1、本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境用16SRRNA基因对九种蟹系统学分析一、选题的背景与意义蟹是十足目（DECAPODA）短尾次目的甲壳动物，尤指短尾族（BRACHYURA）的种类（真蟹），也包括其他一些类型，如歪尾族（ANOMURA）的种类。常见的有关公蟹、梭子蟹、溪蟹、招潮蟹、绒螯蟹等属，总共约4500种，见于所有海洋、淡水及陆地。通常以步行或爬行的方式移动。蟹类通常为杂食性，多食腐，有些能与其他动物共生。蟹类中可供使用的主要有三疣梭子蟹、远海梭子蟹、青蟹和中华绒螯蟹等，具有较高的营养价值。蟹壳可用以提炼工业原料甲壳素，也可提制葡糖胺。有些蟹类可作中药用。蟹幼体或成体可作饲饵或饲料
2、。所以蟹类具有很好的经济价值和市场开发力。几乎所有蟹类的幼体刚从卵中孵出时外形与成体完全不同。幼体成为水蚤状幼虫，体微小，同名，圆形，无肢体，在海面上游泳。脱皮几次后体型开始增大，成为大眼幼体，这时身体及肢体才更像蟹，再脱皮一次外形方似成体。所以在蟹幼体时，肉眼很难辨别其种类，但很久以来，关于海洋动物的分类及系统进化关系研究仍局限于对其形态学和细胞学方法。由于形态学和细胞学特征往往是基因表达的结果，可比较的分类信息较少且易受到环境等多种因素影响，所以关于包括蟹在内的许多水生动物的分类及系统进化关系一直是困扰人们的难题。自20世纪60年代以来，蛋白质和DNA等信息大分子被广泛应用于生物系统学研究
3、，克服了在利用形态学和细胞学方法对海洋动物做分类和系统进化研究时的诸多缺点，消除了很多海洋动物分类和系统进化研究中的争议，极大地促进了海洋动物分子系统学的发展。DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受环境、生物发育阶段及器官组织的影响，因而能较为准确地反映出各个物种间的系统发生关系。而在这其中，线粒体DNA（MTDNA）的优势又更加明显。其具有母系遗传、变异大、无组织特异性等优点，且检测方便，因而在动物的分类、遗传变异分析和系统进化等领域应用广泛。其中尤以编码线粒体细胞色素C氧化酶亚基1（CYTOCHROMECOXIDASESUBUNITI，简称COI）和16SRRNA基因在动物分子系统学的研究
4、中应用最为广泛。截止到目前为止，国内外报道的利用C0I和16SRRNA基因对生物做系统学分析的文章数量很多，但是所用的实验材料也是涉及了多个种类的生物，其范围很广，另外，同时结合C0I和16SRRNA基因研究方法的文章也不多，大部分是针对其中一种方法的研究。比如，有基于16SRRNA基因序列多样性利用指纹方法构建微生物的分类和识别系统（1999，RAGHAVAGPS，SOLANKIR，SONIVETAL）；利用对虾属线粒体DNA基因序列构建其系统发生关系和演化史（2001，SHANELAVERY，TYCHAN，YKTAM,ETAL）；利用C0I和16SRRNA基因对扇贝的遗传变异的研究（200
5、5，PEREZFARFANTEI,KENSLEY）；比较COI和SSURDNA序列分析原生动物的多样性以及其在系统生物学上的关系（2010，THIERRYJHEGER,JANPAWLOWSKI,ENRIQUELARAETAL）。国内的相关研究成果也有很多，其实验对象涵盖了脊椎和无脊椎动物的大部分种类，从原生动物到哺乳动物均有见报，但是作蟹类的系统学分析较为少见，也有一些用蟹做的研究，但都局限于某一种属的蟹类之间的比较。如，吉鹏宇等做了六种青蟹群体的线粒体16SRRNA和COI基因部分序列差异的研究（2008）；有对三疣梭子蟹线粒体DNA16SRRNA和COI基因片段序列的比较研究（郭天慧，孔晓
6、瑜，陈四清等，2004）；相手蟹属两种蟹类线粒体16SRRNA基因序列的比较（徐敬明，张俊丽，方华华等，2006）等等诸如此类的分析报道。迄今为止，对不同种类的蟹进行分子生物学方法的系统发育分析还不多见，本实验采用的实验材料就包括了不同种类的蟹，相信可以给日后的蟹种间的差异分析提供一些参考数据和理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）研究的基本内容1实验样品几种蟹类的采集和购买；2对样品进行一系列分子生物学处理，主要包括线粒体DNA的提取、PCR扩增和产物纯化、测序、数据分析以及系统发育树的构建；3得出最终结论，形成论文。（二）拟解决的主要问题通过对几种蟹类的线粒体基因（COI基因
