1、1本科毕业论文系列开题报告水产养殖人工感染3种致病弧菌对大黄鱼7种酶活性的影响一、选题的背景与意义大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA（RICHARDSON）是我国主要海产经济鱼类之一，随着大黄鱼人工育苗技术的完善，其养殖规模也迅速扩大，但随着养殖密度的加大及日常不科学的管理措施，疾病的流行和危害也日益严重。近年来浙江、福建等各省网箱养殖的大黄鱼经常发生一种皮肤溃烂病，其主要症状为体表褪色、呈浅黄色、有出血点，头部、尾部皮肤溃烂，病鱼的尾柄被严重腐蚀，大多数病鱼都露出尾椎骨；肌肉充血，部分病鱼的身体一侧或两侧鳞片成片脱落，下颌、鳍基部充血，病鱼离群独游。解剖发现肝脏肿大、土黄色，有腹水
2、，肠与腹部粘连。许多学者已对网箱养殖大黄鱼溃疡病的病原菌进行了分离鉴定等研究，引起该病的病原菌主要是溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌。鱼类作为低等脊椎动物，在感染各种病原细菌时，主要依赖先天性的非特异免疫来抵御病原细菌感染。然而，有关大黄鱼抗感染的非特异性免疫机能研究很少，仅有的报道也是针对一种病原菌的感染后分析，尚未见有关引起大黄鱼溃疡病的不同病原菌之间的毒力差异及对大黄鱼免疫功能影响的差异性比较研究。从免疫学角度，提高鱼体非特异性免疫机能从而提高其抗病力，减少疾病发生已成为水产动物疾病预防与控制研究领域的热点。本研究通过人工感染引起大黄鱼溃疡病的多种病原菌后，分析大黄鱼血清7种酶活性的变化
3、特点，比较研究其致病机理和规律，对丰富大黄鱼免疫防御机制的理论基础、免疫增强剂的筛选及提高免疫防治技术都具有重要理论意义和应用价值。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1解明人工感染副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌后，分别对大黄鱼7种免疫酶指标的影响。2比较引起大黄鱼溃疡病的不同病原菌对大黄鱼机体损伤的毒力差异。23比较引起大黄鱼溃疡病的不同病原菌对大黄鱼各项非特异性免疫指标之间的差异及相关性。4评价大黄鱼抗感染的非特异性免疫防御功能及其机理。拟解决的主要问题17种非特异性免疫酶指标的选定2大黄鱼抗感染的非特异性免疫防御功能及其机理分析三、研究的方法与技术路线（一）研究方法以腹腔
4、注射的方式，分别人工感染副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌后，0H，6H，12H，24H，48H，72H，96H后各取6尾大黄鱼，尾静脉取血，4静置过夜后取血清。按以下方法进行大黄鱼溃疡病的7种免疫酶指标变化分析。1溶菌酶LZM的测定采用HULTMARK等的方法进行测定。2碱性磷酸酶AKP、酸性磷酸酶ACP、超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、髓过氧化物（MPO）等总抗氧化能力的测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行。3酚氧化酶PO的测定采用参考ASHIDA的方法进行，并加以改进。（二）技术路线3四、研究的总体安排与进度20091220101毕业论文选题2010120103进行文献查阅和
5、资料收集，制定具体研究计划和试验方案。2010320104撰写综述和开题报告20104开题报告答辩20104201012实地采样、试验研究、数据处理和分析2011220103完成外文翻译2011320114论文撰写2011420115提交并答辩五、主要参考文献1陈昌福,罗宇良,蔡冰,等饲养水温对草鱼溶菌酶活性的影响J中国水产科学,1996,3326282金珊,王国良,赵青松,等海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的流行病学研究J水产科学,2005,2411719碱性磷酸酶AKP酸性磷酸酶ACP超氧化物歧化酶SOD过氧化物酶POD髓过氧化物（MPO）酚氧化酶PO溶菌酶LZM大黄鱼患溃疡病后非特异性免疫机能的
6、影响分析人工感染副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌，对照组大黄鱼溃疡病病原菌的选定非特异性免疫指标的选定43林克冰,周宸,刘家富,等海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的病原菌J台湾海峡,1999,18303423474苏跃中,游岚网箱饲养的大黄鱼病害防治J水产科技情报,2000,2721791835苏永全,张彩兰,王军,等大黄鱼养殖M北京海洋出版社,2004,1106孙建和,严亚贤,陈怀青,等鲫鱼的细胞免疫应答研究J上海农学院学报,1998,16289917孙峰,张煜,李立德,等感染嗜水气单胞菌对鲫鱼非特异性免疫功能的影响J中国海洋大学学报,2005,3558158188王军,苏永全,张朝霞,等闽南地区养
