1、本科毕业设计（20_届）坛紫菜MNSOD的克隆与分析所在学院专业班级海洋生物资源与环境学生姓名学号指导教师职称完成日期年月2目录前言1材料与方法111实验材料1111实验样品1112菌体和载体1113试剂、试剂盒和常规分子生物学实验方法2114实验仪器212实验方法2121紫菜基因组及总RNA的提取2122DNASE处理总RNA2123第一链CDNA的合成2124MNSOD基因CDNA及基因组部分序列的克隆31241使用RTPCR克隆MNSOD基因CDNA部分序列31242MNSOD基因组部分序列的克隆4125采用RACE技术获得MNSOD基因的CDNA全序列41251MNSOD基因3端CDN
2、A序列的获得41252MNSOD基因5端CDNA序列的获得5126采用GENOMEWALKING技术获得MNSOD基因全序列61261染色体步移原理61262染色体步移技术操作步骤6127MNSOD基因开发阅读框（ORF）的扩增及内含子验证9128实验结果分析92结果与分析921坛紫菜基因及总RNA的提取922MNSODCDNA核心片段的获得与分析1023MNSODCDNA全长的获得及分析10231MNSOD基因3端和5端的克隆10232MNSOD基因编码区（ORF）的克隆11233MNSOD基因CDNA序列分析1124MNSOD基因组全长的获得及分析13241MNSOD染色体步移结果1324
3、2MNSOD的基因组结构14243MNSOD蛋白质性质分析15244MNSOD二级结构分析17245MNSOD三维结构预测17246MNSOD蛋白的分子进化分析18247MNSOD蛋白相关物种同源性及系统进化分析183讨论1931紫菜基因组和总RNA的提取1932基因核心片段及全长的获得1933MNSOD基因序列分析204小结与展望20摘要抗氧化酶类在植物抗逆防御中具有重要作用，为研究紫菜抗逆的分子机制，用PCR的方法，从坛紫菜（PORPHYRAHAITANENSIS）CDNA中成功扩增出锰超氧化物歧化酶（MNSOD）基因CDNA及基因组DNA全长序列，并进行测序分析。该CDNA序列全长935
4、BP,包括起始密码子和终止密码子。氨基酸编码区起始于本序列的118BP，终止于792BP，共编码234个氨基酸。其基因组序列全长1637BP，含有4个外显子和3个内含子，预测其编码蛋白的相对分子质量为244524DA,等电点为563。与GENBANK中其他物种的MNSOD进行同源性比较,发现其核苷酸序列相似性高达98,氨基酸序列相似性达93。从系统发育树可以看出，坛紫菜与条斑紫菜的亲缘关系最近，其次与莱茵衣藻，雨生红球藻的亲缘关系较近，与高等动植物以及真菌类的亲缘关系较远。关键词坛紫菜；锰超氧化物岐化酶；克隆；序列分析ABSTRACTINORDERTOUNDERSTANDTHEMECHANIS
5、MSOFANTISTRESSOFPORPHYRAHAITANENSIS,CDNAANDITSGENOMICSEQUENCEOFMANGANESESUPEROXIDEDISMUTASEMNSODWASCLONEDFROMTHECDNAOFPORPHYRAHAITANENSISBYTHETECHNIQUEOFPOLYMERASECHAINREACTIONPCRTHERESULTOFSEQUENCINGSHOWSTHATTHEFULLLENGTHCDNAOFMNSODCONSISTSOF935BP,INCLUDINGTHEINITIATIONCODONANDTERMINATIONCODONAMINO
6、ACIDCODINGREGIONOFTHESEQUENCESTARTSAT118BP,ENDSAT792BP,REPRESENTSAPROTEINOF234AMINOACIDSTHEFULLGENOMESEQUENCECONSISTSOF1637BP,CONTAININGFOUREXONSANDTHREEINTRONS,PREDICTINGTHEMOLECULARMASSOFPROTEINSENCODEDIS244524DA,ANDITSISOELECTRICPOINTIS563COMPARINGWITHTHEMNSODOFOTHERSPECIESINGENBANKFORTHEHOMOLOGY
7、,ITSHOWSTHATITSNUCLEOTIDESEQUENCESIMILARITYWASFOUNDUPTO98ANDTHEAMINOACIDSEQUENCESIMILARITYOF93PHYLOGENETICANALYSISINDICATEDTHECLOSESTRELATIONSHIPOFMNSODAMONGTHEPORPHYRAHAITANENSISANDTHEPORPHYRAYEZOENSIS,FOLLOWEDWITHCHLAMYDOMONASREINHARDTIIANDHAEMATOCOCCUSPLUVIALISANDTHERELATIONSHIPOFHIGHERPLANTSANDA