7、）和16SRRNA的序列等相关问题的研究，并构建系统发育树，从而弄清这几种蟹类的在系统发育上的关系，进一步实践分子生物学手段在生物种类鉴别和系统发育研究上的优势。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1形态学辨别将采集来的蟹类样品做形态学上的初步判别种类为下一步的分子生物学处理和判断做辅助准备；2分子生物学方法研究首先对样品进行取样，然后用酚抽提法提取基因组DNA，然后在PCR反应体系中扩增基因片段，接着利用纯化试剂盒将扩增产物纯化，再将产物进行序列测定，得到的数据经过分析后进行系统发育树的构建和遗传距离的计算等工作，最后总结得出结论。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度2010920101
8、2毕业论文选题20101220111撰写文献综述和开题报告，进行开题答辩，进行文献查阅和资料收集，制定具体研究计划和实施方案，实验器材的准备及熟悉基本的实验操作2011120113具体进行实验2011320114数据和材料的整理分析，得出结论，完成毕业论文2011420115论文提交并答辩五、主要参考文献1陈丽梅,孔晓瑜,喻子牛,等3种蛏类线粒体16SRRNA和C0I基因片段的序列比较及其系统学初步研究A海洋科学,2005,29827322陈子安,杜晓东,王庆恒,等3种星虫线粒体16SRRNA、C0I和CYTB基因片段的序列比较A广东海洋用C0I和16S基因对蟹类系统学分析测序数据分析绘制系统
9、发育树和计算遗传距离PCR扩增和纯化基因组DNA的提取分子生物学手段研究文献资料的查阅试验器材的准备形态学研究大学学报,2007,2743103陈丽梅,李琪,李赟4种海参16SRRNA和C0I基因片段序列比较及系统学研究A中国水产科学,2008,1569359424毕相东,杨雷,侯俊利,等C0I基因在海洋动物分子系统学研究中的应用C水产科学,2008,2721051085孙红英,周开亚,杨小军从线粒体16SRRNA序列探讨绒螯蟹类的系统发生关系动物学报,2003,4955925996雷忻,廉振民,雷富民,等基于线粒体C0I基因探讨鹟亚科部分属和种的分类地位A动物学研究,2007,2832912
10、967孔晓瑜,姜艳艳,相建海,等魁蚶线粒体16SRRNA和C0I基因片段序列测定及其应用前景海洋科学,2001,251246488吉鹏宇,沈琪,唐小林,等六个青蟹群体的线粒体16SRRNA和C0I基因部分序列差异A海洋湖沼通报,2008,69779郑文娟,朱世华,沈锡权,等泥蚶线粒体16SRRNA和C0I基因片段序列研究A宁波大学学报（理工版）,2008,211394210郭天慧,孔晓瑜,陈四清,等三疣梭子蟹线粒体DNA16SRRNA和C0I基因片段序列的比较研究A中国海洋大学学报,2004,341222811李莉好,喻达辉,黄佳菊,等三种海豚线粒体C0I基因的序列分析J动物学杂志,2007,
11、423202712邱高峰,徐巧婷,王丽卿,等四种绒螯蟹分子分类与系统发育J动物学报,2001,47664064713潘宝平,吴琪,张素萍,等文蛤属16SRRNA基因及ITS1序列的系统学分析海洋与湖沼,2006,37434234714徐敬明,张俊丽,方华华,等相手蟹属两种蟹类线粒体16SRRNA基因序列的比较A水产科学,2006,25944344715徐琰,宋林生,李新正用16SRDNA序列初步探讨部分真虾类的系统发育关系A海洋科学,2005,299364116孙红英,周开亚,陆健健,等中国大陆绒螯蟹线粒体16SRDNA序列变异与分子鉴定标记自然科学进展,2002,12548549017马凌波
12、,张凤英,乔振国,等中国东南沿海青蟹线粒体C0I基因部分序列分析A水产学报,2006,30446346818麦维军,谢珍玉,张吕平,等中国明对虾与5种虾类线粒体16SRRNA和C0I基因片段的序列比较及其系统学初步研究A海南大学学报自然科学版,2009,271152319郭奕慧,喻达辉,黄佳菊,等中国主要养殖罗非鱼亲缘关系的C0I序列分析A华中农业大学学报,2009,281757920孔晓瑜,喻子牛,刘亚军,等中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体C0I基因片段的序列比较研究青岛海洋大学学报,2001,31686186621THIERRYJHEGER,JANPAWLOWSKI,ENRIQUELARA,E
