1、1本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境假微型海链藻DGAT基因CDNA全长序列的分子克隆和分析一、选题的背景与意义1微藻制备生物柴油11生物柴油近年来，随着全球经济的快速增长，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上升，化石能源短缺危机已迫在眉睫，对生物质能等可再生能源的关注逐渐成为热点。生物柴油，又称单烷基脂肪酸酯，是以动、植物油脂为原料，与醇类经转酯作用获得的单烷基脂肪酸酯。生物柴油作为化石燃料的替代品，与化石柴油和燃料乙醇等其他液体燃料相比，有着突出的特性生物柴油不含石蜡，闪点高，燃烧性能和效率要高于普通柴油，使用时更安全；可以通过种植、养殖或培养源源不断地得到，因而属于可再生资源；生物
2、柴油产品中含硫和氮较少，可以减少产生SO2和NO对大气的排放量。以淀粉类作物和木质纤维素类物质发酵产生的燃料乙醇，燃烧后尾气排放污染小，但其热值只有普通汽油的2/3，比柴油更低，且乙醇易吸水使燃烧值下降。12微藻制备生物柴油的优势作为新一代生物柴油原料，微藻拥有很多优势。例如微藻种类繁多，分布极其广泛。全球已经鉴定的微藻大约有40000种，且其数量还在不断增加。大多分布在江海湖泊中，不与农作物争地，可以整年生长。微藻通常呈单细胞或丝状体，结构简单，整个生物体都能进行光合作用，所以光合作用效率高，生长周期短、速度快。微藻还可利用微生物发酵技术，在光反应器中高密度、高速率培养。在同样条件下，微藻细
3、胞生长加倍时间通常在24H内，对数生长期内细胞物质加倍时间缩短至35H。微藻油脂含量高。例如葡萄藻（BOTRYOCOCCUSBRAUNII）的含油量为细胞干重的2575。而高等植物种子的脂肪酸含量仅为干重的1520左右。其油脂组成与一般油料植物相似，以C16、C18系脂肪酸为主。2微藻能吸收并利用工农业生产中排放出的大量CO2和氮化物或从废水中取得氮、磷等，有利于改善环境。13假微型海链藻假微型海链藻属于中心硅藻纲，圆筛藻目，海链藻属。通过尼罗红染色法对宁波大学微藻种质库的63株微藻进行筛选，研究结果显示，中性脂含量最高的为假微型海链藻（TPSEUDONANA），虽然假微型海链藻的中性脂含量最
4、高，但是其细胞密度在整个生长期都比较低，因此对它的分子研究及培养条件的优化极为重要。131DGATDGAT二酰甘油酰基转移酶催化TAG（三酰甘油）合成途径的最后一步反应，也是该途径的限速酶，对它的研究对于进一步提高微藻含油量，降低生物柴油生产成本，有着十分重要的意义。另外，DGAT基因全长的克隆为下一步转入到拟南芥中提供目的基因。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1研究的基本内容11假微型海链藻（TPSEUDONANA）DGAT基因全长CDNA的克隆12DGAT基因全长CDNA序列分析、比对2拟解决的主要问题21得到假微型海链藻DGAT基因全长CDNA的克隆22分析和比对DGAT基因全长CD
5、NA序列三、研究的方法与技术路线1假微型海链藻（TPSEUDONANA）DGAT基因全长CDNA的克隆11材料实验材料假微型海链藻（TPSEUDONANA）取自宁波大学微藻种质库，于5000ML三角瓶中，在温度20，盐度2530，光照强度为50MOL/M2S，光暗比12H12H的条件下采用NML3培养液（表1）培养10D。表1NML3培养液配方TABLE1COMPOSITIONOFCULTUREFLUID营养成分含量（G/L）3KNO3100KH2PO410EDTANA220C6H5O7FE5H2O1MNSO405VB16103VB125105NA2SIO3212方法121总RNA的提取首先，
6、将三角瓶中的假微型海链藻（TPSEUDONANA）离心，去上清，得到100MG的藻泥于2MLEP管中。然后加入1ML的TRIZOL试剂，超声波清洗机中超声5MIN后提取总RNA。最后用20LDEPC水（RNASEFREE）溶解RNA，测定RNA的浓度和OD260/OD280的值。122反转录合成CDNA的第一条链取各样品RNA1G按TAKARAPRIMESCRIPTTMRTPCRKIT（宝生物工程有限公司）操作方法在一个DEPC水处理过的PCR管中加入总RNA1G，OLIGODTPRIMER25M1L，DNTPMIXTURE（10MMEACH）1L，加RNASEFREEDH2O补至10L，PC