8、NIMALSISDISTANTLYASWELLASTHEFUNGIKEYWORDSPORPHYRAHAITANENSIS；MNSUPEROXIDEDISMUTASE（MNSOD）；CLONING；SEQUENCEANALYSIS1前言紫菜是目前世界上人工养殖经济价值最高的海藻之一，全世界年总产值接近20亿美元，约占人工养殖海藻的2/3，我国的紫菜产量位居世界首位1。坛紫菜PORPHYRAHAITANENSIS属于红藻门红毛菜科紫菜属，为我国特有的暖温带性海藻，是我国两个主要紫菜栽培品种之一。坛紫菜原产于福建，在闽、浙、粤沿海地区被广泛栽培，其产量约占全国紫菜总产量的751。超氧化物歧化酶SUP
9、EROXIDEDISMUTASE,SOD是一种广泛存在于生物体内的重要的氧自由基清除剂,与铜CU、锌ZN、铁FE、锰MN等微量元素TACEELEMENTS代谢有密切关系。在逆境条件下植物的抗性强弱与植物体内能否维持较高的SOD活性水平有关2。SOD的作用底物是生物体内产生的超氧阴离子自由基O2,作用机理是SODO2SODO2氧化型还原型SODO2SODH2O2还原型氧化型总反应2O22HSOD酶O2H2O2之后H2O2被抗坏血酸和过氧化氮酶前者是主要的分解为H2O和O2，从而解除O2所造成的氧化胁迫。SOD能够平衡机体的氧自由基,从而避免当机体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，在防辐
10、射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面具有独特的功能,因而受到国内外学者和研究者的广泛关注311。目前，对SOD的研究已涉及到化学、生物学、医学、食品科学和畜牧兽医学等多个学科3,4,5。根据其活性中心结合的微量元素的不同，SOD主要分为3种类型CU/ZNSOD、FESOD和MNSOD。CU/ZNSOD相对分子量约为32000，蓝绿色，主要存在于真核细胞的胞液和叶绿体中。FESOD和MNSOD很相似12,但是它们对H2O2的敏感性不同，也存在明显的差异氨基酸13,14。FESOD相对分子量是38700左右，为黄褐色，多见于原核细胞及少数植物细胞中。紫红色的MNSOD相对分子量在4
11、0000左右，在原核生物细胞及线粒体中也比较常见。植物线粒体是活性氧（REACTIVEOXYGENSPECIES,ROS）产量仅次于叶绿体的细胞器，位于其中的MNSOD在清除ROS中的作用尤为重要。本文从坛紫菜的叶状体CDNA中，经PCR扩增得到了MNSOD基因CDNA及基因组DNA全长序列，将它们与GENBANK中其他物种的MNSOD进行了同源性比较与分析,结果表明其同源性非常高。1材料与方法11实验材料111实验样品本实验选用的坛紫菜丝状体纯系由宁波大学海洋重点实验室大型海藻种质库提供，系宁波象山鹤浦栽培品种，于2007年4月采集。清洗晾干后，于20冰箱保存。实验前在消毒海水中复苏培养24
12、小时。培养光照条件为140UMOLM2S1，光照周期为LD1212,培养温度201培养用的海水是经脱脂棉过滤后，煮沸消毒的加富营养海水（100G/LKNO3、10G/LKH2PO4、25G/LFESO4、025G/LMNSO4和20G/LEDTANA2）。112菌体和载体大肠杆菌DH5菌种（本实验室70保存）；克隆载体PMD18TTAKARA公司产品。2113试剂、试剂盒和常规分子生物学实验方法大肠杆菌LB培养基和分子生物学常用的各种溶液的配制参见分子克隆实验指南（第三版）。DNA提取试剂盒、总RNA提取试剂盒（AXYGEN公司）、DNAGELEXTRACTIONKIT（GENERAY公司）、
13、TAQDNA聚合酶、DNTPS、5RACE试剂盒、基因组布移试剂盒（TAKARA公司）、MMLV反转录酶（PROMEGA公司）、DEPC处理水（上海生物工程有限公司）、电泳用琼脂糖（上海捷瑞公司），其他试剂均为进口或国产分析纯产品；引物合成及核酸序列的测定均由上海英骏公司完成。114实验仪器PCR扩增仪（ABI9600）；东胜龙BCD196型PCR仪（东胜创新科技有限公司）；TANONGIS2008凝胶图像分析仪（上海天能科技有限公司）；H5中号水平电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；DK8D型电热恒温水槽上海医用恒温设备厂；干热式恒温培养箱YDHPKR宁波医疗器械二厂；电脑压力蒸汽灭菌器（