13、TALCOMPARINGPOTENTIALC0IANDSSURDNABARCODESFORASSESSINGTHEDIVERSITYANDPHYLOGENETICRELATIONSHIPSOFCYPHODERIIDTESTATEAMOEBAEARTICLEINPRESS,2010,31222ZHANGQINGYI,CHENGQIQUN,GUANWEIBINGMITOCHONDRIALC0IGENESEQUENCEVARIATIONANDTAXONOMICSTATUSOFTHREEMACROBRACHIUMSPECIESZOOLOGICALRESEARCH2009,30661361923LUOJ
14、IACONG,XIAOYONGSHUANG,SONGLIN,ETALPHYLOGENETICSEPARATIONOFLANCELETSINCHINAREVEALEDBYMITOCHONDRIALC0IANDCYTBGENEANALYSISSOUTHCHINAFISHERIESSCIENCE,2007,3281424BUCKLINA,GUARNIERIM,HILLRS,ETALTAXONOMICANDSYSTEMATICASSESSMENTOFPLANKTONICCOPEPODAUSINGMITOCHONDRIALC0ISEQUENCEVATIATIONANDCOMPETITIVE,SPECIE
15、SSPECIFICPCRJHYDROBIOLOGIA,199940123925425MONICAM,EMESTOW,ALINAMSEXAMINATIONOFTHEMONTASTRAEAANNULARISSPECIESCOMPLEXUSINGIFSANDC0ISEQUENCESJMARBIOTECHNOL,199918997毕业论文文献综述海洋生物资源与环境用C0I和16S基因对蟹类系统学分析的综述研究摘要蟹类是水产养殖中的重要经济物种，分布广泛，咸淡水中都有很高的物种丰度，具有一定的经济价值。但由于从形态学和细胞学上对其分类有一定的难度，所以利用分子生物学手段鉴定其种类，研究其系统发育情况已经
16、成为主流。本文将重点探讨国内外研究人员利用C0I和16S基因对生物（尤其是蟹类）进行系统学分析的发展情况。关键词蟹类；生物学特性；C0I和16S基因；系统学分析很久以来，关于海洋动物的分类及系统进化关系研究仍局限于对其形态学和细胞学方法。由于形态学和细胞学特征往往是基因表达的结果，可比较的分类信息较少且易受到环境等多种因素影响，所以关于包括蟹在内的许多水生动物的分类及系统进化关系一直是困扰人们的难题。自20世纪60年代以来，蛋白质和DNA等信息大分子被广泛应用于生物系统学研究，克服了在利用形态学和细胞学方法对海洋动物做分类和系统进化研究时的诸多缺点，消除了很多海洋动物分类和系统进化研究中的争议
17、，极大地促进了海洋动物分子系统学的发展。蟹类作为重要的水产养殖物种，一直以来也是广大科研工作者重点研究的对象。本文将从多角度解析利用分子生物学手段（主要是利用C0I和16S基因）对生物进行系统发育学的研究进展，并简要阐述该研究的发展动向和趋势，以及存在的一些问题。1蟹类生物学特性11简介蟹是十足目（DECAPODA）短尾次目的甲壳动物，尤指短尾族（BRACHYURA）的种类（真蟹），也包括其他一些类型，如歪尾族（ANOMURA）的种类。常见的有关公蟹、梭子蟹、溪蟹、招潮蟹、绒螯蟹等属，总共约4500种，见于所有海洋、淡水及陆地。通常以步行或爬行的方式移动。蟹类通常为杂食性，多食腐，有些能与其他
18、动物共生。12分布范围大部分蟹类生活于海中，甚至热带国家数量丰富的陆蟹，也不时到海里活动，其生命的早期也在海中度过。世界大部分温暖地区都有丰富的淡水蟹资源，例如南欧长于河水中的春蟹（POTAMONFLUVIATILE）。蛙蟹科、馒头蟹科、玉蟹科、梭子蟹科、扇蟹科主要生活在沿岸带；方蟹科、沙蟹科生活在广阔的潮间带。极少数如漂泊蟹和弓腿蟹能附着在木材或其他漂浮物上生活。也有不少种类与其他动物营共栖生活，如绵蟹科，关公蟹科。许多种如豆蟹常潜入一些软体动物的外套腔中、或多毛类的管道中共栖。一小部分蟹类完全在淡水中生长繁殖，它们多栖息于山区溪流的石块下。还有少数蟹类如地蟹能适应陆地生活，穴居于潮湿的泥洞
19、中，繁殖时期则迁移下海。13形态特征蟹的身体分为头胸部与腹部。头胸部的背面覆以头胸甲，形状因种不同而不一样。额部中央具第1、2对触角，外侧是有柄的复眼。口器包括1对大颚，2对小颚和3对颚足。头胸甲两侧有5对胸足。腹部退化，扁平，曲折在头胸部的腹面。雄性腹部窄长，多呈三角形，只有前两对赴肢变形为交接器；雌性腹部宽阔，第25节各具1对双枝型附肢，密布刚毛，用以抱卵。14经济价值蟹类中可供使用的主要有三疣梭子蟹、远海梭子蟹、青蟹和中华绒螯蟹等，具有较高的营养价值。蟹壳可用以提炼工业原料甲壳素，也可提制葡糖胺。有些蟹类可作中药用。蟹幼体或成体可作饲饵或饲料。所以蟹类具有很好的经济价值和市场开发力。2C