7、R仪上65反应5MIN后，离心数秒使模板RNA、引物等的混合液聚集于PCR管底部。然后加入5PRIMESCRIPTTMBUFFER10L，RNASEINHIBITOR（40U/L）05L，PRIMESCRIPTTMRTASE（FOR2STEP）05L，RNASEFREEDH2O5L，混匀后PCR仪上进行反转录反应3010MIN，4230MIN，955MIN，得到的CDNA产物可直接用于基因全长CDNA的克隆或放20保存。1233RACE引物设计按照NCBI上公布的假微型海链藻（TPSEUDONANA）CCMP1335的DGAT基因的全长序列（XM_0022871791），用PRIMERPREM
8、IER50设计DGAT基因的特异性引物，接头及接头引物由3FULLRACECORESETVER20试剂盒提供（表6）。表6假微型海链藻（TPSEUDONANA）3RACE引物TABLE6PRIMERSIN3RACEOFTPSEUDONANA4引物名称PRIMERNAME引物序列PRIMERSEQUENCE（53）3RACEADAPTOR含有由TAKARA独特设计的DT区域及ADAPTORPRIMER部分3RACEOUTERPRIMERTACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3RACEINNERPRIMERCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGGGENESPECIF
9、ICOUTERPRIMERTTGGGTCGATCTGATATCCGENESPECIFICINNERPRIMERATCATATCCTCCCTCGAAG1243RACE获得DGAT基因全长CDNAOUTERPCR反应体系为50L反转录反应液3L，1CDNADILUTIONBUFFER7L，GENESPECIFICOUTERPRIMER10M2L，3RACEOUTERPRIMER10M2L，10LAPCRBUFFERMG2FREE4L，MGCL2（25MM）3L，TAKARALATAQ（5U/L）025L，DH2O2875L。反应条件943MIN；9430S，5530S，7215MIN，35个循环；
10、7210MIN。INNERPCR反应体系为50L稀释后的OUTERPCR产物1L，DNTPMIXTURE25MMEACH8L，10LAPCRBUFFERMG2FREE5L，MGCL2（25MM）5L，TAKARALATAQ（5U/L）05L，GENESPECIFICINNERPRIMER10M2L，3RACEINNERPRIMER10M2L，DH2O265L。反应条件943MIN；9430S，5530S，7215MIN，35个循环；7210MIN。125测序分析取5LPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，检测3RACEPCR扩增产物。将PCR产物连接到PMD18T受体上，转化到大肠杆菌中再进行测序。
11、13技术路线5四、研究的总体安排与进度2010720109查阅资料、预实验等前期准备。20109201011假微型海链藻DGAT基因全长CDNA的克隆201011201012DGAT基因全长CDNA序列分析、比对2011120112整理数据，撰写论文。五、主要参考文献1嵇磊，张利雄，姚志龙等利用藻类生物质制备生物燃料研究进展J石油学报石油加工，2007，236152王金娜，严小军，周成旭，徐继林产油微藻的筛选及中性脂动态积累过程的检测生物物理学报2010，2653刘波，孙艳,刘永红，赵宗保产油微生物油脂生物合成与代谢调控研究进展微生物学报20051514刘源，姜运良猪DGAT1基因部分序列的克
12、隆及分析山东2005年学术年会，2462485李栒油菜种子含油量相关基因PEPC和DGAT的克隆及遗传转化研究湖南农业大学博士论文6马海明，施启顺，柳小春DGAT相关基因的研究进展遗传学报，2005，32（12）132713327NILAIYARAJA,APRAJARANIETCCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFDGATCDNASEQUENCEFROMBRASSICAJUNCEEACVPUSABOLD8EVIRGINIAARBRUST,JOHNABERGES,CHRISBOWLER,THEGENOMEOFTHEDIATOMTHALASSIOSIRAPSEUDONANAEC