14、PRESSURESTERILIZER）（沈阳盛达生物电子设备有限公司）；METTLERAE240型电子分析天平（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）；BIOFUGEFRESCO高速台式冷冻离心机（SORVALL公司）；吉尔森可调精密移液器PEPETMANGILSON公司；70超低温冰柜（SANYO）。12试验方法本研究的实验方法中的主要参考了DONGYULSUNG对HSC701过表达的研究15和YOUNGSUNCHO在磨齿兽HEMIBARBUSMYLODON（真骨鱼类，鲤形目）的MNSOD的MRNA表达和基因组结构的研究16的方法。121紫菜基因组及总RNA的提取采用AXYGEN公司生产的MUL
15、TISOURCEDNA提取试剂盒提取坛紫菜丝状体DNA,MULTISOURCEDNA提取试剂盒提取恢复培养36小时的坛紫菜叶状体总RNA，分别采用用琼脂糖电泳和紫外分光光度计检测其浓度和纯度。所用器皿均按RNA提取的常规方法处理。122DNASE处理总RNA去除总RNA中的基因组DNA的污染。（1）在反应管中配制下列液体TOTALRNAUPTO8GDNASEIBUFFER（10）1LDNASEI1/L1L补足DEPCH2O,使总反应体积为10L。（2）温室下反应15MIN；（3）在反应器中加入1L25MLMEDTA，置于65水浴10MIN终止反应，反应所得的样品可以直接用于RTPCR。123第
16、一链CDNA的合成3使用PROMEGA公司生产的MMLV反转录酶，按使用说明书操作，反转录第一链的合成，具体步骤为在DNASEFREE的PCR管中，加入约为1G总RNA、50MOLRADOMPRIMERPD（N）65D（NNNNNN350M1L，加DEPC补至10L，混合离心，65反应5MIN，迅速冰浴3MIN。再依次加入5FIRSTSTRANDBUFFER4L、01MOL/LDTT1L、10MMOL/LDNTP混合物1L、40U/LRNASEINHIBITOR05L，200U/L反转录酶05L，加DEPC水至20L，30反应10MIN；42反应60MIN；70，15MIN灭活后，作为下一步P
17、CR的模板。124MNSOD基因CDNA及基因组部分序列的克隆用DNAMAN软件对已公布的MNSOD氨基酸序列进行比较，分析其保守序列，结合条斑紫菜和莱茵衣藻的核苷酸保守序列，设计了MNSOD上下游各两条特异性筛选引物（表1）表1锰超氧化物岐化酶筛选引物TABLE1SELECTEDPRIMERSFORPCRANDRTPCRPRIMERSLENGTH/BPSDSEUQUENCE53MNSODGSP120FTGCCACCCACTCGCACCTCTMNSODGSP221FACGACGATGAACATCCACCACMNSODGSP317RTCCCTCCACAAGACACCMNSODGSP420RGGC
18、GGTTCTGGTACTTGAGGGSPGENESPECIFICPRIMERSDSYNTHESISDIRECTIONFFORWARDPRIMERSRREVERSEPRIMERS1241使用RTPCR克隆MNSOD基因CDNA部分序列以坛紫菜总RNA的反转录产物为模板进行PCR扩增。表2PCR反应体系TABLE2THECOMPONENTSOFPCRREACTION反应液成分用量（L）10BUFFER5MGCL225MMOL/L3CDNA50NG/L1DNTP10MMOL/L1GSP1或GSP210MOL/L1GSP3或GSP410MOL/L1TAQDNA聚合酶（5/L05PCR专用水375总反应
19、体积50MNSOD基因PCR扩增程序为94预变性5MIN；494变性45SEC，57复性45SEC，72延伸45SEC，共进行35个循环；72延伸10MIN。PCR反应结束后，12的琼脂糖凝胶电泳检测产物，切胶回收DNA。回收的PCR产物与PMD18T载体连接，转化DH5感受态细胞，PCR鉴定筛选阳性克隆，利用M13通用引物对插入片段进行双向测序，测序由上海英俊公司完成。将DNA序列及其对应的氨基酸序列与GENBANK中已有的相应序列进行比较分析，同时用DNAMAN软件对结果进行比较分析。1242MNSOD基因组部分序列的克隆除反应模块为坛紫菜基因组DNA之外，PCR反应体系、扩增程序及回收、
20、连接、转化和测序步骤同1241一致。125采用RACE技术获得MNSOD基因的CDNA全序列根据已获得的MNSOD基因的CDNA部分序列，用PRIMER50软件分别设计3RACE和5RACE基因特异性引物（GSP）。（表3，表4）表33RACE引物TABLE3PRIMERFOR3RACEPRIMERSLENGTH/BPS/DSEQUENCE（53）MNSOD3GSP20FGGCCACTGGAACCACTCCTTADAPTERPRIMER20RGGCCACGCGTCGACTAGTAC3GSPGENESPECIFICPRIMERFOR3RACESDSYNTHESISDIRECTIONFFORWAR