7、殖大黄鱼细菌性疾病的病原生物学研究J厦门大学学报自然科学版,2001,4085919王军,鄢庆枇,苏永全,等免疫添加物对大黄鱼血液白细胞数量及其吞噬功能的影响J海洋科学,2001,259444610王军,鄢庆枇,苏永全,等免疫添加物对大黄鱼血液白细胞数量及其吞噬功能的影响J海洋科学,2001,259444611吴志鹏,王三英三联疫苗对大黄鱼常见细菌性疾病免疫保护的实验研究J厦门大学学报自然科学版,2004,43111511812厦门大学,国家海洋局第三海洋研究所大黄鱼养殖病害与性早熟防治技术研究国家863计划项目验收报告13肖克宇,邓时铭,向建国,等水产动物免疫与应用M北京科学出版社,2007
8、13919014薛飞,刘涛,周维仁,等绿原酸对异育银鲫血液非特异性免疫因子的影响J江西农业科学,2007,214815115鄢庆枇,王军,苏永全,等网箱养殖大黄鱼弧菌病研究J集美大学学报自然科学版,2001,6319119616鄢庆枇,张俊杰,邹文政,等人工感染溶藻弧菌对大黄鱼免疫功能的影响J水产学报,2007,31225125617鄢庆枇,王军,苏永全,等大黄鱼病原菌溶藻弧菌的ELISA快速检测研究J海洋科学,2001,259475018鄢庆枇,苏永全,王军,等大黄鱼弧菌病的荧光抗体快速诊断研究J集美大学学报,2001,6429129519鄢庆枇,苏永全,王军,等口服免疫添加剂对养殖大黄鱼免
9、疫机能影响的初步研究J集美大学学报自然科学版,2001,63134137520鄢庆枇,苏永全,王军,等溶藻弧菌脂多糖对大黄鱼的毒性与免疫保护性试验J台湾海峡,2003,222016316721杨文川,李立伟,石磊,等福建海水养殖鱼类寄生贝尼登虫病原学研究J台湾海峡,2001,20220520922张辉,张海莲碱性磷酸酶在水产动物中的作用J河北渔业,20035121323张继泽,吴天星,王进波共轭亚油酸对大黄鱼免疫功能的影响J水生态学志,2009,23869024郑天伦,王国良,金珊网箱养殖大黄鱼弧菌病的中草药防治J水产科学,2005,242242525赵维信鱼类生理学M北京高等教育出版社,19
10、9221221526CHENXH,LINKB,WANGXWOUTBREAKSOFANIRIDOVIUSDISEASEINMARICULTUREDLARGEYELLOWCROAKER，PSEUDOSCIAENACROCEA（RICHARDSON）,INCHINAJJFISHDIS,2003,2661561927CHRISTOPHERJBAYNE,LENAGERWICKTHEACUTEPHASERESPONSEANDINNATEIMMUNITYOFFISHJDEVELOPMENTALANDCOMPARATIVEIMMUNOLOGY,2001,2572574328JIANJC,WUZHEFFECTS
11、OFTRADITIONALCHINESEMEDICINEONNONSPECIFICIMMUNITYANDDISEASERESISTANCEOFLARGEYELLOWCROAKER,PSEUDOSCIAENACROCEARICHARDSONJAQUACULTURE,2003,2181929VILLAMILL,FIGUERASA,ARANGURENR,ETALNONSPECIFICIMMUNERESPONSEOFTURBOT,SCOPHTHALMUSMAXIMUSL,EXPERIMENTALLYINFECTEDWITHAPATHOGENICVIBRIOPELAGIUSJJFISHDIS,2003,
12、2632132930YILDIZHYEFFECTSOFEXPERIMENTALINFECTIONWITHPSEUDOMONASFLUORESCENSONDIFFERENTBLOODPARAMETERSINCARPCYPRINUSCARPIOLJISRJAQUACULTBAMIDGEH,1998,5082856毕业论文文献综述水产养殖大黄鱼病害研究概况摘要大黄鱼为我国特有海产鱼种，营养价值高，深受百姓喜爱，近年来随着人工育苗技术的完善与成熟,其养殖规模也迅速扩大，同时不少厂家为了追求更高的经济效益进行高密度养殖，使大黄鱼疾病的流行和危害也日益严重如浙江、福建许多地区出现了一种大黄鱼皮肤溃疡病,给
