1、本科毕业设计（20_届）假微型海链藻DGAT基因的重组质粒构建所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录摘要引言11绪论111生物柴油的研究现状112藻类的特点213二脂酰甘油酰基转移酶DGAT的研究现状2131二脂酰甘油酰基转移酶DGAT的特点2132DGAT基因对肌内脂肪含量的影响2133拟南芥中DGAT活性变化32实验材料321DGAT片段322菌株323质粒3231表达质粒3232对照质粒424引物425药品和常用药剂4251酶和生化试剂4252抗生素4253其他试剂4254培养基的配制53实验方法531质粒抽提（试剂盒）532电泳检测633质粒双酶切634DNA
2、片段回收（试剂盒）735目的基因的获取7351PCR扩增目的基因7352割胶回收目的基因（试剂盒）836大肠杆菌DH5感受态的制备837连接与转化9371连接（采用INFUSIONPCRCLONINGKIT试剂盒）9372转化9373PCR检测重组质粒94结果941目的基因PCR扩增1042电泳检测割胶回收图1043PCR检测重组质粒1044测序结果115小结11参考文献13附录15I摘要在高产油微藻假微型海链藻中，二酰甘油酰基转移酶（DGAT）是三酰甘油合成途径的关键酶。本研究试验采用INFUSIONPCRCLONINGKIT试剂盒进行重组质粒的构建，从而解决PCAMBIA1300表达质粒的
3、多克隆位点在DGAT基因序列的酶切位点上都存在的问题。用XBA和KPN限制性内切酶对PCAMBIA1300质粒进行双酶切得到线性质粒。根据此试剂盒的引物设计原理，利用线性表达质粒的序列和已知DGAT基因序列设计引物，以用于进行DGAT基因的PCR扩增，得到目的片段。使用此试剂盒特有的INFUSION连接酶连接目的片段和表达质粒，该酶不受酶切位点的限制可高效连接目的片段和表达质粒，从而构建含假微型海链藻DGAT基因的重组质粒。该质粒适用于研究拟南芥三酰甘油含量的变化及该基因在拟南芥中的表达定位。关键词假微型海链藻；尼罗红；乙酰辅酶A羧化酶；二酰甘油酰基转移酶ABSTRACTTHALASSIOSI
4、RAPSEUDONANAISTHEOLEAGINOUSALGA,ANDITSDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEDGATISTHEKEYENZYMEINSYNTHESISPATHWAYOFTRIGLYCERIDETHEEXPERIMENTCONSTRUCTSRECOMBINANTPLASMIDUSINGINFUSIONPCRCLONINGKIT,INORDERTOSOLVETHEPROBLEMOFTHEMULTIPLECLONINGSITESOFPCAMBIA1300ARETHESAMETOTHERESTRICTIONSITESOFDGATTHELINEARPLASMID
5、OBTAINEDBYDOUBLEENZYMECLEAVAGEOFPCAMBIA1300PLASMIDWITHXBAANDKPNBASEDONTHEPRINCIPLEOFPRIMERDESIGNINGINTHEKIT,THEPRIMERISDESIGNEDWITHTHESEQUENCEOFLINEARPLASMIDANDTHESEQUENCEOFDGATGENETOOBTAINTHEFRAGMENTTARGETDNAFRAGMENTANDEXPRESSIONPLASMIDISCONNECTEDBYUNIQUEINFUSIONLIGASEOFTHEKITTHEENZYMECANCONNECTTHE
6、DNAFRAGMENTANDEXPRESSIONPLASMIDEFFICIENTLYWITHOUTTHERESTRICTIONSOFRESTRICTIONSITE,SOTHATWECANCONSTRUCTRECOMBINANTPLASMIDWHICHCONTAINSTHEDGATGENEOFTHALASSIOSIRAPSEUDONANATHEPLASMIDCANBEUSEDFOROBSERVINGTHECONTENTCHANGEOFTRIACYLGLYCEROLINARABIDOPSISTHALIANAANDTHEEXPRESSIONOFTHEGENEINARABIDOPSISTHALIANA
