1、本科毕业设计（20_届）乳酸菌胞外多糖硒化条件优化所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言42材料和方法521菌种522主要药品和试剂523主要仪器设备524其他器材525实验步骤526实验方法5261乳酸菌胞外多糖发酵液制备5262乳酸菌胞外多糖提取6263乳酸菌胞外多糖硒化6264硒标准曲线的制备6265硒多糖中硒含量测定7266硒化条件优化73结果与分析731硒标准曲线732单因素分析7321硒化剂添加量对硒化反应的影响7322反应温度对硒化反应的影响8323反应时间对硒化反应的影响933正交分析934验证实验114结论115展望11致谢错误未定义书签
2、。参考文献12附录错误未定义书签。3摘要本文对乳酸菌胞外多糖的硒化条件进行了研究。以硒多糖中的硒含量为指标，对反应时间、硒化剂添加量、反应温度三个因素进行了L934正交实验。实验结果显示，最佳条件为反应时间14H、反应温度500、硒化剂添加量006MG/ML。在此条件下，得到的硒多糖中硒含量为27037G/G。本实验为其进一步研究奠定了基础。关键词乳酸菌胞外多糖；硒化；优化ABSTRACTTHISPAPER,OPTIMIZEDTHESELENATIONREACTIONCONDITIONSOFEPSDERIVEDFROMLACTOBACILLUSTHEL934ORTHOGONALEXPERIME
3、NTWASAPPLIEDTOOPTIMIZETHETHREEKEYFACTORSREACTIONTIME,SELENIUMADDITION,REACTIONTEMPERATUREFORSELENATIONREACTIONUSINGTHESELENIUMCONTENTOFSELENATIONPOLYSACCHARIDEASTHEINDEXTHERESULTSINDICATEDTHATTHEOPTIMALCONDITIONSFORTHESELENATIONREACTIONWEREASTHEFOLLOWINGREACTIONTIME14H,REACTIONTEMPERATURE500,SELENIU
4、MADDITION006MG/MLINTHEOPTIMALCONDITIONS,THESELENIUMCONTENTOFSELENATIONPOLYSACCHARIDEWAS27037G/GTHISSTUDYLAIDTHEFOUNDATIONFORFURTHERSTUDYKEYWORDSEPSDERIVEDFROMLACTOBACILLUSSELENATIONREACTIONOPTIMIZE141引言硒是生命系统中重要的微量必需元素之一，不能在体内合成，必须从食物中摄取。在生物体中，硒是谷胱甘肽过氧化物酶GSHPX、碘化甲状腺氨酸及哺乳动物硫氧还蛋白还原酶TRXR的重要活性中心1。尽管硒在人体
5、内的含量非常少，而且每日摄入量也极微，但却在人体的机能中发挥着极其重要的作用硒是人体谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）的重要组成部分，对清除体内大量有害的脂质过氧化物、延缓机体衰老有重要的作用2；含硒的GSHPX能破坏体内的一些环氧化物，阻断环氧化活化途径，改变致癌物的代谢方向，从而减少甚至消除致癌危险，因此硒也被科学家称之为人体微量元素中的“抗癌之王”3。同时，硒在防止糖尿病、防止心脑血管疾病、增强机体免疫力作用以及防止克山病和大骨节病这两种地方性疾病等方面都发挥着重要的作用4。但是，硒在地壳中含量不均，全球有40多个国家属于低硒和缺硒地区，中国也是一个缺硒国家，全国有72的人口存在不同程度的
6、硒摄入不足5。因此有必要在食物中强化硒含量，向人体补充硒元素，做为防治硒缺乏引起各种疾病及保健的有效措施。硒的存在形式有无机硒和有机硒两种。无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，毒性较大、其安全剂量和毒性阀值之间只是一个很小的范围，使用时剂量难以控制。作为补硒剂时，其应用受到限制。而有机硒的毒性低，副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上比无机硒显著，较之无机硒可较好地消除对细胞膜稳定方面的不利影响6。特别是生物态有机硒，毒性小，有利于人体吸收。多糖作为生命物质的组成成分之一，广泛存在于动物、植物和微生物中，它不仅为生物提供骨架结构和能量来源，还广泛参与细胞各种生理过程的调节。大