20、0I和16S基因在生物分子系统学研究中的应用DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受环境、生物发育阶段及器官组织的影响，因而能较为准确地反映出各个物种间的系统发生关系。而在这其中，线粒体DNA（MTDNA）的优势又更加明显。其具有母系遗传、变异大、无组织特异性等优点，且检测方便，因而在动物的分类、遗传变异分析和系统进化等领域应用广泛。其中尤以编码线粒体细胞色素C氧化酶亚基1（CYTOCHROMECOXIDASESUBUNITI，简称COI）和16SRRNA基因在动物分子系统学的研究中应用最为广泛。21在动物系统发育重建中的应用利用C0I和16S基因片段键的DNA序列差异性构建的分子系统树已经解决
21、了很多动物之间的系统发生关系。鹟亚科（MUSCICAPINAE）隶属于雀形目鹟科，在全世界分布有328种。目前国内外对鹟亚科的分类系统很不统一。2007年报道，雷忻等人采用PCR扩增、测序的方法，对鹟亚科6属16种鸟类的线粒体COI基因序列1176BP进行测定，并以荒漠伯劳和发冠卷尾作为外群构建BAYES、ML、MP3棵系统发育树。结果支持寿带属、扇尾鹟属、方尾鹟属3属于鹟亚科其他鸟类亲缘关系较远，扇尾鹟属于方尾鹟属亲缘关系较近，鹟属为单系发生。该结论解决了鹟亚科部分属间的进化关系，为鹟亚科分类系统的研究提供了分子水平证据。蛏类在食用贝类中占有相当重要的地位，基于形态性状学对蛏类的分类存在某些
22、不同观点，齐钟彦将3钟蛏归为竹蛏科（SOLENIDAE），分属竹蛏属（SOLEN）和刀蛏属（CULTELLUS），而徐凤山则主张将长竹蛏（SOLENSTRICTUS）、大竹蛏（SOLENGRANDIS）分为竹蛏科并将刀蛏属提升为刀蛏科。针对这一争议，陈丽梅等以C0I基因片段作为分子标记初步研究了大竹蛏、长竹蛏和小刀蛏（CULTELLUSATTENUATUS）之间的分子系统进化关系，统计数据结果显示大竹蛏与长竹蛏的遗传距离为01712，而两竹蛏类与小刀蛏的遗传距离分别为02662和02933，可见小刀蛏与竹蛏之间的遗传距离已达到科之间的水平，所以陈丽梅等支持将其提升为刀蛏科的分类观点。这一结论得
23、到了基于16SRRNA片段序列的聚类分析结果的支持，从而解决了存在争议的几种蛏类的分类及相互亲缘关系问题。此外，陈丽梅还用海参做了类似的实验，结果也支持这一结论。星虫营穴居生活，主要分布与河口、港湾及沿岸地表径流较丰富的泥沙或沙泥滩涂，我国沿海均有分布。其自然分布密度高，适应范围广，抗逆性强，生长快，活动范围小，是发展增养殖的理想品。目前，对星虫动物演化地位的确定存在争议。针对这一问题，陈子安等对三种星虫16SRRNA和C0I基因片段序列进行比较，并对其系统发生进行了初步探讨。数据结果支持3种星虫和环节动物的分类地位较近，与软体动物较远的分类观点。其他一些科研工作者也做了很多工作，比如，孔晓瑜
24、等人用该方法验证了中日韩三国几种魁蚶种间的距离已达到了亚种，甚至种的水平。郑文娟等人也通过实验证明16SRRNA和C0I基因可以作为研究泥蚶不同地理群体的遗传变异、多样性评估、亲缘关系等方面的很好的分子标记，也可以应用于品种的鉴定、资源保护和利用、遗传育种等方面。类似的实验，还用到了海豚、沼虾、文蛤、真虾、对虾、文昌鱼以及罗非鱼等生物。22在动物遗传多样性研究中的应用动物遗传多样性的研究对揭示动物表型多样性的本质及建立动物种质资源库的工作具有非常重要的意义。总体来说，该工作还处于起步阶段。具有代表性的工作是关于梭子蟹的研究。梭子蟹是我国重要的海洋经济蟹类，做好梭子蟹科种质资源的保护及可持续开发
25、及利用具有非常重要的意义，因而梭子蟹明确科内各属的系统进化关系是当务之急。郭天慧等对三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）线粒体C0I基因片段分析发现其种内变异较低，在3个样本中C0I基因片段有比较多的插入或缺失，同源性为372，进而奠定了以C0I基因片段研究梭子蟹遗传多样性的理论基础。此外，吉鹏宇等人，对从广东阳江，广东吴川，广东珠海，福建东山，海南海口，海南三亚等六地区采集的六个青蟹群体进行分子遗传变异差异的研究，结果表明东山等六地青蟹群体根子遗传背景基本相似。23在蟹类中的研究除了上述的两项实验，分子生物学手段研究系统发育关系，在蟹类中的其他的研究也比较多。绒螯蟹是