7、KEYWORDSTHALASSIOSIRAPSEUDONANANILEREDACETYLCOACARBOXYLASEDIACYLGYCEROLACYLTRANSGERASE2引言随着日益严重的环境恶化,控制汽车尾气排放和温室效应,保护人类赖以生存的自然环境成为人类急需解决的问题。同时全球能源需求不断扩大,寻求可以替代石油在能源结构中占主导地位的可再生清洁能源是目前普遍关注的热点。生物柴油主要以玉米、大豆等农作物为主要生产原料，是摆脱对传统石化能源依赖、减少温室气体排放的替代能源。生物柴油是典型“绿色能源”，大力发展生物柴油对经济可持续发展，推进能源替代，减轻环境压力，控制城市大气污染具有重要的
8、战略意义。微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，它是由阳光驱动的细胞工厂，通过微藻细胞高效的光合作用，吸收CO2，将光能转化为脂肪或淀粉等化合物的化学能，并放出O2。微藻是光合效率最高的原始植物，也是自然界中生长最为迅速的一种低等植物，而且某些微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，还可以利用工业废气中的CO2。因此，微藻生物柴油成为了潜在的能源研究热点。目前的产油藻主要是葡萄藻（BOTRYOCOCCUSBRAUNII）1,2、小球藻（CHLORELLAPYRENOIDOSA）3,4等
9、。本实验室已利用尼罗红染色法对宁波大学微藻种质库的63株微藻进行了筛选并跟踪了其中3株微藻的中性脂积累过程。对微藻中性脂合成关键酶乙酰辅酶A羧化酶（ACCASE、ACCASE）和二酰甘油酰基转移酶（DGAT）进行了研究，包括3株硅藻ACCASE、ACCASE和DGAT基因的克隆和序列分析；假微型海链藻（THALASSIOSIRAPSEUDONANA）ACCASE、ACCASE和DGAT基因的实时荧光定量RTPCR。研究结果显示中性脂的积累与3种关键酶的表达水平有关，其中DGAT表达水平的差异大于ACCASE和ACCASE，表明脂类的积累可能与DGAT的表达更加相关。随后又采用3RACE和5RA
10、CE的方法得到假微型海链藻DGAT基因的CDNA全长序列，经BLAST后证明为DGAT基因。为进一步验证其功能，我们构建含DGAT基因的异源重组质粒，以用于在拟南芥中的表达分析。主要采用INFUSION基因克隆法构建含DGAT基因的重组质粒，将重组质粒导入根癌农杆菌中去侵染野生型拟南芥，从而观察野生型拟南芥三酰甘油的合成量变化。1绪论11生物柴油的研究现状生物柴油，又称单烷基脂肪酸酯，是以动、植物油脂为原料，与醇类经转酯作用获得的3单烷基脂肪酸酯，是一种已经得到证明的燃料,以其为可再生性的环保燃料能源而得到世界的广泛关注5。与石油柴油等其他燃料液体相比，生物柴油具有优良的环保性、安全性能高、燃
11、烧性能好、可再生性和使用方便等特点。目前,生物柴油主要是以植物和动物脂肪酸为原料来生产的,而不是微藻。但是,由油料作物、废食用油和动物脂肪酸生产的生物柴油尚不能满足当前车用燃料需求量的一小部分。面对植物原料生产生物柴油的诸多问题,利用微藻产油具有不与农业争地的明显优势,而且可用海水作为天然培养基进行大量繁殖。跟植物一样,微藻也是利用光照产油,但却比植物作物的效率高很多。12藻类的特点藻类是最低等的、自养的放氧植物，它是低等植物中种类繁多、分布极其广泛的一个类群。无论是海洋、淡水湖泊等水域，或是潮湿的土壤、树干等处，几乎在有光和潮湿的任何地方都能生存。藻类通过热解可获得生物质燃油，是重要的可再生
12、生物能源；通过农业化学技术可从一些富含脂肪的微藻中提取油脂，用于制备生物柴油和食用油；藻类中还含有多种维生素、胡萝卜素、蛋白质、脂肪酸等成分，是药用活性物质的来源；藻类还可用于污水处理等。地球上的生物每年通过光合作用可固定8X1010吨碳，生产146X1011吨的生物质，其中40应归功于藻类的光合作用3。因此，藻类生物与人类的生存和发展有极其密切的关系，是重要的可再生生物资源。13二脂酰甘油酰基转移酶DGAT的研究现状131二脂酰甘油酰基转移酶DGAT的特点二脂酰甘油酰基转移酶（DIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASE,DGAT）是一种甘油酰基转移酶，该酶与脂肪代谢、脂类在组