21、DPRIMERRREVERSEPRIMERSINVITROGEN3RACESYSTEMFORRAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS表45RACE引物TABLE4PRIMERFOR5RACEPRIMERSLENGTH/BPS/DSEQUENCE（53）MNSOD5NGSP124RGCCGTGTTAAACTTCTTCTGCATCMNSOD5NGSP225RGACTCTAATGCTCGACTTGAGGTCAC5SHORT（OUTERPRIMER）23FCATGGCTACATGCTGACAGCCTA5LONG（INNERPRIMER）34FCGCGGATCCACAGCCTACTGAT
22、GATCCAGTCGATG5NGSPNESTEDGENESPECIFICPRIMERFOR5RACESDSYNTHESISDITECTIONFFORWARDPRIMERSRREVERSEPRIMERS1251MNSOD基因3端CDNA序列的获得使用PROMEGA公司生产的MMLV反转录酶，按使用说明书操作，反转录成3RACECDNA文库，具体步骤为在RNASFREE的PCR管中，加入约1G总RNA、50MOLOLIGODT17接头（ANNEALOLIGO）1L；65反应5MIN，迅速冰浴2MIN；稍事离心，将反应物收集到管底；依次在管中加入5FIRSTSTRANDBUFFER4L、01MOL/
23、LDTT1L、10MMOL/LDNTP混合物1L、40U/LRNASEINHIBITOR05L、200U/L反转录酶05L，加DEPC水至20L；5充分混匀，轻微离心将反应体系全部甩到管底；42反应60MIN；7015MIN终止反应，作为下一步PCR的模板。以上述反转录合成的CDNA文库为模板，利用通用接头引物ADAPTERPRIMER与MNSOD3GSP进行3RACE的PCR扩增。PCR扩增程序为94预变性3MIN；94变性45SEC，57复性45SEC，72延伸45SEC，共进行35个循环；72延伸10MIN。PCR反应体系、扩增程序及回收、连接、转化和测序步骤同1241一致。1252MN
24、SOD基因5端CDNA序列的获得本实验采用TAKARA公司的5FULLRACE试剂盒进行MNSODCDNA5端的克隆。本试剂盒应用了“去帽法”原理，TOBACCOACIDPYROPHOSPHATASETAP可以去掉MRNA的5帽子结构，使用T4RNALIGASE将5RACEADAPTOR连接到MRNA的5端后，使用5RACEADAPTOR上的引物与已知序列部分的引物进行两轮套式RTPCR反应，高特异性地扩增CDNA5末端的全长序列（见图1）。图15FULLRACE的扩增原理图（引自TAKARA公司5FULLRACE试剂盒说明书）FIG1THEPROTOCOLOF5FULLRACE取适量的总RN
25、A，按照试剂盒说明书的要求进行5RACE文库的构建，并用其所提供的接头引物和特异性引物，进行两轮巢式PCR扩增CDNA5末端。取处理后的带接头CDNA2L作为模板，利用试剂盒提供的通用接头外侧引物（OUTERPRIMEROFNUP）和巢式特异性引物NGSP1进行第一轮PCR扩增，反应条件为94预变性5MIN；694变性30S，57复性30S，72延伸1MIN，共进行33个循环；最后于72延伸10MIN；按1241的方法将巢式得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收、连接、转化和测序。126采用GENOMEWALKING技术获得MNSOD基因全序列1261染色体步移原理染色体步移技术（GENOMEWA
26、LKING）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。本实验采用TAKARA公司的基因组步移试剂盒进行MNSOD基因DNA未知序列的步移。其主要原理是根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SPPRIMER）（见图2），与试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物，即AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应。通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获得已知序列的侧翼序列（图3）。1262染色体步移技术操作步骤基因组DNA的获取