13、OLOGY,EVOLUTION,ANDMETABOLISM,SCIENCE,VOL306,1OCTOBER,20049BOUVIERP，BENVENISTEP，OELKERSP，STURLEYSL，SCHAIIERHEXPRESSIONINYEASTANDTOBACCOOFPLANTCDNASENCODINGSACYLCOADIACYLGLYCEROLACYITRANSFERASEJEURJBIOCHEM，2000，26718596总RNA的提取反转录合成CDNA的第一条链3RACE引物设计3RACE获得DGAT基因全长CDNA测序、分析610LUNGSC，WESELAKERJDIACYLGL
14、YCEROLACYLTRANSFERASEAKEYMEDIATOROFPLANTTRIACYLGLYCEROLSYNTHESISJLIPIDS，2006，4112107310887毕业论文文献综述海洋生物资源与环境植物二酰甘油酰基转移酶基因（DGAT）研究进展摘要石油的大量使用会导致能源枯竭和温室气体排放的增加，为了实现经济和环境的和谐发展，必须开发替代能源。生物柴油作为一种理想的可再生能源，近年来得到迅速发展。三酰甘油TAG是油料作物最主要的储藏脂类,二酰甘油酰基转移酶DGAT,EC23120是TAG合成途径的限速酶,其主要作用是催化二酰甘油加上酰基脂肪酸形成三酰甘油在植物中已发现了3种不同
15、类型的DGAT基因,分别为DGAT1、DGAT2和DGAT3该文对近年来国内外有关植物DGAT相关基因及其蛋白分类、定位、结构及其在脂肪酸合成等研究进展进行综述为提高产油植物油含量以及特定脂肪酸积累提供理论参考。关键词生物柴油植物油脂TAGDGAT含油量近年来，随着全球经济的快速增长，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上升，化石能源短缺危机已迫在眉睫，对生物质能等可再生能源的关注逐渐成为热点1。生物柴油，又称单烷基脂肪酸酯，是以动、植物油脂为原料，与醇类经转酯作用获得的单烷基脂肪酸酯，是一种安全清洁的可再生能源。微藻作为新一代生物柴油原料，光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短和生物产量及含
16、油量高，已经成为制备生物柴油的研究热点2。DGAT二酰甘油酰基转移酶催化TAG（三酰甘油）合成途径的最后一步反应，也是该途径的限速酶3，对它的研究对于进一步提高微藻含油量，降低生物柴油生产成本，有着十分重要的意义。11作用质体是植物发育种子中脂肪酸生物合成的主要场所。葡萄糖是脂肪酸碳C骨架的最初来源。如图1所示，叶片中合成的葡萄糖运输到发育的种子细胞中，经过一系列生化反应形成丙酮酸PYRUVATE。丙酮酸进入质体，在丙酮酸脱氢酶PDH催化下生成乙酰辅酶AACETYLCOA，为脂肪酸合成提供了起始的2C分子。丙酮酸的合成及其转入质体中的数量是脂肪酸合成和积累的一个限速步骤。脂肪酸生物合成的第一步
17、反应是乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶ACCASE的催化下加上一个羧基生成3C分子丙二酰辅酶AMALONYLCOA。这一步也是脂肪酸合成和积累的一个限速步骤。接着，在转酰基酶AT的作用下，丙二酰基从辅酶A分子转移到酰基载体蛋白ACP8上，形成丙二酰ACP（MALONYLACP）。然后，在脂肪酸合成酶FAS复合体的作用下，丙二酰ACP经过多次循环，每次循环使碳链增加两个碳原子，直到饱和脂肪酸链长度达到16个碳原子的软脂酸为止。这是正常的脂肪酸合成酶作用的终点。更长链的脂肪酸，或不饱和脂肪酸等都是把软脂酸作为前体，需要另外的酶反应形成5。图1中，在质体中合成的脂酰ACP，经硫酯酶TE催化生成脂肪酸，接
18、着与位于质体外膜上的辅酶A结合，形成脂酰COA。接着脂酰COA（FATTYACYLCOA）从质体经细胞质转运到内质网，用于合成甘油脂。首先，在3磷酸甘油酰基转移酶GPAT和溶血性磷脂酸酰基酶LPAT的先后作用下，脂肪酸碳链从各种脂酰COA分子上转移到甘油3磷酸GLYCEROL3PHOSPHATE的SN1和SN2位置上，从而生成磷脂酸PHOSPHATIDATE。然后，磷脂酸分子上SN3位的磷酸基被磷脂酸磷酸酶PAP切除后就形成二酰甘油酯图1植物三酰甘油的生物合成途径图DIACYLGLYCEROL。最后，在二酰甘油酰基转移酶DGAT作用下，二酰甘油的SN3位置上发生酰基化即结合一个脂肪酸碳链，形成