13、织中的沉积有很大的关系，它的主要作用机制是使二酰甘油（DIACYLGYCEROL,DAG）加上脂肪酸酰基形成三酰甘油（TRIACYLGYCEROL,TAG）。在植物中，TAG的合成在种子油脂的形成中起了十分重要的作用6。到目前为止，在植物中共发现3类DGAT基因家族，包括DGAT1、DGAT2和DGAT3基因家族7,8。DGAT3基因家族是SAHA等7从发育中的花生子叶细胞质中克隆的一个与TAG合成相关的基因，该基因属于DGAT基因家族，但是与DGAT1和DGAT2基因家族的相似性不足10，因此将其称为DGAT3基因。DGAT1基因家族只存在于动物和植物中912。高等植物DGAT1蛋白的氨基酸
14、残基数一般在480550之间，不同物种的DGAT氨基端前100个氨基酸残基相似性较低低于20，而位于100以后的氨基酸残基相似性较高大于70，可能正是这种N端的差异导致不同植物DGAT1酶属性的不同13。拟南芥中的DGAT1基因比其他植物更早发现14。DGAT2基因家族4的成员与DGAT1基因家族没有明显的相关性。DGAT2酶是机体内一种非常重要的酶,它被认为是控制高甘油三酯TAG所致疾病,如高血糖、冠病、脂质代谢紊乱、脂肪肝、高甘油三酯血症等代谢异常综合征等的潜在标靶1518。对于植物DGAT2的研究较少，目前已知的植物DGAT2蛋白氨基酸残基数在320左右。DGAT3基因目前只在花生中发现
15、，其蛋白序列与上面两种DGAT家族同源性很低，但是具有类似DGAT蛋白功能基序7。132DGAT基因对肌内脂肪含量的影响DGAT相关基因可能对肌内脂肪含量产生重要影响，从而影响肉质，该基因极有希望成为影响肉质性状肌内脂肪含量候选基因。证据如下（1）DGAT酶直接参与三酰甘油的合成9；（2）EST分析证明，DGAT1基因不仅在牛乳腺中表达，而且在牛脂肪组织中表达18；（3）放射杂交定位法将DGAT基因定位于牛14号染色体19CM处，与CSSM66紧密连锁19,20，而影响牛肌内脂肪含量的QTL区间内正好存在该基因（4）猪DGAT1基因定位于SSC4P15，在这一区域内存在可能影响猪生长速度、肌内
16、脂肪含量和脂肪酸组成的QTL2123。在NCBI中已有猪DGAT1基因CDNA及DNA全长和遗传位置，但其物理位置如何还需进一步确定，猪DGAT2基因的研究仍是空白。迄今为止，国内外尚未开展鸡、鸭、鹅等禽类DGAT相关基因的研究。133拟南芥中DGAT活性变化研究发现，拟南芥TAG1基因插入突变体AS11中，种子DGAT1活性降低，同时三酰甘油含量降低；脂肪酸组成发生变化，其中花生酸201、油酸181含量降低，而亚麻酸183作为三酰甘油的主要脂肪酸大量积累，亚油酸变化不大。通过构建野生型ATDGAT1基因CDNA单拷贝表达载体对AS11进行基因互补研究，发现能够弥补突变体的缺陷，表型与野生型相
17、似24。而对ATDGAT1基因在野生型拟南芥中过量表达的研究发现，DGAT1转录水平和活性明显提高，油脂积累增加1070。目前提高种子中三酰甘油积累的水平，最后一步反应是分子操作的主要靶标13。2实验材料21DGAT片段实验室已得到的含有DGAT基因的PMD18T重组质粒。22菌株大肠杆菌DH5菌株，基因型为SUPE44LACU16980LACZM15HSDR17RECA1ENDA1GYRA96THI1RELA1。23质粒5231表达质粒采用PCAMBIA1300人工改造质（图1）粒作为表达载体，该载体能携带外源基因在拟南芥中高效复制与表达，由浙江大学吴老师实验室自己改造，宁波大学的丁沃娜老师
18、赠送。该载体是植物双元表达载体，使用的是花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子启动目的基因，35S启动子是一个组成型表达的启动子。启动子后面插入的序列是包括起始密码子到终止密码子的CDS序列。PCAMBIA130010107BPKPNIXBAICAMV35SPROMOTERCAMV35SPROMOTERMCSKANAMYCINR图1PCAMBIA1300人工改造质粒232对照质粒PUC19（随TAKARA的INFUSIONPCRCLONINGKIT试剂盒附送）24引物本实验所用引物均由上海英骏生物技术有限公司合成用于合成目的片段的引物（根据TAKARA网上在线工具设计）P15GACGAGCTG
19、AGCTCGGTACCATGCATCGTCAATCC3P25GCAGGTCGACTCTAGATTATAACTCGGAATG3P15GACGAGCTGAGCTCGGTACCATGCATCGTC3P25GCAGGTCGACTCTAGATTATAACTCG325药品和常用试剂251酶和生化试剂限制性内切酶KPN、XBATAKARA公司TAQDNA聚合酶、DNTP等TAKARA公司DNA片段回收纯化试剂盒TAKARA公司DNA胶回收试剂盒TAKARA公司6质粒抽提试剂盒TAKARA公司INFUSIONPCRCLONINGKIT试剂盒TAKARA公司252抗生素抗生素贮存浓度工作浓度氨卞青霉素（AMPI