27、本实验技术利用热不对称PCR进行目的基因步移，基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。使用经过充分纯化的完整的基因组DNA（见图4）。此外，本方法灵敏度极高，模板DNA不能污染，所需的DNA量应要少于3G。已知序列的验证。在进行PCR实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为根据已知序列设计特异性引物，对模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。特异性引物的设计。根据验证的已知序列，按照试剂盒说明书中的特异性引物设计原则，分别设计三条上游特异性引物和三条下游特异性引物（表5）。1STPCR反应。基因组DNA经OD
28、测定准确定量后，取适量作为模板，以APPRIMER（四种中的任意一种）和特异性步移引物GSP1进行1STPCR反应。按下列组份配制1STPCR反应液（表6）。图2GENOMEWALKINGKIT特异性引物设计示意图（引自TAKARA公司GENOMEWALKING试剂盒说明书）FIG2THEPROTOCOLOFGENOMEWALKINGKITSPECIFICPRIMER7表5步移引物TABLE5PRIMERSFORGENOMEWALKINGPRIMERSLENGTH/BPS/DSEQUENCE（53）MNSODUGSP124RACGTTCGTCACATACGTGTTGTGGMNSODUGSP22
29、6RGAGTACACAACGAGCAACGCAATAGCMNSODUGSP326RGCTGACACAACCTTCCTATCGGAAACMNSODDGSP125FACCACTCCTTCTTCTGGAGCGTCATMNSODDGSP224FACGTTTGGCTCCTTCGACGAGATGMNSODDGSP324FTCCCATTTTGGGCCTGGATGTGTGUGSPUPSTREAMGENESPECIFICPRIMERDGSPDOWNSTREAMGENESPECIFICPRIMERSDSYNTHESISDIRECTIONFFORWARDPRIMERSRREVERSEPRIMERS表6染色体步移PC
30、R反应体系TABLE6THECOMPONENTSOFPCRREACTIONFORGENOMEWALKING图3GENOMEWALKING试剂盒工作原理示意图（引自TAKARA公司GENOMEWALKING试剂盒说明书）FIG3THEPROTOCOLOFGENOMEWALKINGKIT8基因组DNA（50NG/L）15LDNTPMIXTURE（10MMEACH）8L10LAPCRBUFFERII（MG2PLUS）5LLATAQ（5U/L）05LAPPRIMER1LGSP11LRNASEFREEDH2O195L总反应体系50L1STPCR反应条件为941MIN981MIN9430S631MIN5C
31、YCLES722MIN9430S；253MIN；722MIN9430S；631MIN；722MIN9430S；631MIN；722MIN15CYCLES9430S；441MIN；722MIN7210MIN2NDPCR反应。取1L1NDPCR反应液作为2NDPCR反应的模板，以APPRIMER（四种中的任意一种）和GSP2为引物进行2STPCR反应。除模板和引物外，反应体系和1STPCR反应液一致。2NDPCR反应条件为9430S；641MIN；722MIN9430S；641MIN；722MIN15CYCLES9430S；441MIN；722MIN7210MIN3NDPCR反应。取1L2NDPC
32、R反应液作为3NDPCR反应的模板，以APPRIMER（四种中的任意一种）和GSP3为引物进行3STPCR反应。除模板和引物外，反应体系和1STPCR反应液一致。3NDPCR反应条件为9430S；651MIN；722MIN9430S；651MIN；722MIN15CYCLES9430S；441MIN；722MIN7210MIN取1ST，2ND，3RDPCR反应液各5L，使用12的琼脂糖凝胶进行电泳。按1241的方法将巢式得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收、连接、转化和测序。9127MNSOD基因开放阅读框（ORF）的扩增及内含子验证在对MNSOD基因3RACE和5RACE的测序结果进行比对、拼