7、量实验证明，多糖具有多种多样的生物学功能多糖是一种很好的非特异性免疫调节剂，它可通过网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞等的作用，调节机体的免疫功能，提高宿主免疫能力，从而抑制肿瘤生长7；许多多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化等活性，起到保护生物膜和延缓衰老的作用8。除具有上述的多种生物活性功能外，多糖还具有其他多种生物活性，如对病毒的抑制作用、降血糖和调血脂作用、抗辐射作用、抗溃疡作用等9。通过对多糖进行硒化得到的硒多糖，是一种有机硒化合物，不仅能有效克服无机硒的局限，还兼有多糖的生理功能，其生物活性普遍高于多糖和硒，更易于为机体吸收和利用，是一种较好的补硒剂10。目前，多糖硒
8、化主要有微生物富集法和人工合成两种方法。微生物富集法获取硒多糖，即在适宜的培养条件下将无机硒添加到真菌、藻类、细菌等的培养基中，通过微生物的生长代谢，对硒进行富集和生物转化，从面获得硒多糖。根据此方法已成功获得了多种硒多糖，例如灵芝硒多糖11、香菇硒多糖12、紫球藻硒多糖13、螺旋藻硒多糖14、大蒜硒多糖15等。人工合成是指通过多糖上的某些基团例如自由羟基、醛基或酮基，与其它化合物发生反应，使多糖进行硒化修饰或合成16。如在温和条件下使用单体硒、亚硒酸或亚硒酸钠等对多糖进行硒化修饰；或利用化学性质活泼、具有酰氯结构的SEOCL2作为硒化试剂；或者将含硒的功能基团接枝到多糖分子上。目前，国内在乳
9、酸菌胞外多糖硒化方面的研究相对较少。而乳酸菌是目前食品生产中普遍使用的菌种，其在免疫调节，保持消化道微生物菌群平衡，保护消化道感染等方面的保健功能和可靠的安全性已经被广大消费者所认可。乳酸菌在生长代谢过程中分泌的胞外多糖具有调节胃肠道功能；调节免疫功能；抗肿瘤功能；抗高血压、抗氧化性、降低血清胆固醇等功能17。因此本实验，试图通对乳酸菌胞外多糖硒化的研究，以寻求获得最佳硒化条件，为进一步研究及开发做准备。52材料和方法21菌种乳酸乳球菌亚种由本实验室筛选并保存22主要药品和试剂硝酸（AR级）（130）亚硒酸钠（AR级）盐酸（01MOL/L和1MOL/L）01EDTA二钠盐溶液（称量01GEDT
10、A二钠溶于蒸馏水中，并定容于100ML容量瓶中）05邻苯二胺溶液（称量05G邻苯二胺溶于蒸馏水中，并定容于100ML容量瓶中）双氧水（AR级）甲苯（AR级）蒸馏水23主要仪器设备电热恒温水浴锅DK8D型上海一恒科技有限公司湘仪离心机H2500R2长沙湘仪离心机仪器有限公司旋转蒸发器旋转蒸发器RE522上海沪西分析仪器厂紫外可见分光光度计UV6000型上海元析仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌器LDZX50KB上海申安医疗器械厂实验室膜分离设备LNGNF101上海朗极化工科技有限公司玻璃仪器气流烘干器C型郑州杜甫仪器厂电热恒温鼓风干燥箱DHG9108A型上海精宏实验设备有限公司电子天平PL403梅特勒
11、托利多仪器（上海）有限公司超净工作台苏州科华净化设备有限公司真空冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司通风橱24其他器材锥形瓶、容量瓶、分液漏斗、玻璃棒、量筒、移液管、移液枪、烧杯、酒精灯、镊子等。25实验步骤基本路线胞外多糖发酵液离心去除菌体旋转蒸发浓缩乙醇沉淀（4冰箱过夜）收集沉淀、洗涤烘干粗多糖纯化硒化硒多糖中硒含量测定乳酸菌胞外多糖硒化条件优化单因素分析得出各因素水平范围正交试验法找出乳酸菌胞外多糖硒化最佳条件验证实验1826实验方法261乳酸菌胞外多糖发酵液制备将乳酸乳球菌接种到本研究室改良的BLX培养基中即在培养基的基础上优化了培养基成分，放入37恒温培养箱中培养后，按03的接种量活