20、CILLIN）50MG/ML50G/ML卡那霉素（KANAMYCIN）50MG/ML25G/ML253其他试剂100MMOL/LCACL2称取11G无水CACL2溶于DDH2O并定容至100ML，装于250ML三角瓶中，高压灭菌后4保存。TE缓冲液10MMOL/LTRISHCLPH80，1MMOL/LEDTAPH80,高压灭菌后4保存。异丙基D硫代半乳糖苷（IPTG）24MG/ML，20保存。XGAL20MG/ML，20保存。50TAE2MTRIS醋酸，100MMNA2EDTA2H2O。254培养基的配制2541LB培养基（100ML）成分含量（G）细菌培养用胰化蛋白1细菌培养用酵母提取物05
21、NACL1加H2O至100ML加热并摇匀使完全溶解，用5MOL/LNAOH调节PH值至70，121高压蒸汽灭菌。配制固体培养基时加入细菌用琼脂15G，灭菌后待培养基温度降至50左右加入不耐热的抗生素、IPTG、XGAL，摇匀后铺平板。2542NML3培养液（1L）营养成分含量（G）KNO3100KH2PO410EDTANA220C6H5O7FE5H2O1MNSO4057VB16103VB125105NA2SIO3（硅藻）2加已煮沸灭菌的海水至1L3实验方法31质粒抽提（试剂盒）（1）挑一单菌落于含卡那霉素的LB液体培养基上37振荡培养过夜。（2）取15ML过夜培养菌液，12,000RPM下离心
22、2MIN，弃上清并使细菌沉淀尽可能干燥。（3）用250LSOLUTIONI充分悬浮细菌沉淀，剧烈振荡。（4）加入250L的SOLUTION轻轻地上下翻转混合56次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。（5）加入400L的4预冷的SOLUTION，轻轻上下翻转混合56次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2MIN。（6）室温12,000RPM离心10MIN，取上清。（7）将试剂盒中的SPINCOLUMN安置于COLLECTIONTUBE上。（8）将上述操作6的上清液转移至SPINCOLUMN中，12,000RPM离心1MIN，弃滤液。（9）将500L的RINSEA加入SPINCOLUM中，12,000R
23、PM离心30SEC，弃滤液。（10）将700L的RINSEB加入SPINCOLUMN中，12,000RPM离心30SEC，弃滤液。（11）重复操作步骤10。（12）将SPINCOLUMN安置于COLLECTIONTUBE上，12,000RPM离心1MIN。（13）将SPINCOLUMN安置于新的15ML的离心管上，在SPINCOLUMN膜的中央处加入60L的60预热灭菌蒸馏水，室温静置1MIN。（14）12,000RPM离心1MIN洗脱DNA。32电泳检测（1）1琼脂糖凝胶的制备称取03G琼脂于三角瓶中，加入30ML的1TAE缓冲液，加热混匀。选择合适的梳子和凝胶板装整齐，待胶稍凉后加入EB（
24、溴化乙啶）染色剂，均匀倒到制胶板中，待胶凝固后拔出梳子。（2）将1琼脂糖凝胶置于电泳槽内，倒入1TAE缓冲液，淹没凝胶。（3）选择合适的DNAMARKER作为对照。（4）以DNA6LOADINGBUFFER为51的比例上样。（5）电压80V，时间50MIN。833质粒双酶切PCAMBIA1300质粒双酶切XBAI酶切PCAMBIA1300质粒体系XBAI2L10MBUFFER4L01BSA4L质粒30L总体系40L374H水浴。然后电泳检测酶切质量，酶切完全后用DNA片段回收纯化试剂盒回收。KPNI酶切PCAMBIA1300质粒体系KPNI2L10LBUFFER4L线性质粒28L无菌水6L总体
25、系40L374H水浴。然后电泳检测酶切质量，酶切完全后用DNA片段回收纯化试剂盒回收双酶切质粒，然后20保存。34DNA片段回收（试剂盒）（1）向酶促反应液加入3倍量的DBBUFFER，然后均匀混合。（2）将试剂盒中的SPINCOLUMN安置于COLLECTIONTUBE上。（3）将上述操作1的溶液转移至SPINCOLUMN中，12,000RPM离心1MIN，弃滤液。（4）将500L的RINSEA加入SPINCOLUMN中，12,000RPM离心30SEC，弃滤液。（5）将700L的RINSEB加入SPINCOLUMN中，12,000RPM离心30SEC，弃滤液。（6）重复操作步骤（5）。（7