19、三酰甘油TRIACYLGLYCEROL。最近，研究发现了另一条不依赖于乙酰辅酶A的三酰甘油合成途径，即在磷脂二酰甘油酯转移酶DGAT的催化作用下，脂酰基直接从磷脂酰胆碱PC转移至二酰甘油，从而合成三酰甘油，而没有经中间产物辅酶24。12分类根据从NCBI蛋白数据库中得到的各个物种中DGAT蛋白的氨基酸序列（如表1），运用生物信息学软件DNAMAN60分析可以把它们分为3类如图2DGAT1、DGAT2和DGAT3基因家族25。9表1已测序植物DGAT蛋白的名称及其登录号DGAT蛋白登录号DGAT蛋白登录号VMGAT2ABC94473AHDGAT3AAX62735BEDGAT1AAD45536RC
20、DGAT2AAYL6324BJDGATLAAY40784BNDGAT2EE553426ATDGATLCA845373ATDGAT2NP566952LJDGATLAAW51456OSDGATLAAW47581GMDGATLBBAE9346L2ZMDGATLABV91586JCDGATLABL384383NTDGATLAAFL9345EADGATLAAV31083VGDGATIAABV21945RCDGATLAARL1479PFDGATLAAG23696VFDGATLABC94471OEDGATLAASOL606DGAT1基因家族只存在于动物和植物中7,16,17,27,28。高等植物DGAT1蛋
21、白的氨基酸残基数一般在480550之间，不同物种的DGAT氨基端前100个氨基酸残基相似性较低低于20，而位于100以后的氨基酸残基相似性较高大于70，可能正是这种N端差异导致了不同植物DGAT1酶属性的不同22。一般情况下，植物DGATL具有9LO个跨膜结构域，在N端有一个由100多个氨基酸组成的亲水域，该亲水域位于内质网膜的胞质面。DGAT2基因家族的成员在动物、植物和酵母中都存在15,16,22,25，并且与DGAT1基因家族没有明显的相关性。目前对植物DGAT2的研究较少，仅在拟南芥、油菜、蓖麻等少数植物中克隆出来。蛋白序列分析发现，C端明显比N端保守，同样也具有相似的亲水结构域和疏水
22、结构域。几种已知的DGAT2蛋白具有23个跨膜结构域。DGAT3基因是SAHA等从发育中的花生子叶细胞质中克隆的一个与TAG合成相关的基因，该基因属于DGAT基因家族，但是与DGATL和DGAT2基因家族的相似性不足10，其蛋白序列与上面两种DGAT家族同源性很低，但是具有类似DGAT蛋白功能基序5,22。该蛋白含有345个氨基酸，推测其分子量为41KD，不存在跨膜结构和信号肽序列，因此推测该蛋白定位于细胞质中，是一种可溶性蛋白。10图2不同植物中DGAT蛋白序列的进化树分析2DGAT基因21已测序DGAT基因、定位及结构特点从NCBI数据库中得到已测序的植物DGAT基因及登录号（如表2）。拟
23、南芥DGATL基因定位于染色体上，该基因DNA总长度为3020BP，含有16个外显子和15个内含子，CDNA全长1998BP。拟南芥DGAT2基因位于染色体上，DNA总长度为2164BP，含有8个外显子和7个内含子，CDNA全长1330BP。花生DGAT3基因组序列还未得到，其CDNA全长1637BP。各类植物的DGAT基因结构略有不同其中油桐和水稻DGATL含有16个外显子和15个内含子，外显子长度和拟南芥基本一致。百脉根以及大豆DGATL含有15个外显子和14个内含子，它们最后一个外显子长度与拟南芥和水稻的最后两个外显子长度之和基本相等。表2已测序的植物DGAT基因及登录号中文名拉丁名基因
24、登录号大豆GLYCINEMAXDGATAY6527651蓖麻RICINUSCOMMUNISDGATAY3664961拟南芥ARABIDOPSISTHALIANADGAT1NM1275032花生ARACHISHYPOGAEADGATEU183333111花生ARACHISHYPOGAEADGAT3AY8756441玉米ZEAMAYSDGAT12EU0398301麻风树JATROPHACURCASDGAT1EU4773781紫苏PERILLAFRUTESCENSDGAT1AF298815122已测序的植物DGAT基因进化树分析从NCBI数据库中得到已测序的植物DGAT，运用CLASTALX软件进行
25、多序列比对（图3）和迭代比对（图4）7种植物DGAT基因，得到进化树分析。图3多序列比对进化树分析GI物种的拼音图4迭代比对进化树分析GI物种的拼音23DGAT的基因操作231DGAT序列克隆DGAT序列克隆是进几十年才开始的。从CASES等在小鼠中克隆了第一个DGATL12基因后，HOBBS等拟南芥中克隆了DGAT基因，该基因在拟南芥中仅有一个拷贝。随后，在油菜、蓖麻、烟草、大豆、百脉根等其他植物也得到了DGATL的同源基因。目前对植物DGAT2的研究较少，仅在拟南芥、油菜、蓖麻等少数植物中克隆出来。DGAT3基因目前只在花生中发现。232DGAT的转基因工作表3DGAT的转基因工作年份试验