12、化两次，培养12H后，即成为种子培养基；扩大培养的发酵条件是发酵温度35，初始PH值为60，接种量，发酵时间为24H，即可得所需要的乳球菌产胞外多糖的发酵液。BLX培养基配方，见表16表1BLX培养基配方TAB1THEBLXCULTUREMEDIUM液体培养基的配方蛋白胨125G胰蛋白胨125G葡萄糖10G果糖10G柠檬酸三铵2G磷酸氢二钾2G水合硫酸镁02G水合硫酸锰02G醋酸钠5G酵母浸膏5G吐温801G水1000ML121灭20MIN262乳酸菌胞外多糖提取提取步骤乳酸菌培养液离心去除菌体5000R/MIN，20MIN去除蛋白加双氧水水浴脱色旋转蒸发器中浓缩乙醇沉淀4冰箱过夜收集沉淀洗涤
13、乳酸菌胞外粗多糖柱层析纯化冷冻干燥精制EPS。具体操作将乳酸菌的培养液用高速冷冻离心机下在5000R/MIN的条件下离心20MIN后取上清液，以去除菌体。去蛋白，再将PH调节为67，在调好PH的溶液中，加入五分之二左右体积的双氧水，并在4050中水浴25H35H，其目的是脱色。再将溶液置于旋转蒸发器中浓缩，再加入浓缩液4倍体积的乙醇放在4冰箱过夜，让多糖沉淀，将沉淀收集，并洗涤，得到的沉淀即为乳酸菌胞外粗多糖，经柱层析纯化，进行冷冻干燥后，得到精制EPS19。263乳酸菌胞外多糖硒化取03MG的乳酸菌胞外多糖粉末放入三角瓶中，加入体积分数为05的硝酸水溶液10ML，加热搅拌使多糖全部溶解，再经
14、水浴加热到相应的温度，加入相应量的NA2SEO3和BACL2，反应相应的时间后。冷却到室温，用NA2CO3调PH56，加入适量无水NA2SO3沉淀反应液中的氯化钡，用高速冷冻离心机下在5000R/MIN的条件下离心20MIN后取上清液，再用无水乙醇沉淀4冰箱过夜，收集沉淀，透析24H，冷冻干燥后，即为硒多糖。264硒标准曲线的制备硒标准液配制精密称取亚硒酸钠1G置于100ML量瓶中用硝酸130溶解并定容至刻度，稀释成含硒001G/ML的溶液，取1ML该溶液至于100ML容量瓶中用硝酸130溶解并定容至刻度，稀释成含硒100G/ML的标准液。硒标准工作液吸取LML硒标准溶液置于L00ML容量瓶。
15、以01MOL/LHCL溶液稀释至刻度，混匀，得到的溶液每毫升相当于LG硒。7精确量取硒标准工作液1G/ML00、02、04、08、16、20和32ML相当00、02、04、08、16、20和32GSE，加20ML蒸馏水后，添加2ML01EDTA二钠盐溶液，再用1MOL/L的HCL溶液调PH值至1525，加2ML05邻苯二胺溶液，摇匀，暗处放置40MIN。后添加10ML甲苯并摇动2MIN，静置10MIN。取甲苯层，用1CM比色皿测定吸光度。标准溶液测定以不含SE对照品液的溶液为空白对照。平行测定3次。计算吸收度的平均值。紫外测定波长为335NM20。265硒多糖中硒含量测定将得到的硒多糖称重。加
16、入硝酸130，加热使硒多糖溶解，并定容到100ML的容量瓶中，取1ML该溶液，加20ML蒸馏水后，添加2ML01EDTA二钠盐溶液，再用1MOL/L的HCL溶液调PH值至1525，加2ML05邻苯二胺溶液，摇匀，暗处放置40MIN。后添加10ML甲苯并摇动2MIN，静置10MIN。取甲苯层，用1CM比色皿在波长335NM下测定吸光度。再根据得到的硒含量标准曲线，得到硒含量XG，再算出硒多糖中硒含量。硒含量G/GXG100/硒多糖质量G）266硒化条件优化针对乳酸菌胞外多糖硒化反应中的硒化剂添加量、反应温度、反映时间三个主要影响因素，以硒多糖中的硒含量为指标，首先通过单因素梯度试验，在保持其他硒
17、化条件不变的情况下，分析在各自单一变量条件下的最佳条件。根据这三个培养条件单因素分析的结果再进行正交实验，分析确定最佳硒化条件。最后根据分析所得的最佳硒化条件进行验证实验。实验中为减小误差，每次实验都做了3组平行，取平均值。3结果与分析31硒标准曲线用配制的硒标准系列溶液，用紫外分光光度计在波长335NM下测定吸光度，以吸光度为纵轴，硒含量为横轴，以吸光度Y对硒含量X，UG进行线性回归分析。得到回归方程为Y00557X000480，相关系数R209956，如图1所示Y00557X00048R2099560002004006008010120140160180201234硒含量G吸光度图1硒含量