26、）将SPINCOLUMN安置于COLLECTIONTUBE上，12,000RPM离心1MIN。（8）将SPINCOLUMN按置于新的15ML的离心管上，在SPINCOLUMN膜的中央处加入20L的灭菌水，室温静置1MIN。（9）12,000RPM离心1MIN洗脱DNA。35目的基因的获取351PCR扩增目的基因9所用引物（根据假微型海链藻DGAT基因和INFUSIONPCRCLONINGKIT试剂盒设计）A15GACGAGCTGAGCTCGGTACCATGCATCGTCAATCC3A25GCAGGTCGACTCTAGATTATAACTCGGAATG3B15GACGAGCTGAGCTCGGTAC
27、CATGCATCGTC3B25GCAGGTCGACTCTAGATTATAACTCG3目的基因反应体系对照反应体系去离子水17L去离子水178L10BUFFER25L10BUFFER25LMG215LMG215LDNTP2LDNTP2L上引物05L上引物05L下引物05L下引物05LCDNA08LCDNA0LTAG酶02LTAG酶02L总体积25L总体积25L352割胶回收目的基因（试剂盒）（1）在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶。（2）切碎胶块。（3）称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1MG1L进行计算。（4）向胶块中加入胶块融化液DRIBUFFER，体积为3个凝胶体积量。（
28、5）均匀混合后75加热融化胶块。此时应间断振荡混合，使胶块充。分融化（约610MIN）。（6）向上述胶块融化液中加入DRIBUFFER量的1/2体积量的DRIIBUFFER，均匀混合。（7）将试剂盒中的SPINCOLUMN安置于COLLECTIONTUBE上。（8）将上述操作6的溶液转移至SPINCOLUMN中，12,000RPM离心1MIN，弃滤液。（9）将500L的RINSEA加入SPINCOLUMN中，12,000RPM离心30SEC，弃滤液。（10）将700L的RINSEB加入SPINCOLUMN中，12,000RPM离心30SEC，弃滤液。（11）重复操作步骤10。10（12）将SP
29、INCOLUMN安置于COLLECTIONTUBE上，12,000RPM离心1MIN。（13）将SPINCOLUMN安置于新的15ML的离心管上，在SPINCOLUMN膜的中央处加入20L的灭菌蒸馏水，室温静置1MIN。（14）12,000RPM离心1MIN洗脱DNA。36大肠杆菌DH5感受态的制备（1）挑取单菌落接种于3MLLB液体培养基中，37150RPM振荡培养过夜活化；（2）取03ML菌液加入到20ML新鲜LB液体培养基中，37250RPM振荡培养3H，使OD260达到0305；（3）菌液冰浴15MIN后，4，3000RPM离心10MIN收集菌体；（4）用20ML冰预冷的无菌的01MC
30、ACL2溶液悬浮细菌沉淀，冰浴30MIN；（5）4，3000RPM离心10MIN收集菌体；（6）用2ML冰预冷的无菌且含15甘油的01MCACL2溶液重新悬浮细菌沉淀；（7）冷冻后于70保存。（8）检测感受态的转化效率。37连接与转化371连接（采用INFUSIONPCRCLONINGKIT试剂盒）（1）体系INFUSION酶1L5BUFFER25L目的DNA1L线性质粒4L无菌水2L总体系10L（2）37温育1H50温育1H加入40LTEBUFFER372转化（1）将50LTEBUFFER稀释过的连接液全部加到含100L大肠杆菌DH5感受态中。（2）冰育30MIN。（3）42热激90S。（4
31、）冰中放5MIN。（5）加入450L新鲜LB液体培养基。（6）37摇菌1H。11（7）各取200L铺板。（8）将平板置于37过夜培养。373PCR检测重组质粒（1）挑取单菌落接种于3MLLB液体培养基（卡那霉素）中，37120RPM振荡培养过夜活化。（2）用质粒抽提试剂盒提取质粒。（3）PCR检测是否为重组质粒采用目的片段对应的引物、一般的PCR体系和流程。（4）电泳检测PCR产物。4结果41目的基因PCR扩增PCR流程94,3MIN94,50S50,50S72,70S72,10MIN8HOLD以A1A2、A1B2、B1A2、B1B2为四对引物进行PCR扩增，每对引物作两个平行两个对照。经过在