26、者工作结果产脂量提高1999年HOBBSDHLUC，HILLSMJATDGAT1基因过量表达DGAT1转录水平和活性明显提高油脂积累增加10702006年李群,王学英DGAT1基因插入TAG1基因突变体AS11含油量和油类组成恢复野生型水平亚油酸含量高出602008年KWILLIAMSETC对TMDGATL的6个假定功能位点的定向诱变SNRKI目标位点的丝氨酸残基突变，酶活性提高38680油脂积累增加2009年李栒官春云拟南芥DGAT正义表达载体转化到油菜中拟南芥在油菜中均能表达，在油菜种子中表达水平高，在叶中以低水平表达油脂含量增加07693结论（1）根据从NCBI蛋白数据库中得到的各个物种
27、中DGAT蛋白的氨基酸序列运用生物信息学软件DNAMAN60分析可以把它们分为3类DGAT1、DGAT2和DGAT3基因家族。（2）从NCBI数据库中得到已测序的植物DGAT，运用CLASTALX软件进行多序列比对和迭代比对得到完全相同进化树见图3和图4。4展望植物油作为一种可再生的生物柴油产品，具有非常广泛的应用1TAG是植物油的主要成分，植物油是食用脂类的主要来源，约占全世界脂类消耗的75，而且13植物油所含的很多单不饱和脂肪酸例如油酸，比饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸具有更高的营养价值；2植物油是巨大的天然原料，很多脂肪酸例如芥酸，月桂酸，斑鸠菊酸都广泛用于工业生产。据统计，世界上每年有1/
28、3的植物油用于制药和化工生产。近年来，对植物油脂的广泛需求极大地促进了DGAT相关基因的研究，并在阐明植物油脂生物合成与代谢途径，以及利用基因工程方法改良优质品质方面获得了较大的发展。随着各种油料作物的DGAT基因研究的逐渐深入，以及更多与植物含油量相关的DGAT基因多态性位点的发现，对于提高植物油产量以及品质具有重要意义。2008年，ZHENG等通过对高油玉米DGATL的研究发现，在DGATL2蛋白的F469位点处的一个苯丙氨酸的插入是提高油含量和油酸含量的重要决定因素，阐明了油含量以及组成差异的分子基础。通过诱变得到DGATL2蛋白苯丙氨酸突变型是未来大幅提高产脂量的值得研究的方法。参考文
29、献1嵇磊，张利雄，姚志龙等利用藻类生物质制备生物燃料研究进展J石油学报石油加工，2007，236152王金娜，严小军，周成旭，徐继林产油微藻的筛选及中性脂动态积累过程的检测J生物物理学报，2010，2653刘波，孙艳,刘永红，赵宗保产油微生物油脂生物合成与代谢调控研究进展微生物学，20051514刘源，姜运良猪DGAT1基因部分序列的克隆及分析山东2005年学术年会，2462485李栒油菜种子含油量相关基因PEPC和DGAT的克隆及遗传转化研究湖南农业大学博士论文6马海明，施启顺，柳小春DGAT相关基因的研究进展遗传学报，2005，32（12）132713327XIAOHUAHE,CHARLO
30、TTATURNER,GRACEQCHEN,JIANNTSYHLIN,ANDTHOMASAMCKEONCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFACDNAENCODINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEFROMCASTORBEANJLIPIDS,2004,3943113188EVIRGINIAARBRUST,JOHNABERGES,CHRISBOWLER,THEGENOMEOFTHEDIATOMTHALASSIOSIRAPSEUDONANAECOLOGY,EVOLUTIONANDMETABOLISMSCIENCE,2004,306109BOUVIERP,B
31、ENVENISTEP,OELKERSP,STURLEYSL,SCHAIIERHEXPRESSIONINYEASTANDTOBACCOOFPLANTCDNASENCODINGSACYLCOADIACYLGLYCEROLACYITRANSFERASEJEUR,J,BIOCHEM2000,267185961410LUNGSC,WESELAKERJDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEAKEYMEDIATOROFPLANTTRIACYLGLYCEROLSYNTHESISJLIPIDS,2006,41121073108811ASSAFBARDI,KIMBERLEETHAMATRAKO