13、养殖业带来了很大的经济损失为了提高大黄鱼的抗病能力,减少疾病的发生,进来从大黄鱼的免疫学角度进行水产养殖病害防治研究,已成为水产动物疾病预防与控制研究领域的热点,同时也给今后免疫增强剂的删选奠定了一定的基础关键词大黄鱼；养殖；病害；免疫1大黄鱼概述11分布大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEARICHARDSON隶属鲈行目，石首鱼科，黄鱼属，俗称黄鱼、黄瓜鱼、黄花鱼等。大黄鱼是中国海的特有优质鱼种，在我国黄海的山东半岛以南至南海的雷州半岛以东均有分布，曾是我国著名的“四大海洋经济鱼类”之一。12营养价值大黄鱼营养丰富，肌肉中蛋白质含量为176189（湿重比），17种常见氨基酸总量为153
14、59MG/G湿重比，其中谷氨酸、天冬氨酸等具有鲜味的氨基酸含量高达4677MG/G，故肉味鲜美，为深受人们喜爱的佳肴。在医用上，大黄鱼的耳石、鳔、肉、胆、精巢均是重要药物和制药原料宏业,1985。2养殖状况20世纪90年代以前人们使用大黄鱼主要靠天然捕捞，1974年仅东海区的产量就达到19万吨，在我国海洋渔业发展中起了重要中用，但是，近年来由于资源过度开发，强大的捕捞压力使这一宝贵资源趋于衰竭和崩溃，全国文明的舟山渔场于70年代后期，福建闽江口渔场于80年代已先后形不成渔汛，福建宫井洋大黄鱼产卵场自1987年以来，已捕不到性成熟亲鱼（刘佳富，翁忠钗等，1994）。为了拯救大黄鱼和保护大黄鱼自然
15、资源，满足市场上日益增长的需求，水产研究部门及时开展了大黄鱼人工养殖的探索，福建省各级领导及有关部门于80年代初采取了相应措施，一方面建立大黄鱼繁殖保护区，另一方面则积极组织开展了大黄鱼人工育苗技7术、海区网箱养殖技术、土池养殖技术、集约化养殖技术和病虫害防治技术等系列专题研究。经福建省科技人员十余年的不懈努力和刻苦攻关，较为深入地突破和掌握了亲鱼培育、人工催产、孵化及仔稚鱼培育等系列关键技术，使获得大量亲鱼进行大黄鱼批量人工育苗成为可能，从而摆脱了依赖自然海区捕捞亲鱼的局面，并将大黄鱼的养殖技术成果和人工育苗得以迅速推广，并日趋成熟，实现了从科研开发到规模生产的转变，产生了显著的经济效益和社
16、会效益。现在大黄鱼的人工养殖已由内湾向浅海外滩，养殖方式也有单一的网箱养殖发展为土池养殖、围网养殖等多种模式，并正在向浅海大网箱养殖模式发展，而且从福建辐射到浙江、广东、江苏、台湾等沿海省份，养殖成本及市场价格较原来有明显降低，成为百姓能消费得起的美味佳肴（张彩兰，刘家富等，2002）。3大黄鱼病害研究概况但是随着大黄鱼养殖业的迅速发展，疾病的流行和危害也日益频繁，严重威胁着大黄鱼养殖业的健康发展，造成了巨大的损失。这包括长期近亲繁殖导致种质的退化，病害防治用药上有些养殖户或一些渔病防治员,为了快速治好鱼病或为了赚钱,不顾农业部颁布的水产养殖质量安全管理规定31号令,未确定病原或病因,盲目大量
17、使用禁用渔药或抗生素等,甚至使用人用的新药,形成滥用渔药的局面，加大了病害的发生率，及饵料质量难以保证，都使大黄鱼养殖带来危害。31细菌性病原体通过对大黄鱼病鱼体表和内脏器官分离菌的回归感染试验、形态鉴定、生理生化特性检测等细菌学方法，已鉴定出的大黄鱼细菌性病原有溶藻弧菌（VIBRIOALGINOLYTICUS）、副溶血弧菌（VPARAHAEMOLYTICUS）、哈维氏弧菌（VHARVEYI）、鳗弧菌（VANGUILLARUM）、创伤弧菌（VVULNIFICUS）、河流弧菌（VFLUVIALIS）、腐败假单胞菌（PSEUDOMONASPUTREFACIENS）、嗜水气单胞菌（AEROMONAS
18、HYDROPHILA）、肠型斑点气单胞菌（APUNCTATAFINTESTINALIS）、点状气单胞菌（APUNCTATA）、柱状屈挠杆菌（FLEXIBACTERCOLUMNARIS）和爱德华氏菌（EDWARDSIELLA）等（苏永全，张彩兰等，2004），其中以病原弧菌诱发的弧菌病发病率最高（林克冰，刘家富等，1999），危害最大，一直是研究的重点。32寄生虫病、病毒病大黄鱼寄生虫病主要有贝尼登虫病（杨文川等，2001）、库道虫病（简纪常等，2003）、隐核虫病等，关于大黄鱼病毒性疾病方面，已有研究表明在患病大黄鱼体内至少检测到82种可疑病毒，而且都存在于胞浆中（厦门大学）。陈新华等也在被感
19、染大黄鱼的脾、肾等组织观察到六边形彩虹病毒颗粒，并通过感染试验证实其为病原CHENXH等，2003。33皮肤溃疡病近年来浙江、福建等各省网箱养殖的大黄鱼经常发生一种皮肤溃烂病，其主要症状为体表褪色、呈浅黄色、有出血点，头部、尾部皮肤溃烂，病鱼的尾柄被严重腐蚀，大多数病鱼都露出尾椎骨；肌肉充血，部分病鱼的身体一侧或两侧鳞片成片脱落，下颌、鳍基部充血，病鱼离群独游。解剖发现肝脏肿大、土黄色，有腹水，肠与腹部粘连（王军，张朝霞等，2001）。许多学者已对网箱养殖大黄鱼溃疡病的病原菌进行了分离鉴定等研究，引起该病的病原菌主要是溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌及费氏弧菌等（金珊，王国良等，2005）。4