32、1琼脂糖凝胶上进行电泳、EB染色和漂洗后，能够在紫外灯下清晰地看到1428KB的条带，结果见图2。图2假微型海链藻DGAT全长基因的PCR扩增MMAKER2000分子量标准，1A1A2,2A1A2，3空白对照,4空白对照，5A1B2，6A1B2，7空白对照，8空白对照，9B1A2，10B1A2，11空白对照，12空白对照，13B1B2，14B1B2，15空白对照,16空白对照从PCR结果图可见扩增得到的条带为非单条带，因此需要对PCR反应液进行割胶回纯，34CYCLE12提取纯度高的目的DNA。42电泳检测割胶回收图图3假微型海链藻DGAT全长基因的PCR产物割胶回收MMAKER2000分子量
33、标准，1A1A2,2A1A2，3A1B2，4A1B2，5B1A2，6B1A2，7B1B2，8B1B2由图可见2号3号8号产物回收效果不理想，因此选择1号4号6号和7号回收产物去做连接。43PCR检测重组质粒图4重组质粒检测MMAKER2000分子量标准，1重组质粒的PCR产物由结果图可见该质粒初步能定为重组质粒，可送到测序公司检测目的序列。44测序结果重组质粒的DGAT序列ATGCATCGTCAATCCAACCCATCGTACTTGTCGGATGGATCACATGTTCAGAACTACAGAGGACTGTTCAATCTACTTCTACTCATCTTGGTGCTATCAAACTTTCGTCTGT
34、TGTTGGATACAGTGGCACAGCATGGATTCATACTCGACAAACTCGCAACGCTTCAAGGCTTCTCTCAAGCGCCACTAGACTTTCCATTTGTCTCGGGCTTGTTGATCGTGCAAGCCTTTGTGGTAGGAGCGTATGCAATTGAAAAGATGTTGAGTGTGGGATTGATTGGCAATCAGTTTGGAATGCTTCTACATGTCATCAATTCCAACGCAACTCTTGGCGTTGTCGTGGCTATAGTATGGTACTTGATTGATCAACCCTTTGTTGGAGCTGGATTGATCATGCAAGCAACAATTACAT
35、GGCTGAAGCTCATATCCTATGCTCATGCAAATTACGACTATCGTACGTCTCCCGATACCCAAAAGGTGACGGTGGCTTTGGTCAAGGATTTAGATGATGGACAGAACGTATCCTATCCTCAGAATGTCACGTTGAAAGACATTTACTATTTTTGGCTTGCACCAACGTTGACATATCAG13ATTGCTTTCCCGAGGAGTCCATTCATACGATGGCCAAAAGTGTTCTCCCTCACACTGCAGCTGTTTATATCAGTAACACTTGCGGTGTTTTTATGTGCTCAAGTTGTCGCCCCAAACTT
36、GGATAGCTTAGTGAAGAACTTGGAGGCGAACAAAGGTGAAGTCAGGACACAACAGATATTCGACTATCTGCTCAAGCTATCCATTACGTCGACATACATTTGGCTTCTGGGCTTTTACGGTTTTTTCCACTGCTTTATGAACCTGGCGGCTGAGTTACTAAGGTTTGGCGATAGAGTCTTTTATCGTGACTGGTGGAATGCTTCGGAGGTGTCGGCGTACTGGAGGCTCTGGAACATGCCTGTGCATTATTGGCTAGTGAGACATGTCTACTTTCCATGCATCAGAGTCGGTATGTCAAA
37、GAAGGGAGCCACGTTCGTTGTATTTTTTTTCTCGGCGGTATTGCACGAAGTGTTGATCAGCGTTCCATGTCATATGATAAGAGCTTGGTCGTTTCTAGCAATGATGGGACAGATACCCCTCATTATATTGACAAAAATAATAGACAAACGTGTGCCTGGAAGCTCCATCGGAAACATCATCTTCTGGATATCATTCTGCTTGGTCGGCCAGCCGATGGCAATGCTTCTGTATACGATCGACTACTGGGAGGTTCATTTTAATGCTGCAATTACGGAGTCTACGATAGAAGTTCCTCGAAA