26、世界范围内重要的经济蟹类，长期有关于绒螯蟹的分类地位争议很大，尤其是新绒螯蟹属（NEOERIOCHEIR）和和平绒螯蟹属（PLATYERIOCHEIR）的有效性问题。针对以上问题，TANG等采用C0I基因片段探究了东亚地区的绒螯蟹属系统进化关系，采用NJ和ML法的聚类分析结果支持新绒螯蟹属为一个独立的属，而直额绒螯蟹都是绒螯蟹属所有其他成员的姐妹群，因而不支持平绒螯蟹属是一个有效的属。国内也有学者做过类似的研究。邱高峰等利用PCR技术，扩增了中华绒螯蟹、独额绒螯蟹线粒体16SRRNA片段，经测序，与GENBANK数据库中的日本绒螯蟹和台湾绒螯蟹16SRRNA同源序列进行比较。结果表明，中华绒螯
27、蟹与日本绒螯蟹亲缘关系最近，然后与台湾绒螯蟹聚为一支，独额绒螯蟹则成为相对独立的一支。此外，孙红英等人做了中国大陆绒螯蟹线粒体16SRRNA序列变异与分子鉴定标记工作；孔晓瑜进行了中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体C0I基因片段的序列比较研究。此外，徐敬明等测定了相手蟹属红螯相手蟹与褶痕相手蟹线粒体16SRRNA基因部分片段的序列，结果表明，分布与中国的3种相手蟹种，无齿相手蟹和红螯相手蟹的亲缘关系最近，而它们与褶痕相手蟹的亲缘关系则较远。3展望线粒体基因以其特殊的组成结构和演化方式在生物分子系统学的研究中具有不可取代的作用，并已经广泛地应用与海洋动物的分类、系统进化和遗传多样性等方面的研究中。但该
28、方法也有一定的局限性。由于C0I基因本身为中度保守序列，即在同一种下不同群体之间序列变异非常小，所以在利用C0I基因研究种以下分类阶元的不同群体之间的系统进化关系时，必须辅助以其他分子标记才能确立同一种下不同群体之间的亲缘关系。总体来说，迄今为止，对不同种类的蟹进行分子生物学方法的系统发育分析还不多见，本实验采用的实验材料就包括了不同种类的蟹，相信可以给日后的蟹种间的差异分析提供一些参考数据和理论依据。参考文献1陈丽梅,孔晓瑜,喻子牛,等3种蛏类线粒体16SRRNA和C0I基因片段的序列比较及其系统学初步研究A海洋科学,2005,29827322陈子安,杜晓东,王庆恒,等3种星虫线粒体16SR
29、RNA、C0I和CYTB基因片段的序列比较A广东海洋大学学报,2007,2743103陈丽梅,李琪,李赟4种海参16SRRNA和C0I基因片段序列比较及系统学研究A中国水产科学,2008,1569359424毕相东,杨雷,侯俊利,等C0I基因在海洋动物分子系统学研究中的应用C水产科学,2008,2721051085孙红英,周开亚,杨小军从线粒体16SRRNA序列探讨绒螯蟹类的系统发生关系动物学报,2003,4955925996雷忻,廉振民,雷富民,等基于线粒体C0I基因探讨鹟亚科部分属和种的分类地位A动物学研究,2007,2832912967孔晓瑜,姜艳艳,相建海,等魁蚶线粒体16SRRNA和
30、C0I基因片段序列测定及其应用前景海洋科学,2001,251246488吉鹏宇,沈琪,唐小林,等六个青蟹群体的线粒体16SRRNA和C0I基因部分序列差异A海洋湖沼通报,2008,69779郑文娟,朱世华,沈锡权,等泥蚶线粒体16SRRNA和C0I基因片段序列研究A宁波大学学报（理工版）,2008,211394210郭天慧,孔晓瑜,陈四清,等三疣梭子蟹线粒体DNA16SRRNA和C0I基因片段序列的比较研究A中国海洋大学学报,2004,341222811李莉好,喻达辉,黄佳菊,等三种海豚线粒体C0I基因的序列分析J动物学杂志,2007,423202712邱高峰,徐巧婷,王丽卿,等四种绒螯蟹分子
31、分类与系统发育J动物学报,2001,47664064713潘宝平,吴琪,张素萍,等文蛤属16SRRNA基因及ITS1序列的系统学分析海洋与湖沼,2006,37434234714徐敬明,张俊丽,方华华,等相手蟹属两种蟹类线粒体16SRRNA基因序列的比较A水产科学,2006,25944344715徐琰,宋林生,李新正用16SRDNA序列初步探讨部分真虾类的系统发育关系A海洋科学,2005,299364116孙红英,周开亚,陆健健,等中国大陆绒螯蟹线粒体16SRDNA序列变异与分子鉴定标记自然科学进展,2002,12548549017马凌波,张凤英,乔振国,等中国东南沿海青蟹线粒体C0I基因部分序