20、鱼类非特异性免疫研究鱼类虽是低等脊椎动物,但已具备免疫的基本特性。鱼类不仅具有多种非特异性免疫机制,如吞噬细胞、补体、干扰素、溶菌酶等,还有特异性的免疫应答反应,包括以抗体为主的体液免疫,以效应T细胞为主的细胞免疫和特异性免疫记忆,除全身性免疫外,鱼类还具有局部免疫。41鱼类非特异性免疫指标而大黄鱼抗体免疫和特异性细胞免疫远没有高等脊椎动物的复杂，特别在感染各种病原体初期，抗体尚未形成更多地是依赖于先天性的非特异免疫。胸腺、肾脏、脾脏和粘膜淋巴组织是鱼类最主要的免疫器官与组织（肖克宇等，2007）。在受到微生物侵扰时，鱼体炎症反应的核心细胞是吞噬细胞（孙建和等，1998）。而NBT阳性细胞是吞
21、噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞这3种细胞的总称（王军等，2001），是鱼体吞噬能力的极好指示剂。溶菌酶作为鱼类的非特异性免疫物质之一，在鱼体抵抗感染性致病菌的最前沿防御机制中起着重要作用（CHRISTOPHERJBAYNE等，2001）。所以通过测定鱼类血液中白细胞的吞噬能力和吞噬率以及溶菌酶的活性，在一定程度上可以反映鱼类机体非特异性免疫状态（陈昌福等，1996）。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶，在清除体内自由基，在抗菌、抗病毒及延缓机体衰老及防止生物大分子损伤等方面具有重要作用（薛飞等，2007）；碱性磷酸酶是血细胞溶酶体的特征酶，会对异物产生水解破坏作用（张辉等，2003）。因此超氧化物歧
22、化酶、碱性磷酸酶等许多酶类均可作为机体非特异性免疫指标，来评判病原菌对机体非特异性9免疫力的影响。42免疫防治进来从免疫学角度进行水产养殖病害防治研究，通过提高鱼体非特异性免疫机能从而提高其抗病能力，减少疾病的发生,已成为水产动物疾病预防与控制研究领域的热点。在免疫增强剂研究方面，鄢庆枇、王军等采用低聚糖益力素等免疫营养物投喂大黄鱼提高了溶菌酶活力、抗菌活力、白细胞数量和吞噬能力（鄢庆枇等，2001；王军等，2001）；在免疫预防方面，吴志鹏等人研究了采用不同方法制备的溶藻弧菌、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌三联疫苗及不同的免疫途径对大黄鱼的免疫效果，结果表明福尔马林灭活疫苗注射免疫途径效果最佳（吴
23、志鹏等，2004）；在中草药制剂的研究方面，郑天伦等人进行的大黄鱼弧菌病的中草药防治研究表明石榴皮、地榆、五味子、大黄等4种药物对溶藻弧菌的抑菌作用显著（郑天伦等，2005）。5展望相信，随着对大黄鱼免疫功能的基础研究的深入，特别是对大黄鱼抗病原菌感染的免疫反应机理的了解，能对其疾病防御提供重要的理论基础，且为将来各类免疫增强剂的筛选以提高大黄鱼的自身免疫抗病力奠定了基础。参考文献1陈昌福,罗宇良,蔡冰,等饲养水温对草鱼溶菌酶活性的影响J中国水产科学,1996,3326282宏业1985全身是药的大黄鱼海洋,1213金珊,王国良,赵青松,等海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的流行病学研究J水产科学,20
24、05,24117194简纪常,吴灶和大黄鱼库道虫病的初步研究J湛江海洋大学学报,2003,23129345林克冰,周宸,刘家富,等海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的病原菌J台湾海峡,1999,18303423476刘家富,翁忠钗等1994宫井洋大黄鱼标志放流技术与放流标志鱼早期生态习性的初步研究海洋科学,553587苏跃中,游岚网箱饲养的大黄鱼病害防治J水产科技情报,2000,2721791838苏永全,张彩兰,王军,等大黄鱼养殖M北京海洋出版社,2004,1109孙建和,严亚贤,陈怀青,等鲫鱼的细胞免疫应答研究J上海农学院学报,1998,162899110孙峰,张煜,李立德,等感染嗜水气单胞菌对鲫鱼
25、非特异性免疫功能的影响J中国海洋大学学报,2005,35581581811王军,苏永全,张朝霞,等闽南地区养殖大黄鱼细菌性疾病的病原生物学研究J厦门大学学报自然科10学版,2001,40859112王军,鄢庆枇,苏永全,等免疫添加物对大黄鱼血液白细胞数量及其吞噬功能的影响J海洋科学,2001,259444613王军,鄢庆枇,苏永全,等免疫添加物对大黄鱼血液白细胞数量及其吞噬功能的影响J海洋科学,2001,259444614吴志鹏,王三英三联疫苗对大黄鱼常见细菌性疾病免疫保护的实验研究J厦门大学学报自然科学版,2004,43111511815厦门大学,国家海洋局第三海洋研究所大黄鱼养殖病害与性早
