染色体上都出现致病性突变才有可能致病。该样本在此基因发现两处杂合突变：6号外显子对应的995位碱基发生CA突变； 11号外显子对应的1634位碱基发生CT突变；并验证不在同一条染色体。已有报道为致病突变。,例6,19岁女性。右眼睑下垂8年，左眼睑下垂伴眼球固定5年余。 07年外院CT提示前纵隔影
19、增宽，考虑胸腺增生，曾予胸腺放疗，症状无缓解。查体双睑下垂，93点，眼球固定，疲劳试验（），闭目闭唇稍差，抬头4，双上肢近端4，远端5，双下肢近端4，远端5，腱反射，无明显肌萎缩。辅检CK 68 U/L。EMG：肌源性损害临床诊断：?,例6,慢性进行性眼外肌麻痹（CPEO）,HE,MGT,HE染色显示：肌纤维大小明显不等，小纤维多呈不规则形；偶见散在坏死伴吞噬现象；未见炎细胞浸润。MGT染色显示：可见较多破碎红纤维(RRFs) 。,线粒体病的电镜表现：线粒体肿胀、大小不一,线粒体基因（mt-DNA）发现片段缺失,临床症状、体征、家族史、血生化（肌酶、甲功、乳酸、血糖、免疫、酶、代谢物等）,肌肉
20、MR肌电图,肌肉活检病理,基因检测,糖原累积病、脂质沉积病、线粒体肌病等都需要肌肉病理结合基因检测,小结：遗传性肌肉病相比于其他遗传病利用基因检测确诊优势,1、虽然基因众多，但每类疾病对应的高发基因很集中。（LGMD-DYSF，脂质沉积症-ETFDH）2、临床常见基因的突变位点研究很清楚，哪些突变致病不致病已经基本清楚，可以很好的利用基因结果预测致病性。3、肌肉病很多基因巨大，用一代测序无法检测，且很多基因，像DMD、SMA的突变均是以缺失重复突变为主，用一代测序无法解决，二代测序可以同时解决点突变和缺失重复问题。4、活检检查方法复杂（方法准确度依赖人员熟练程度），且有创，同时对于大部分中心，
21、接触的病人较少，不具有成本优势。,肌肉病理阳性（DMD、LGMD2B、ETFDH、GAA etal）,肌肉病理阴性（LGMD2A etal）,不能取得肌肉病理,神经肌肉基因组套检测,肌损是否与遗传相关？,阳性,不确定,阴性,重新进行临床评估及相关检查,临床确认,临床不确定,全外显子测序,神经肌肉病基因检测建议,注1：肢带型肌营养不良综合征：MYOT、LMNA、CAV3、DES、DNAJB6、TNPO3、HNRNPDL、CAPN3、DYSF、SGCG、SGCA、SGCB、SGCD、TCAP、TRIM32、FKRP、POMT1、ANO5、FKTN、POMT2、POMGNT1、DES、TRAPPC1
22、1、DAG1、GMPPB、DPM3、ISPD、DMD、GAA注2：先天性肌营养不良：LAMA2、FKRP、COL6A1、COL6A2、COL6A3、DNM2、TCAP、POMT1、POMT2、POMGNT1、FKTN、GMPPB、SEPN1、FHL1注3：先天性肌病：TPM3、NEB、ACTA1、TPM2、TNNT1、KBTBD13、CFL2、KLHL40、RYR1、DNM2、BIN1、CCDC78、MTM1、SEPN1、MYH7、MYH2、FHL1、TRIM32注4：糖原累积症：GAA、AGL、GBE1、PYGM、PFKM、PHKA1、PGM1、GYG1、GYS1、LAMP2、LDHA、EN
23、O3、PGAM2、ALDOA注5：脂肪酸代谢障碍：SLC22A5、SLC25A20、CPT2、CPT1A、ACADS、ACADM、ACADL、ACAD8、ACADVL、MLYCD、ABHD5、LPIN1、HADHA、HADHB、ETFA、ETFB、ETFDH、PNPLA2注6：线粒体肌病：ADCK3、COQ2、COQ6、COQ9、ETHE1、PAT、PDSS1、PDSS2、POLG、RBCK1、TK2注7：离子通道病：CAV3、CLCN1、SCN4A、CACNA1S、KCNE3、KCNA1、KCNJ18、KCNQ1、KCNJ2、KCNJ16、SCN1A注8：远端型肌病：DYSF、GNE、MYH7、DES、CRYAB、MYOT、MYH2、TIA1、MYOT、NEB、CAV3、LDB3、ANO5、DNM2、VCP,谢 谢！,