32、列分析A水产学报,2006,30446346818麦维军,谢珍玉,张吕平,等中国明对虾与5种虾类线粒体16SRRNA和C0I基因片段的序列比较及其系统学初步研究A海南大学学报自然科学版,2009,271152319郭奕慧,喻达辉,黄佳菊,等中国主要养殖罗非鱼亲缘关系的C0I序列分析A华中农业大学学报,2009,281757920孔晓瑜,喻子牛,刘亚军,等中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体C0I基因片段的序列比较研究青岛海洋大学学报,2001,31686186621THIERRYJHEGER,JANPAWLOWSKI,ENRIQUELARA,ETALCOMPARINGPOTENTIALC0IANDSS
33、URDNABARCODESFORASSESSINGTHEDIVERSITYANDPHYLOGENETICRELATIONSHIPSOFCYPHODERIIDTESTATEAMOEBAEARTICLEINPRESS,2010,31222ZHANGQINGYI,CHENGQIQUN,GUANWEIBINGMITOCHONDRIALC0IGENESEQUENCEVARIATIONANDTAXONOMICSTATUSOFTHREEMACROBRACHIUMSPECIESZOOLOGICALRESEARCH2009,30661361923LUOJIACONG,XIAOYONGSHUANG,SONGLIN
34、,ETALPHYLOGENETICSEPARATIONOFLANCELETSINCHINAREVEALEDBYMITOCHONDRIALC0IANDCYTBGENEANALYSISSOUTHCHINAFISHERIESSCIENCE,2007,3281424BUCKLINA,GUARNIERIM,HILLRS,ETALTAXONOMICANDSYSTEMATICASSESSMENTOFPLANKTONICCOPEPODAUSINGMITOCHONDRIALC0ISEQUENCEVATIATIONANDCOMPETITIVE,SPECIESSPECIFICPCRJHYDROBIOLOGIA,19
35、9940123925425MONICAM,EMESTOW,ALINAMSEXAMINATIONOFTHEMONTASTRAEAANNULARISSPECIESCOMPLEXUSINGIFSANDC0ISEQUENCESJMARBIOTECHNOL,199918997本科毕业设计（20_届）用16SRRNA基因对九种蟹系统学分析目录1引言211蟹类的生物学特征212研究历史与现状213研究意义414主要研究内容415应解决的问题42实验材料与方法421样品422试剂423设备424实验方法43结果与分析531核苷酸组成分析532遗传距离分析933系统进化树104结果与讨论1041线粒体基因与动物
36、系统发育重建1042本研究中9种蟹的系统发育分析95小结10致谢11参考文献12摘要蟹类是水产养殖中的重要经济物种，分布广泛于咸淡水中，具有一定的经济价值。但由于从形态学和细胞学上对其分类有一定的难度，所以利用分子生物学手段鉴定其种类，研究其系统发育情况已经成为主流。本文利用蟹类的线粒体16SRRNA基因片段序列分析的方法，对9种蟹类进行了分子系统学研究。经多重比对和软件分析，得到了种间序列的遗传距离并构建了最大简约（MP）系统树。结果表明秉氏厚蟹和日本蟳两种蟹类具有较近的亲缘关系，这与他们在传统形态学分类上的分类地位有出入。而其余蟹类的进化关系与传统分类学结果是相一致的。该研究可以为蟹类的分
37、类问题及亲缘关系提供一定的分子生物学依据。关键词蟹类；系统发育；线粒体16SRRNA基因；亲缘关系ABSTRACTCRABISANIMPORTANTECONOMICAQUACULTURESPECIES,WHICHWIDELYDISTRIBUTEDINSALTYANDFRESHWATERANDHASSOMEECONOMICVALUEHOWEVER,DUETOTHETHEIRCLASSIFICATIONBASEDONMORPHOLOGYANDCYTOLOGYHASACERTAINDIFFICULTY,SOUSETHEMEANSOFMOLECULARBIOLOGYTOIDENTIFYTHETYPES
38、ANDSTUDYTHEPHYLOGENYSITUATIONOFTHEMHAVEBECOMINGMAINSTREAMINTHISPAPER,WEUSETHEMITOCHONDRIAL16SRRNAGENESEQUENCEANALYSISANDCARRYOUTTHE9KINDSOFCRABSMOLECULARSYSTEMATICSAFTERMULTIPLECOMPARISONANDSOFTWAREANALYSIS,WEGETTHESEQUENCEOFTHEGENETICDISTANCEBETWEENSPECIESANDBUILDAMAXIMUMPARSIMONYMPPHYLOGENETICTREE