26、熟防治技术研究国家863计划项目验收报告16肖克宇,邓时铭,向建国,等水产动物免疫与应用M北京科学出版社,200713919017薛飞,刘涛,周维仁,等绿原酸对异育银鲫血液非特异性免疫因子的影响J江西农业科学,2007,214815118鄢庆枇,王军,苏永全,等网箱养殖大黄鱼弧菌病研究J集美大学学报自然科学版,2001,6319119619鄢庆枇,张俊杰,邹文政,等人工感染溶藻弧菌对大黄鱼免疫功能的影响J水产学报,2007,31225125620鄢庆枇,王军,苏永全,等大黄鱼病原菌溶藻弧菌的ELISA快速检测研究J海洋科学,2001,259475021鄢庆枇,苏永全,王军,等大黄鱼弧菌病的荧光
27、抗体快速诊断研究J集美大学学报,2001,6429129522鄢庆枇,苏永全,王军,等口服免疫添加剂对养殖大黄鱼免疫机能影响的初步研究J集美大学学报自然科学版,2001,6313413723杨文川,李立伟,石磊,等福建海水养殖鱼类寄生贝尼登虫病原学研究J台湾海峡,2001,20220520924张彩兰,刘家富,李维璀等2002福建省大黄鱼养殖现状分析与对策上海水产大学学报,112778325张辉,张海莲碱性磷酸酶在水产动物中的作用J河北渔业,20035121326郑天伦,王国良,金珊网箱养殖大黄鱼弧菌病的中草药防治J水产科学,2005,242242527CHENXH,LINKB,WANGXWO
28、UTBREAKSOFANIRIDOVIUSDISEASEINMARICULTUREDLARGEYELLOWCROAKER，PSEUDOSCIAENACROCEA（RICHARDSON）,INCHINAJJFISHDIS,2003,2661561928CHRISTOPHERJBAYNE,LENAGERWICKTHEACUTEPHASERESPONSEANDINNATEIMMUNITYOFFISHJDEVELOPMENTALANDCOMPARATIVEIMMUNOLOGY,2001,2572574311本科毕业论文（20_届）人工感染3种致病弧菌对大黄鱼7种酶活性的影响1目录摘要（ABSTRACT
29、）1引言12材料与方法221实验材料2211实验用鱼2212实验菌株2213试剂2214仪器222实验方法2221各菌株感染浓度的确定2222实验分组3223菌悬液的配置3224人工感染3225样品采集3226血清溶菌酶活性测定3227血清酚氧化酶活性的测定3228血清MPO、AKP、ACP、POD、SOD活性的测定3229数据处理43结果和分析431血清溶菌酶（LSZ活性变化432血清酚氧化酶PO活性变化433血清超氧化物歧化酶SOD活性变化534血清酸性磷酸酶ACP活性变化535血清碱性磷酸酶AKP活性变化636血清髓过氧化物酶MPO活性变化737血清过氧化物酶POD活性变化74讨论75结
30、论与展望9致谢9参考文献102摘要目前频发的大黄鱼溃疡病主要由溶藻弧菌、哈维氏弧菌以及副溶血弧菌引起。本实验将健康的大黄鱼分为3个实验组和1个对照组，分别注射02ML的哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及灭菌生理盐水，并在人工感染后的0，1，2，4，7，10，13，16，20D分别采样，通过测定每组大黄鱼血清中7种免疫相关酶活性，比较这3种致病弧菌毒性差异及对大黄鱼非特异性免疫功能的影响。结果显示在感染后的110D，每个实验组的大黄鱼血清中LSZ、ACP、POD、MPO的活性变化，总体表现为先升高、后降低再逐渐升高最后趋于一致的现象，且不同病原菌之间存在一定的时效差异。AKP、PO、SOD和LS
31、Z对入侵体内的哈氏弧菌反应较敏感，ACP、SOD、POD和MPO对入侵体内的溶藻弧菌反应较敏感，LSZ、ACP和PO对入侵体内的副溶血弧菌反应较敏感。关键词大黄鱼；溶藻弧菌；哈维氏弧菌；副溶血弧菌；酶活性EFFECTSOFEXPERIMENTALINFECTIONWITHTHREEPATHOGENICVIBRIOONSEVENENZYMESINPSEUDOSCIAENACROCEA（RICHARDSON）ABSTRACTTHEULCERDISEASE,WIDELYSPREADONTHELARGEYELLOWCROAKER,ISMAINLYCAUSEDBYVIBRIOALGINOLYTICUS,
32、VIBRIOHARVEYIANDVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSACCORDINGTOTHERESEARCHESINTHISPAPER,WESET3EXPERIMENTALGROUPSWITHTHEINJECTIONOF02MLVIBRIOHARVEYI,VIBRIOALGINOLYTICUSANDVIBRIOPARAHAEMOLYTICUS,RESPECTIVELY,WHILEINJECTINGTHESAMEDOSEOFSTERILESALINEFORTHECONTROLGROUPTHENSAMPLEDAT0,1,2,4,7,10,13,16AND20DAYSAFTERINFEC
33、TIONBYMEASURINGTHEACTIVITYOF7DIFFERENTIMMUNITYRELATEDENZYMESINSERUM,WECOMPAREDTHEDIFFERENTTOXICITYOFTHETHREEPATHOGENICVIBRIOANDSTUDIEDTHEINFLUENCEONTHEFUNCTIONOFPSEUDOSCIAENACROCEASNONSPECIFICIMMUNITYUNDERTHEPRESSUREOFTHREEOFPATHOGENICVIBRIOTHERESULTSSHOWEDTHATFROM1TO10DAYSAFTERINFECTION,THEACTIVITY
34、OFLSZ,ACP,PODANDMPOINPSEUDOSCIAENACROCEASSERUMINCREASEDATFIRSTANDTHENDECREASED,BUTTHEYWENTTOANACCORDANTTENDENCYFINALLYTHEEXPERIMENTALSOINDICATEDTHATDIFFERENTPATHOGENSHADTIMEDIFFERENCEEFFECTTHROUGHFURTHERANALYZING,WEOBSERVEDTHATAKP,PO,SODANDLSZWASMORESENSITIVETOVIBRIOHARVEYIINFECTION,WHILEACP,SOD,POD
35、ANDMPOWASMORESENSITIVETOVIBRIOALGINOLYTICUSINFECTIONANDLSZ,ACPANDPOWASMORESENSITIVETOVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSINFECTIONKEYWORDSPSEUDOSCIAENACROCEAVIBRIOALGINOLYTICUSVIBRIOHARVEYIVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSENZYMESACTIVITY31引言大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA（RICHARDSON）隶属鲈行目，石首鱼科，黄鱼属，俗称黄鱼、黄瓜鱼、黄花鱼，是我国主要海产经济鱼类之一。随着大黄鱼人工育
36、苗技术的完善，其养殖规模也迅速扩大，但由于养殖密度的加大及日常不科学的管理措施，疾病的流行和危害也日益严重，威胁着大黄鱼养殖业的健康发展。这包括长期近亲繁殖导致种质的退化，病害防治用药上有些养殖户或一些渔病防治员为了快速治好鱼病或为了赚钱,不顾农业部颁布的水产养殖质量安全管理规定31号令,未确定病原或病因而盲目大量使用禁用渔药或抗生素等,甚至使用人用的新药,形成滥用渔药的局面，都加大了病害发生率。目前已鉴定出的大黄鱼细菌性病原有溶藻弧菌（VIBRIOALGINOLYTICUS）、副溶血弧菌（VPARAHAEMOLYTICUS）、哈维氏弧菌（VHARVEYI）、鳗弧菌（VANGUILLARUM）
37、、创伤弧菌（VVULNIFICUS）、河流弧菌（VFLUVIALIS）、腐败假单胞菌（PSEUDOMONASPUTREFACIENS）、嗜水气单胞菌（AEROMONASHYDROPHILA）、肠型斑点气单胞菌（APUNCTATAFINTESTINALIS）、点状气单胞菌（APUNCTATA）、柱状屈挠杆菌（FLEXIBACTERCOLUMNARIS）和爱德华氏菌（EDWARDSIELLA）等（苏永全，张彩兰等，2004）。大黄鱼寄生虫病主要有贝尼登虫病（杨文川等，2001）、库道虫病（简纪常等，2003）、隐核虫病等。关于大黄鱼病毒性疾病方面，已有研究表明在患病大黄鱼体内至少检测到2种可疑病毒