38、GAGTTTCCGGTTTGATAAGATCGGGCGATTCTTTGGTGCCCATTCCGAGTTATAA5小结本实验利用PCAMBIA1300人工改造质粒和已获得的假微型海链藻DGAT基因片段，采用INFUSIONPCRCLONINGKIT试剂盒成功构建PCAMBIA1300DGAT重组质粒。研究发现受酶切位点限制的目的片段如果大于2000BP则可延长连接反应的时间，但最长时间不超过1小时，且连接产物需用TEBUFFER稀释50倍后才能进而做转化实验。继而进一步研究该重组质粒在拟南芥中表达后其三酰甘油含量的变化及该基因在拟南芥中的表达位置。本试验构建的质粒将为今后利用遗传操作技术提高油料
39、能源植物的种子含油量提供基础。14参考文献1BROWNC,KNIGHTSBAHYDROCARBONCONTENTANDITSRELATIONSHIPTOPHYSIOLOGICALSTATEINTHEGREENALGABOTRYOCOCCUSBRAUNIIJPHYTOCHEMISTRY,1969,835435472LARGEAUC,CASADEVALLE,BERKALIFFCSITESOFACCUMULATIONANDCOMPOSITIONOFHYDROCARBONSINBOTRYOCOCCUSBRAUNIIJPHYTOCHEMISTRY,1980,196104310513缪小玲,吴庆余微藻油脂
40、制备生物柴油的研究J太阳能学报,2007,2822192224张薇,吴虹,宗敏华蛋白核小球藻发酵产油脂的研究J微生物学通报,20086,358558605杨艳,卢滇楠,李春等面向21世纪的生物能源J化工进展,2002,2152993026LASSNERMW,LARDIZABALK,METZJGAJOJOBABETAKETOACYLCOASYNTHASECDNACOMPLEMENTSTHECANOLAFATTYACIDELONGATIONMUTATIONINTRANSGENICPLANTSJPLANTCELL,1996,832812927SAHAS,ENUGUTTIB,RAJAKUMARIS,E
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42、GANACYLCOADIACYLGLYCEROLACY1TRANSFERASE,AKEYENZYMEINTRIACYLGLYCEROLSYNTHESISJPROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES，1998，9522130181302310XIAOHUAHE,CHARLOTTATURNER,GRACEQCHEN,ETALCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFACDNAENCODINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEFROMCASTORBEANJLIPIDS,2004,39331131811ROUTABOUIJM
43、,BENNINGC,BECHTOLDN,ETALTHETAG1LOCUSOFARABIDOPSISENCODESFORADIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEJPLANTPHYSIOLOGYANDBIOCHEMICAL,1999,371183184012ZOUJ,WEIYD,JAKOC,ETALTHEARABIDOPSISTHALIANATAG1MUTANTHASAMUTATIONINADIACYLGLYCEROLACYITRANSFERASEGENEJPLANTJOURNAL,1999,19664565313LUNGSC,WESELAKERJDIACYLGLYCEROLA
44、CYLTRANSFERASEAKEYMEDIATOROFPLANTTRIACYLGLYCEROLSYNTHESISJLIPIDS,2006,41121073108814MARTINW,KATHARINAH,TIBORC,ETALIDENTIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFANACYLCOADIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASE2DGAT2GENEFROMTHEMICROALGAOTAURIJPLANTPHYSIOLOGYANDBIOCHEMISTRY,2010,48440741615TURKISHAR,HENNEBERRYAL,CROMLEYD,E