18、的标准曲线FIG1THESTANDARDCURVEOFSELENIUMCONTENT32单因素分析321硒化剂添加量对硒化反应的影响8在保持反应温度为50，反应时间为6H不变的条件下，硒化剂添加量与硝酸添加量比为分别为002MG/ML、004MG/ML、006MG/ML、008MG/ML、010MG/ML、012MG/ML六个水平进行实验。将所得到的硒多糖，按照步骤265测定硒含量。以反应液中硒化剂添加量为横坐标，产物的硒含量为纵坐标绘制曲线图，见图21。120125130135140145150155160000200400600801012014硒化剂添加量MG/ML硒含量G/G图21硒化
19、剂添加量对硒化反应的影响FIG21EFFECTOFSELENIUMADDITIONONSELENATIONREACTION由图21可知在保持反应温度为50，反应时间为6H不变时，当硒化剂的加入量由002MG/ML增加至006MG/ML时，产物中硒含量显著增加，增加辐度较大。而当硒化剂的加入量由006MG/ML增加到012MG/ML时，产物硒含量的增加不明显，增加辐度呈减弱趋势。综合经济方面的考虑，硒化剂的加入量006MG/ML为此因素的最佳条件。322反应温度对硒化反应的影响在保持硒化剂的添加量为006MG/ML，反应时间为6H不变的条件下，反应温度分别为30、40、50、60、70、80六个
20、水平进行实验。将所得到的硒多糖，按照步骤265测定硒含量。以反应温度为横坐标，以产物中硒含量为纵坐标绘制曲线图，见图22。1301351401451501552030405060708090反应温度硒含量G/G图22反应温度对硒化反应的影响FIG22EFFECTOFTEMPERATUREONSELENATIONREACTION9由图22可知在保持硒化剂的添加量为006MG/ML，反应时间为6H不变的情况下，当温度小于50时，随着温度的增加，产物中的硒含量逐渐增加。而当反应温度超过50时，产物硒含量则呈下降趋势。反应时间在14H时，产物中硒含量最高。因此，反应温度50为此因素的最佳条件。323反
21、应时间对硒化反应的影响在保持硒化剂的添加量为006MG/ML，反应温度为50不变的条件下，反应时间分别为2H、6H、10H、14H、18H、22H六个水平进行实验。将所得到的硒多糖，按照步骤265测定硒含量。以反应时间为横坐标，以产物中硒含量为纵坐标绘制曲线图，见图23。901101301501701902102302502702900510152025反应时间H硒含量G/G图23反应时间对硒化反应的影响FIG23EFFECTOFTIMEONSELENATIONREACTION由图23可知在保持硒化剂的添加量为006MG/ML，反应温度为50不变的情况下，当反应时间在14H以内时，随着反应时间
22、的延长，产物中硒的含量呈上升趋势；而当反应时间超过14H时，产物硒含量则逐渐降低。反应时间在14H时，产物中的硒含量最高。因此，反应时间14H为此因素的最佳条件。33正交分析根据之前所做的分别针对硒化剂添加量、反应温度、反映时间影响硒化反应的三个主要因素进行的单因素实验结果，确定三因素三水平L934的正交试验中三个因素的设置分别为，硒化剂添加量002MG/ML、006MG/ML、010MG/ML；反应温度40、50、60；反映时间10H、14H、18H。具体因素水平见表2表2正交因素水平表TAB2FACTORSANDLEVELSOFORTHOGONALEXPERIMENT水平硒化剂添加量MG/
23、ML反应温度反应时间H100240102006501430106018按照三因素三水平L934正交表的实验设置进行9次实验，实验结果的直观分析见表3，方差分析见表410表3正交实验结果和直观分析TAB3RESULTSOFORTHOGONALEXPERIMENTSANDVISUALANALYSIS实验号ABC硒含量G/G111110034212224654313320226422323119523111227621222789733220163831310264932113331K1549144308734592K2571356110467606K3437585161653609K1183047