39、THERESULTSHOWSTHATTHREECRABSOFHELICEPINGIANDCHARYBDISJAPONICAHAVEACLOSERRELATIONSHIP,WHICHHASTHEDISCREPANCYOFTHEIRCLASSIFICATIONPOSITIONFORTRADITIONALMORPHLOGICALCLASSIFICATIONTHEEVOLUTIONARYRELATIONSHIPSOFTHEREMAININGCRABSANDTHETRADITIONALTAXONOMYISCONSISTENTWITHTHERESULTSTHESTUDYCANPROVIDEAMOLECUL
40、ARBIOLOGYBASISOFTHECLASSIFICATIONPROBLEMSFORCRABSANDRELATIONSHIPSKEYWORDSCRABSPHYLOGENETICMITOCHONDRIAL16SRRNAGENERELATIONSHIPS1引言11蟹类的生物学特征111简介蟹是十足目（DECAPODA）短尾次目的甲壳动物，尤指短尾族（BRACHYURA）的种类（真蟹），也包括其他一些类型，如歪尾族（ANOMURA）的种类。常见的有关公蟹、梭子蟹、溪蟹、招潮蟹、绒螯蟹等属，总共约4500种，见于所有海洋、淡水及陆地。通常以步行或爬行的方式移动。蟹类通常为杂食性，多食腐，有些能与其
41、他动物共生。112分布范围大部分蟹类生活于海中，甚至热带国家数量丰富的陆蟹，也不时到海里活动，其生命的早期也在海中度过。世界大部分温暖地区都有丰富的淡水蟹资源，例如南欧长于河水中的春蟹（POTAMONFLUVIATILE）。蛙蟹科、馒头蟹科、玉蟹科、梭子蟹科、扇蟹科主要生活在沿岸带；方蟹科、沙蟹科生活在广阔的潮间带。极少数如漂泊蟹和弓腿蟹能附着在木材或其他漂浮物上生活。也有不少种类与其他动物营共栖生活，如绵蟹科，关公蟹科。许多种如豆蟹常潜入一些软体动物的外套腔中、或多毛类的管道中共栖。一小部分蟹类完全在淡水中生长繁殖，它们多栖息于山区溪流的石块下。还有少数蟹类如地蟹能适应陆地生活，穴居于潮湿的
42、泥洞中，繁殖时期则迁移下海。113形态特征蟹的身体分为头胸部与腹部。头胸部的背面覆以头胸甲，形状因种不同而不一样。额部中央具第1、2对触角，外侧是有柄的复眼。口器包括1对大颚，2对小颚和3对颚足。头胸甲两侧有5对胸足。腹部退化，扁平，曲折在头胸部的腹面。雄性腹部窄长，多呈三角形，只有前两对赴肢变形为交接器；雌性腹部宽阔，第25节各具1对双枝型附肢，密布刚毛，用以抱卵。114经济价值蟹类中可供食用的主要有三疣梭子蟹、远海梭子蟹、青蟹和中华绒螯蟹等，具有较高的营养价值。蟹壳可用以提炼工业原料甲壳素，也可提制葡糖胺。有些蟹类可作中药用。蟹幼体或成体可作饲饵或饲料。所以蟹类具有很好的经济价值和市场开发
43、力。12研究历史与现状121背景几乎所有蟹类的幼体刚从卵中孵出时外形与成体完全不同。幼体成为溞状幼虫，体微小，同名，圆形，无肢体，在海面上游泳。蜕皮几次后体型开始增大，成为大眼幼体，这时身体及肢体才更像蟹，再蜕皮一次外形方似成体。所以在蟹幼体时，肉眼很难辨别其种类，但很久以来，关于海洋动物的分类及系统进化关系研究仍局限于对其形态学和细胞学方法。由于形态学和细胞学特征往往是基因表达的结果，可比较的分类信息较少且易受到环境等多种因素影响，所以关于包括蟹在内的许多水生动物的分类及系统进化关系一直是困扰人们的难题。自20世纪60年代以来，蛋白质和DNA等信息大分子被广泛应用于生物系统学研究，克服了在利
44、用形态学和细胞学方法对海洋动物做分类和系统进化研究时的诸多缺点，消除了很多海洋动物分类和系统进化研究中的争议，极大地促进了海洋动物分子系统学的发展1。DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受环境、生物发育阶段及器官组织的影响，因而能较为准确地反映出各个物种间的系统发生关系。而在这其中，线粒体DNA（MTDNA）的优势又更加明显。其具有母系遗传、变异大、无组织特异性等优点，且检测方便，因而在动物的分类、遗传变异分析和系统进化等领域应用广泛。其中尤以编码线粒体细胞色素C氧化酶亚基1（CYTOCHROMECOXIDASESUBUNITI，简称COI）和16SRRNA基因在动物分子系统学的研究中应用最为