38、，而且都存在于胞浆中。陈新华等也在被感染大黄鱼的脾、肾等组织观察到六边形彩虹病毒颗粒，并通过感染试验证实其为病原CHENXH等，2003。虽然引起大黄鱼疾病的病原菌种类很多，但目前仍以细菌性疾病为主，占800以上。其中溃疡病最为常见、发病范围最广、且危害最大。它可由哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等多种致病弧菌引起，并且这些致病弧菌均是条件致病菌王国良，2008，其发病率和死亡率之高给大黄鱼养殖业带来严重的经济损失金珊，2005；郑天伦，2006。近年来浙江、福建等各省网箱养殖的大黄鱼也经常发生溃疡病，其主要症状为体表褪色、呈浅黄色、有出血点，头部、尾部皮肤溃烂，病鱼的尾柄被严重腐蚀，大多数病鱼
39、都露出尾椎骨；肌肉充血，部分病鱼的身体一侧或两侧鳞片成片脱落，下颌、鳍基部充血，病鱼离群独游。解剖发现肝脏肿大、土黄色，有腹水，肠与腹部粘连（王军，张朝霞等，2001）。鱼类作为低等脊椎动物，同哺乳动物等脊椎动物相比，其特异性免疫机制相对较低下，所以在感染各种病原细菌时，更多地是依赖于先天性的非特异免疫。胸腺、肾脏、脾脏和粘膜淋巴组织是鱼类最主要的免疫器官与组织（肖克宇等，2007）。在受到微生物侵扰时，鱼体炎症反应的核心细胞是吞噬细胞（孙建和等，1998）。而NBT阳性细胞是吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞这3种细胞的总称（王军等，2001），是鱼体吞噬能力的极好指示剂。溶菌酶作为鱼类的非特异
40、性免疫物质之一，在鱼体抵抗感染性致病菌的最前沿防御机制中起着重要作用（CHRISTOPHERJBAYNE等，2001）。所以通过测定鱼类血液中白细胞的吞噬能力和吞噬率以及溶菌酶的活性，在一定程度上可以反映鱼类机体非特异性免疫状态（陈昌福等，1996）。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶，在清除体内自由基，在抗菌、抗病毒及延缓机体衰4老及防止生物大分子损伤等方面具有重要作用（薛飞等，2007）；碱性磷酸酶是血细胞溶酶体的特征酶，会对异物产生水解破坏作用（张辉等，2003）。因此超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶等许多酶类均可作为机体非特异性免疫指标，来评判病原菌对机体非特异性免疫力的影响。近年来国内外许多学
41、者已经通过自然感染或人工感染不同的鱼类，对鱼类的抗感染免疫机理进行了不同角度的研究。YILDIZ等1998研究了人工感染荧光假单胞菌（PSEUDOMONASFLUORESCENS对鲤鱼血液学参数的各种变化；孙峰等2005通过人工感染嗜水气单胞AHYDROPILA对鲫鱼白细胞数量、NBT阳性细胞数量以及血清溶菌酶活力的变化趋势，来研究感染病原菌对鱼类非特异性免疫功能的影响；鄢庆枇、张俊杰等2007研究了人工感染溶藻弧菌对大黄鱼免疫功能的影响，洪婧妮等2009人研究了哈维氏弧菌和溶藻弧菌感染大黄鱼24H后，对部分组织中6种酶活性的影响。这些鱼类的许多非特异性免疫指标可作为它们健康状况和抗感染免疫能
42、力强弱的标志。而从免疫学角度进行水产养殖病害防治研究，通过提高鱼体非特异性免疫机能从而提高其抗病能力，减少疾病的发生，已成为目前水产动物疾病预防与控制研究领域的热点。在免疫增强剂研究方面，鄢庆枇、王军等采用低聚糖益力素等免疫营养物投喂大黄鱼提高了溶菌酶活力、抗菌活力、白细胞数量和吞噬能力（鄢庆枇等，2001；王军等，2001）；在免疫预防方面，吴志鹏等人研究了采用不同方法制备的溶藻弧菌、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌三联疫苗及不同的免疫途径对大黄鱼的免疫效果，结果表明福尔马林灭活疫苗注射免疫途径效果最佳（吴志鹏等，2004）；在中草药制剂的研究方面，郑天伦等人进行的大黄鱼弧菌病的中草药防治研究表明石
43、榴皮、地榆、五味子、大黄等4种药物对溶藻弧菌的抑菌作用显著（郑天伦等，2005）。尽管关于大黄鱼免疫功能的基础研究有所发展，但仍处于较薄弱阶段。而目前对大黄鱼抗感染的非特异性免疫机能研究也基本上是针对一种病原菌的感染后分析，尚未见有关引起大黄鱼溃疡病的不同病原菌之间的毒力差异及对大黄鱼免疫功能影响的差异性比较研究。本研究通过人工感染引起大黄鱼溃疡病的溶藻弧菌（VIBRIOALGINOLYTICUS）、副溶血弧菌（VPARAHAEMOLYTICUS）、哈维氏弧菌（VHARVEYI）等3种病原菌后，分析大黄鱼血清中7种免疫相关酶的变化特点，比较研究其致病机理和规律，对丰富大黄鱼免疫防御机制的理论基