32、LN,KAYDPAULGFALOWSKI,ETCDIATOMGENOMESCOMEOFAGE,GENOMEBIOLOGY,JANUARY,200912BOUVIERP,BENVENISTEP,OELKERSPETA1EXPRESSIONINYEASTANDTOBACCOOFPLANTCDNASENCODINGSACYLCOADIACYLGLYCEROLACYITRANSFERASEJEURJBIOCHEM,2000,2671859613CASESS,SMITHSJ,ZHENGYWIDENTIFICATIONOFAGENEENCODINGANACYLCOADIACYLGLYCEROLACY1TR
33、ANSFERASE,AKEYENZYMEINTRIACYLGLYCEROLSYNTHESISJSCI,1998,9522130181302314HOBBSDH,LUC,HILLSMJCLONINGOFACDNAENCODINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEFROMARABIDOPSISTHALIANAANDITSFUNCTIONALEXPRESSIONJFEBSLETT,1999,452314514915EVIRGINIAARBRUST,JOHNABERGES,CHRISBOWLER,THEGENOMEOFTHEDIATOMTHALASSIOSIRAPSEUDONA
34、NAECOLOGY,EVOLUTION,ANDMETABOLISM,SCIENCE,VOL306,1OCTOBER,200416JAKOC，KUMARA,WEIYD,ZOUJSEEDSPECIFICOVEREXPRESSIONOFANARABIDOPSISCDNAENCODINGADIACYLGLYCEROLACYTRANSFERASEENHANCESSEEDOILCONTENTANDSEEDWEIGHTJPLANTPHYSIOLOGY,2001,126286187417KATAVICV,REEDDW,TAYLORDCALTERATIONOFSEEDFATTYACIDCOMPOSITIONBY
35、ANETHYLMETHANESULFONATEINDUCEDMUTATIONINARABIDOMISTHALIANAAFFECTINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEACTIVITYJPLANTPHYSIOLOGY,1995,108139940918LEHNERR,KUKSISABIOSYNTHESISOFTRIACYLGLYCEROLSJPROGRESSINLIPIDRESEARCH,1996,35216920119LUNGSC,WESELAKERJDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEAKEYMEDIATOROFPLANTTRIACYLGLYC
36、EROLSYNTHESISJLIPIDS,2006,41121073108820SAHAS,ENUGUTTIB,RAJAKUMARISCYTOSOLICTRIACYLGLYCEROLBIOSYNTHETICPATHWAYINOILSEEDS,MOLECULARCLONINGANDEXPRESSIONOFPEANUTCYTOSOLICDIACYLGLYCEROLACY1TRANSERASEJPLANTPHYSIOLOGY,2006,14141533154321STAHLU,CARLSSONAS,LENMNAMCLONINGANDFUNCTIONALCHARACTERIZATIONSOFAPHOS
37、PHOLIPIDDIACYLGLYCEROLACYLTRNASFERASEFROMARABIDOPSISJPLANTPHYSIOLOGY,2004,135L324L33522SANDAGERL,GUSTSVSSONMH,STEHIUSTORAGELIPIDSYNTHESISISNONESSENTIALINYEASTJJBIO1CHEM,2002,27786478648223ROUTABOUIJM,BENNINGC,BECHTOLDNTHETAG1LOCUSOFARABIDOPSISENCODESFORADIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEJPLANTPHYSIOLBIOC
38、HEM,1999,37118318401524ZOUJ,WEIYD,JAKOCTHEARABIDOPSISTHALIANATAG1MUTANTHASAMUTATIONINADIACYLGLYCEROLACYITRANSFERASEGENEJPLANTJOURNAL,1999,19664565325XIAOHUAHE,CHARLOTTATURNER,GRACEQCHEN,JIANNTSYHLIN,ANDTHOMASAMCKEONCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFACDNAENCODINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEFROMCASTORBEANJ
39、LIPIDS,2004,43931131816本科毕业设计（20_届）假微型海链藻DGAT基因CDNA全长序列的分子克隆和分析17目录1绪论111生物柴油的研究现状1111生物柴油作为替代燃料的优势1112国外制备生物柴油的原料1113国内制备生物柴油的原料1114存在的问题212微藻制备生物柴油的研究现状2121微藻制备生物柴油的优势2122国外微藻制备生物柴油的研究进展2123国内微藻制备生物柴油的研究进展3124存在的问题和今后研究的方向413DGAT研究现状5131DGAT在TAG合成中的作用5132DGAT的分类52材料与方法621材料622方法6221总RNA的提取6222反转录合
40、成CDNA的第一条链62233RACE引物设计72243RACE获得DGAT基因全长CDNA7225测序分析7226DGAT基因CDNA全长的生物信息学分析73结果与讨论831假微型海链藻DGATCDNA克隆832生物信息学分析8321核苷酸序列分析8322推导的氨基酸序列同源性分析104小结12致谢错误未定义书签。参考文献1218摘要高昂的成本限制了微藻生物柴油的产业化，降低生产成本是关键所在。微藻具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短和生物产量高等优势，已经成为制备生物柴油的研究热点。DGAT二酰甘油酰基转移酶催化TAG（三酰甘油）合成途径的最后一步反应，也是该途径的限速酶，对它的
41、研究对于进一步提高微藻含油量，降低生物柴油生产成本，有着十分重要的意义。在本研究中，选取宁波大学藻种库中性脂含量最高的假微型海链藻（THALASSIOSIRAPSEUDONANA）为材料，提取总RNA，利用RACE技术，获得编码RCDGAT的全长CDNA。该CDNA全长1512BP，开放阅读框为1365BP，编码455个氨基酸，为DGAT1。BLASTX搜索结果显示,假微型海链藻DGAT核苷酸序列与已报道的藻类的同源性较高，其中三角褐指藻同源性54为最高，但与已报道的高等植物只具有3741的相似性。对GENBANK同源性搜索获得的其它植物DGAT基因核苷酸序列进行系统进化分析，通过MAG50分
42、析，修建氨基酸序列长度至421个，发现最先与假微型海链藻聚类合并的是三角褐指藻，接着与变种小球藻（作者翻译）聚合，然后和其余的高等植物聚合。关键词假微型海链藻；DGATCDNA全长；RACE；基因克隆ABSTRACTWITHTHERAPIDGROWTHOFGLOBALECONOMY,FOSSILENERGYISDRAININGAWAY,SUCHASOILANDCOALANDCARBONDIOXIDECO2FROMBURNINGOFFOSSILENERGYCAUSESGREENHOUSEEFFECTTHENPEOPLEPAYTHEIRATTENTIONTOLOOKFORRENEWABLEENER
43、GYBECAUSEOFHIGHPHOTOSYNTHETICEFFICIENCY,ENVIRONMENTALADAPTION,BIOMASSANDSHORTGROWTHCYCLE,MICROALGAEHAVEBECOMETHEFOCUSOFBIODIESELPRODUCTIONBUTHIGHCOSTLIMITSINDUSTRIALIZATIONOFMICROALGAEBIODIESELREDUCINGCOSTISTHEKEYPROBLEMDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEDGATISACRITICALENZYME,ASITCATALYZESTHETERMINALSTEPI