24、143623115307K2190450203680225353K3145860172053178697极差R4459060057110046因素主次CBA优方案C2B2A2表4正交实验方差分析表TAB4VARIANCEANALYSISOFORTHOGONALEXPERIMENT差异源偏差平方和自由度F比F临界值（010）显著性A3425926206473460B5415314210233460C18305405235723460误差28976256从表3的直观分析中的极差数据可知，本次实验中针对硒化剂添加量、反应温度、反映时间这三个影响乳酸菌胞外多糖硒化反应的主要因素中，影响乳酸菌胞外多糖硒
25、化反应的因素主次关系为C（反应时间）B（反应温度）A（硒化剂添加量）。表3中确定实验的最佳硒化条件为C2B2A2。也就是反应时间为14H、反应温度为50、硒化剂添加量为006MG/ML。另外，表4的方差分析表明乳酸菌胞外多糖硒化反应中反应时间对乳酸菌胞外多糖硒化反应有显著的影响（010），硒化剂添加量和反应温度对硒化反应不存在显著的差异（010）。1134验证实验根据正交实验结果的数据分析得出的最佳硒化条件为C2B2A2，也就是反应时间为14H、反应温度为50、硒化剂添加量为006MG/ML。这个实验各因素水平的组合在正交试验中没有出现，须通过实际实验来验证理论分析的结果，故做验证实验来进一步
26、验证正交实验中得到的最佳条件是否可行。表5验证实验结果TAB5THERESULTOFVERIFICATIONEXPERIMENT实验编号C反应时间HB反应温度A硒化剂添加量MG/ML硒含量G/G114500062709821450006268763145000627137验证实验的3组平行实验结果表明反应时间为14H、反应温度为50、硒化剂添加量为006MG/ML的条件下，硒含量为27037G/G。此结果显著大于正交实验中的各个结果。这说明正交试验分析得出的乳酸菌胞外多糖硒化最佳条件C2B2A2，也就是反应时间14H、反应温度50、硒化剂添加量006MG/ML是可行的。4结论本实验对乳酸菌胞外
27、多糖硒化条件进行了优化，在众多乳酸菌胞外多糖硒化反应的影响因素中考察了硒化剂添加量、反应温度和反映时间三个因素。先在保持其他硒化条件不变的情况下，依次对各个因素进行单因素分析确定各自的最佳因素水平。然后根据单因素分析的结果合理设置了三因素三水平的L934正交实验。通过对正交实验结果的分析，确定了影响乳酸菌胞外多糖硒化即影响硒化反应得到的硒多糖中硒含量的因素主次关系为C（反应时间）B（反应温度）A（硒化剂添加量）。并且通过实际的验证实验表明最佳硒化条件为反应时间14H、反应温度50、硒化剂添加量006MG/ML，在此硒化条件下，硒化反应得到的硒多糖中硒含量为27037G/G。实验中对硒化条件优化
28、，可确定乳酸菌胞外多糖硒化快速和节约成本的工艺，对其他多糖硒化的研究也有一定的帮助。5展望硒元素是人类所必需的微量元素之一，对人体健康有着非常重要的做作用，同人体的健康有着密不可分的关系。人体硒的主要来源是食物，但食物中硒含量普遍较低，无法满足人体的需要。在当前硒摄入普遍不足的情况下，如何合理、安全地满足人体的硒需要，是关系到亿万人民健康的大事。同时近年来，硒由于它在抗炎、防止心血管疾病、抗肿瘤、抗衰老以及治疗神经疾病相关等方面的应用，已成为国内外学者研究、开发的热点21，并取得了很大进展。如目前已在进行临床研究的含硒药物依布硒林，它不仅抗氧化活性高，而且毒性极低，被公认为是GSHPX的最佳模
29、拟物22。而硒多糖作为有机硒，兼有硒与多糖两者的活性，更易于为机体吸收和利用，无疑具有广阔的应用前景。虽然近年来对硒多糖的研究取得了较大的进展，其广泛的生物活性和功能也逐渐被发现。但目前对于硒多糖的分离纯化和生物活性方面研究较多，而其结构测定，构效关系以及多糖硒化方面的研究则相对滞后，还有很多不足。如通过富硒载培或微生物培养所得硒多糖硒含量不高；化学合成硒多糖中常使用大量的有机溶剂，产品既不安全又容易污染环境，而且存在硒结构相对单一等缺点。随着硒多糖研究理论的完善、构效关系的阐明、多糖硒化的不断研究，硒多糖在各个领域将会得到更加广泛的应用。12参考文献1凌翠,钟武,李松有机硒潜在药物的研究进展
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