44、础、免疫增强剂的筛选及提高免疫防治技术都具有重要理论意义和应用价值。2材料与方法21实验材料211实验用鱼大黄鱼来自浙江宁波象山黄避岙养殖海区，选择体表无明显伤痕，体重250300G之间，摄食正常的健康大黄鱼。212实验菌株哈维氏弧菌VHARVEYI、溶藻弧菌VALGINOLYTICUS、副溶血弧菌VPARAHAEMOLYTICUS等菌株，均分离自患病大黄鱼，并经回归感染试验证明具有较强毒力金珊，2005，保存于本5实验室。溶壁微球菌MICROCOCCUSLYSOLEIKTICUS购置SIGMA公司。213试剂L多巴上海伯奥生物科技公司214仪器电热恒温培养箱DHP9082型；SUNRISE吸
45、光酶标仪；恒温水浴锅；紫外分光光度计。22实验方法221各菌株感染浓度的确定将保存的哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌分别接种于50海水营养琼脂斜面上，28C恒温培养24H后，用085无菌生理盐水洗下菌苔，先经比浊法计数，最终采用平板倾注法计数活菌数。将各种菌液浓度调整至109CFUML1左右，再稀释成106，107，1083个梯度的菌悬液，备用。将健康大黄鱼随机分为4组，每组10尾，、和组分别腹腔注射上述备用的106，107，1083个浓度的菌悬液，每尾注射02ML，组注射02ML灭菌的生理盐水。观察注射后12周内各感染组鱼的死亡情况，最终确定试验时哈氏弧菌感染浓度为106CFUML1，溶藻弧
46、菌和副溶血弧菌感染浓度为107CFUML1。222实验分组购买的健康大黄鱼随机分成四组，放养于浙江省宁波市象山县黄避岙海水网箱养殖鱼排，网箱规格3M3M3M，试验期间水温281，海水盐度28，每组放养80尾，正常投喂，暂养1周后开始实验。223菌悬液的配置150海水营养琼脂培养基的制备称取普通营养琼脂商品培养基33G，溶于500ML蒸馏水中，加入500ML陈海水，加热搅拌，煮沸至完全溶解，在高压蒸气1054986KG/M2下灭菌20MIN，最终PH为7301，做无菌试验后备用。2菌液配制将保存的哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌分别接种于50海水营养琼脂斜面上，28C恒温培养24H后，用085无
47、菌生理盐水洗下菌苔，先经比浊法计数，调整哈氏弧菌菌液浓度至106CFUML1，调整溶藻弧菌和副溶血弧菌菌液浓度至107CFUML1。3菌液浓度计算采用平板倾注法，10倍稀释各组菌悬液，分别吸取稀释104、105和106的菌悬液进行平板倾注，然后在28恒温培养箱中，培养2428H后进行计数，计算感染所用各种菌悬液的活菌浓度。224人工感染大黄鱼用丁香酚麻醉后，进行腹腔注射感染，实验组，分别注射哈氏弧菌、溶藻弧菌以及副溶血弧菌，每尾注射02ML上述对应菌悬液，对照组每尾注射02ML灭菌的生理盐水。试验期间各组大黄鱼均未发生死亡现象。225样品采集在感染后第0D，1D，2D，4D，7D，10D，13
48、D，16D，20D分别从各感染组与对照组随机各取6尾大黄鱼，采用一次性注射器，尾静脉取血，各组制备三个平行血样后进行7种酶指标检测。6226血清溶菌酶活性的测定采用HULTMARK等1980的方法以溶壁微球菌为底物，将该菌用01MOL/L、PH64的磷酸钾盐缓冲液配成A57003的菌悬液，取30ML该菌悬液与200L待测血清于试管中混匀，于570NM处测定其A0，然后将试管置于37水浴保温30MIN，然后取出立即置冰浴中10MIN以终止反应，测定其A值，溶菌活力UL按下式计算ULA0A/A227血清酚氧化酶活性的测定以L多巴为特异性底物，采用改进的ASHIDA等1971方法在96孔酶标板中进行
49、。在96孔酶标板中加入10L血清，然后向各孔中加入200L01MOL/LPH60磷酸钾缓冲液，最后向各样品孔中加入10L的LDOPA液001MOL/L，在酶标仪中振荡4次混匀，每隔4MIN读取490NM处的吸光值OD。在该试验条件下，将每分钟OD值增加0001作为一个酶活力单位。228血清MPO、AKP、ACP、POD、SOD活性的测定根据购自南京建成生物技术研究所的试剂盒，分别测定试验组，和对照组大黄鱼血清中，髓过氧化物酶MPO、碱性磷酸酶AKP、酸性磷酸酶ACP、超过氧化物岐化酶SOD、过氧化物酶POD的活性。229数据处理对于试验所得数据应用EXCEL2003软件进行整理和作图；试验结果用SPSS130统计软件进行生物统计学分析；各组处理平均数之间采用LSD检验方法进行差异显著性比较。3结果与分析31血清溶菌酶LSZ活性变化血清溶菌酶活性变化趋势见图1。在感染后1D时，实验组、均极显著高于对照组P005。10D时，实验组有所下降与对照组差异显著P005；不同字母表示差异显著P005。结果显示感染后血清酚氧化酶活性在14D内发生了明显的变化，不同病原菌之间存在一定的时效差异。AAAAABAABBBC00204060811214160124710131620感染天数（D）DAYSPOS