44、NTPSEUDONANAOILBIOSYNTHESISINTHISTHESIS,WEHAVEISOLATEDACDNAENCODINGDGATFROMTHALASSIOSIRAPSEUDONANAWHICHHASTHEHIGHESTNEUTRALLIPIDCONTENTAMONGTHEMICROALGAECOLLECTIONCENTEROFNINGBOUNIVERSITYANALYSISOFTHESEQUENCEREVEALSTHATTHISCDNAWAS1512BPINLENGTHWITHINTHEFULLLENGTHCDNA,ACLEAROPENREADINGFRAMEORFWAS1365
45、NUCLEOTIDES,CODING455AMINOACIDS,WHICHISDGAT1THERESULTSOFHOMOLOGOUSANALYSISINGENBANKDEMONSTRATEDTHATTHESEQUENCEHAD3741IDENTITYONTHENUCLEOTIDESEQUENCEWITHADVANCEDPLANT,ANDHIGHERIDENTITYWITHALGAETPSEUDONANAHADHIGHESTIDENTITY,54,WITHPHAEODACTYLUMTRICORNUTUMTHERESULTSOFPHYLOGENETICANALYSISSHOWEDTHATDGATF
46、ROMTPSEUDONANAANDFROMPHAEODACTYLUMTRICORNUTUMCLUSTEREDTOGETHERFIRSTLY,ANDTHENCLUSTEREDWITHCHLORELLAVARIABILIS,THENCLUSTEREDWITHOTHERADVANCEDPLANTSKEYWORDSTPSEUDONANADGATFULLLENGTHCDNARACEGENESEQUENCEANALYSIS11绪论近年来，随着全球经济的快速增长，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上升，化石能源短缺危机已迫在眉睫，对生物质能等可再生能源的关注逐渐成为热点【1】。据统计，2004年我国一次能源消
47、费总量约为197亿吨标准煤，比2003年增长18，其中煤炭占66，石油占22，天然气占28，水电占92，石油进口超过1亿吨。而且随着我国经济的快速发展，对能源的需求量将越来越大，预计到2020年，我国一次能源需求量为2533亿吨标准煤，到2050年这个数字预计将可能达到50亿吨标准煤。同时，能源供需矛盾将日益显现，尤其是石油供需矛盾将更加突出，石油供应安全凸现。另一方面，我国以煤碳为主的能源结构也将带来严重的大气污染，我国粉尘、二氧化碳和氮氧化物排放量的70，二氧化硫排放量的90来自于煤炭的燃烧。其中，二氧化硫和二氧化碳排放量已分别居世界第1位和第2位。20世纪90年代中期，我国酸雨区已占全国
48、面积的30左右。可吸入颗粒物、重金属污染等对生态环境造成的不利影响也日益受到全社会的关注。我国能源大规模开发利用所引起的环境问题，尤其是以二氧化碳为主的温室气体排放问题，已受到世界各国的普遍关注，京都议定书的生效和后京都议定书的开始谈判将使我国在温室气体排放问题上面对的国际压力日趋严重。寻找和开发化石能源的替代能源对保障国家能源安全以及促进经济社会可持续发展具有重要的战略意义。11生物柴油的研究现状111生物柴油作为替代燃料的优势生物柴油，又称单烷基脂肪酸酯，是以动、植物油脂为原料，与醇类经转酯作用获得的单烷基脂肪酸酯。生物柴油作为化石燃料的替代品，与化石柴油和燃料乙醇等其他液体燃料相比，有着
49、突出的特性生物柴油不含石蜡，闪点高，燃烧性能和效率要高于普通柴油，使用时更安全；可以通过种植、养殖或培养源源不断地得到，因而属于可再生资源；生物柴油产品中含硫和氮较少，可以减少产生SO2和NOX对大气的排放量。另外，与以淀粉类作物和木质纤维素类物质发酵产生的燃料乙醇相比，虽然酒精燃烧后尾气排放污染小，但其热值只有普通汽油的2/3，比柴油更低，且乙醇易吸水使燃烧值下降【9】。112国外制备生物柴油的原料按照当前技术，利用动植物油脂等原料生产生物柴油，其原料成本占总生产成本的5085，所以原料成本是决定生物柴油价格的最主要因素【10】。目前世界各国纷纷根据本国国情选择合适的油脂原料生产生物柴油。欧洲和北美地区耕地资源丰富，农业高度发达，因此欧洲各国，尤其是德国，大规模种植油菜，采用菜籽油生产生物柴油，并建立了相应的产品标准。美国主要利用高产转基因大豆，发展以大豆油为原料的生物柴油产业。东南亚国家属于热带雨林气候或热带季风气候，全年高温，雨水丰富，适于规模化种植油棕，棕榈油已成为当地发展生物柴油的重要原料。世界可再生能源生产大国巴西，主要利用蓖蔴籽