45、TALIDENTIFICATIONOFTWONOVELHUMANACYLCOAWAXALCOHOL15ACYLTRANSFERASESMEMBERSOFTHEDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASE2DGAT2GENESUPERFAMILYJTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,2005,28015147551476416WINTERA,VANEM,BININDAEMONDSOR,ETALGENOMICORGANIZATIONOFTHEDGAT2/MOGATGENEFAMILYINCATTLEBOSTAURUSANDOTHERMAMMALSJCYTO
46、GENETGENOMERESEARCH,2003,1024424717STONESJ,LEVINMC,FARESERVMEMBRANETOPOLOGYANDIDENTIFICATIONOFKEYFUNCTIONALAMINOACIDRESIDUESOFMURINEACYLCOADIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASE2JTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY,2006,28152402734028218WINTERA,KRAMERW,WERNERFA,ETALASSOCIATIONOFALYSINE232/ALANINEPOLYMORPHISMINAB
47、OVINEGENEENCODINGACYLCOADIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEDGAT1WITHVARIATIONATAQUANTITATIVETRAITLOCUSFORMILKFATCONTENTJPROCEEDINGSOFTHENATIONALACADEMYOFSCIENCES,2002,99149300930519WOMACKJE,JOHNSONJS,OWENSEK,ETALAWHOLEGENOMERADIATIONHYBRIDPANELFORBOVINEGENOMEMAPPINGJMAMMALIANGENOME,1997,8485485620BANDMR,L
48、ARSONJH,REBEIZM,ETALANORDEREDCOMPARATIVEMAPOFTHECATTLEANDHUMANGENOMESJGENOMERESEARCH,2000,1051359136821PEREZENCISOM,CLOPA,NOGUERAJL,ETALAQTLONPIGCHROMOSOME4AFFECTSFATTYACIDMETABOLISMEVIDENCEFROMANIBERIANBYLANDRACEINTERCROSSJJOURNALANIMSCIENCE,2000,78102525253122DEKONINGDJ,JANSSLL,RATTINKAP,ETALDETEC
49、TIONOFQUANTITATIVETRAITLOCIFORBACKFATTHICKNESSANDINTRAMUSCULARFATCONTENTINPIGSSUSSCROFAJGENETICS,1999,15241679169023PASZEKAA,WILKIEPJ,FLICKINGERGH,ETALINTERVALMAPPINGOFGROWTHINDIVERGENTSWINECROSSJMAMMGENOME,1999,10211712224KATAVICV,REEDDW,TAYLORDC,ETALALTERATIONOFSEEDFATTYACIDCOMPOSITIONBYANETHYLMETHANESULFONATEINDUCEDMUTATIONINARABIDOMISTHALIANAAFFECTINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEACTIVITYJPLANTPHYSIOLOGY,1995,1081399409