45、广泛。截止到目前为止，国内外报道的利用C0I和16SRRNA基因对生物做系统学分析的文章数量很多，但是所用的实验材料也是涉及了多个种类的生物，其范围很广，另外，同时结合C0I和16SRRNA基因研究方法的文章也不多，大部分是针对其中一种方法的研究。比如，有基于16SRRNA基因序列多样性利用指纹方法构建微生物的分类和识别系统2；利用对虾属线粒体DNA基因序列构建其系统发生关系和演化史等。国内的相关研究成果也有很多，其实验对象涵盖了脊椎和无脊椎动物的大部分种类，从原生动物到哺乳动物均有见报，但是作蟹类的系统学分析较为少见，也有一些用蟹做的研究，但都局限于某一种属的蟹类之间的比较。如，吉鹏宇3等做
46、了六种青蟹群体的线粒体16SRRNA和COI基因部分序列差异的研究（2008）其中的观点也得到了马凌波的证实；有对三疣梭子蟹线粒体DNA16SRRNA和COI基因片段序列的比较研究4；相手蟹属两种蟹类线粒体16SRRNA基因序列的比较5等等诸如此类的分析报道。122在动物遗传多样性方面的研究动物遗传多样性的研究对揭示动物表型多样性的本质及建立动物种质资源库的工作具有非常重要的意义。总体来说，该工作还处于起步阶段。具有代表性的工作是关于梭子蟹的研究。梭子蟹是我国重要的海洋经济蟹类，做好梭子蟹科种质资源的保护及可持续开发及利用具有非常重要的意义，因而梭子蟹明确科内各属的系统进化关系是当务之急。郭天
47、慧4等对三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）线粒体基因片段分析发现其种内变异较低，在3个样本中基因片段有比较多的插入或缺失，同源性为372，进而奠定了以基因片段研究梭子蟹遗传多样性的理论基础。此外，吉鹏宇3等人，对从广东阳江，广东吴川，广东珠海，福建东山，海南海口，海南三亚等六地区采集的6个青蟹群体进行分子遗传变异差异的研究，结果表明东山等六地青蟹群体根子遗传背景基本相似。123在蟹类分类中的应用除了上述的两项实验，分子生物学手段研究系统发育关系，在蟹类中的其他的研究也比较多。一些国外学者采用C0I基因片段探究了东亚地区的绒螯蟹属系统进化关系，采用NJ和ML法的聚类分析
48、结果支持新绒螯蟹属为一个独立的属，而直额绒螯蟹都是绒螯蟹属所有其他成员的姐妹群，因而不支持平绒螯蟹属是一个有效的属。国内也有学者做过类似的研究。邱高峰6等利用PCR技术，扩增了中华绒螯蟹、独额绒螯蟹线粒体16SRRNA片段，经测序，与GENBANK数据库中的日本绒螯蟹和台湾绒螯蟹16SRRNA同源序列进行比较。结果表明，中华绒螯蟹与日本绒螯蟹亲缘关系最近，然后与台湾绒螯蟹聚为一支，独额绒螯蟹则成为相对独立的一支。此外，孙红英7等人做了中国大陆绒螯蟹线粒体16SRDNA序列变异与分子鉴定标记工作；孔晓瑜8进行了中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体C0I基因片段的序列比较研究。此外，徐敬明5等测定了相手蟹
49、属红螯相手蟹与褶痕相手蟹线粒体16SRRNA基因部分片段的序列，结果表明，分布与中国的3种相手蟹种，无齿相手蟹和红螯相手蟹的亲缘关系最近，而它们与褶痕相手蟹的亲缘关系则较远。13研究意义线粒体基因以其特殊的组成结构和演化方式在生物分子系统学的研究中具有不可取代的作用，并已经广泛地应用与海洋动物的分类、系统进化和遗传多样性等方面的研究中。总体来说，迄今为止，对不同种类的蟹进行分子生物学方法的系统发育分析还不多见，本实验以不同种类的蟹为实验材料进行16SRRNA基因比较研究，期望可以给日后的蟹种间的差异份析提供一些参考数据和理论依据。14主要研究内容包括研究材料不同种螃蟹的采集和购买；对样品进行一系列分子生物学处理，主要包括线粒体DNA的提取、PCR扩增和产物纯化、测序、数据分析以及系统发育树的构建；得出最终结论，形成论文。15应解决的问题通过对几种蟹类的16SRRNA的序列等相关问题的研究，并构建系统发育树，从而弄清这几种蟹类的在系统发育上的关系，进一步实践分子生物学手段在生物种类鉴别和系统发育研究上的优势。2实验材料与方法21样品本实验所用的样品均采购于水产品市场，共计9种，分别是三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）、锯缘青蟹（SCYLLASERRATA）、中华绒螯蟹（ERIOCHIERSINENSIS）、日本蟳（CHARYBDISJAPONICA）、秉氏