33、接之后，寻找最大的开放阅读框（OPENREADINGFRAME，ORF），并将ORF转换成氨基酸序列，用BLASTX程序将编辑后的序列在NCBI数据库中进行氨基酸序列同源性比较，推测ORF的正确性，在此基础上设计扩增MNSOD基因ORF及基因组全长的引物（表7）。表7开放阅读框及基因组全长扩增引物TABLE7AMPLIFICATIONPRIMERSFORORFANDFULLGENEPRIMERSLENGTH/BPSDSEQUENCE（53）MNSODORF120FATGGCGTTTGCTCTGCCCCCMNSODORF222RTTACGCCAGCGGCGTGTCAAACSDSYNTHESISD
34、IRECTIONFFORWARDPRIMERSRREVERSEPRIMERS分别以总坛紫菜总RNA的反转录产物和基因组DNA为模板。反应体系参照本章1241基因保守片段克隆的方法进行，PCR扩增程序如下94预变性3MIN；94变性30SEC，63复性30SEC，72延伸以CDNA做模板为30SEC，以基因组DNA做模板为1MIN，共进行35个循环；72延伸10MIN。按1241的方法将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收、连接、转化和测序。128实验结果分析利用DNASTAR50软件包的EDITSEQ程序结合开放阅读框ORF寻找程序（HTTP/WWWBIOINFORMATICSORG/SMS2/
35、CODON_USAGEHTML）分析克隆基因的序列，寻找最大的开放阅读框（OPENREADINGFRAME，ORF），并将ORF转换成氨基酸序列。用BLASTX程序将编辑后的序列在NCBI数据库中进行氨基酸序列同源性比较HTTP/WWWNCBINH1GOVBLAST，以推测ORF的正确性。用CLUSTALX18进行多序列联配。用在线软件HTTP/WWWFRUITFLYORG/SEQ_TOOLS/PROMOTERHTML预测启动子序列转录起始位点，HTTP/WWWDNAAFFRCGOJP/PLACE/SIGNALSCANHTML预测启动子顺式作用元件用；EXPASYPROTEOMICS、SWIS
36、SMODEL等软件分析蛋白质结构，用DNAMAN、MEGA40软件等对所推测的氨基酸序列特征及系统进化树进行分析。2结果与分析21坛紫菜基因组及总RNA的提取为保证核酸质量，本实验采用AXYGEN公司生产的MULTISOURCE基因组DNA和RNA提取试剂盒进行核酸提取，DNA及总RNA完整性较好（见图4，图5），避免了传统方法纯度不够，多糖干扰等缺点。适用于常规PCR，RTPCR，染色体步移，CDNA文库构建等要求。1M1022MNSODCDNA核心片段的获得与分析以坛紫菜CDNA为模板，以GSP筛选引物进行PCR扩增，结果显示MNSOD引物GSP2和GSP4效果最好，得到了500BP左右的
37、特异性清晰条带（图6）。对RTPCR片段测序后可知，MNSOD的CDNA确切长度为499BP，与预期片段大小完全一致，经对比发现与条斑紫菜（PORPHYRAYEZOENSIS）MRNA（登录号DQ1464771）的同源性高达94，与莱茵衣藻（CHLAMYDOMONASREINHARDTII）（登录号U245001）MRNA的同源性为72，与雨生红球藻藻（HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS）（登录号AY8785381）MRNA的同源性为72，初步推断为坛紫菜MNSOD基因CDNA片段。图6MNSODCDNA特异性清晰条带FIG6THESPECIFICBANDOFMNSODCDNAMAR
38、K都为DL2000，大小自上而下分别为2K，1K，750BP，500BP，250BP和100BP23MNSODCDNA全长的获得及分析231MNSOD基因3端和5端的克隆MNSOD3RACE约600BP左右的片段（图7）。对该片段测序后可知，其确切长度为581BP，终止子密码是TAA，3端是38BP长的POLY（A），5RACE获得约500BP片段（图7），对该片段测序后可知，其确切长度为483BP。DNA2000BP图4坛紫菜丝状体基因组DNA电泳图谱FIG4THEELECTROPHORESISOFGENOMEDNAINFILAMENTOFPHAITANENSIS图5坛紫菜叶状体总RNA电泳
39、图谱FIG5THEELECTROPHORESISOFTOTALRNAINTHALLUSOFPHAITANENSIS11232MNSOD基因编码区（ORF）的克隆以CDNA为模板，以MNSOD基因ORF特异扩增引物（ORF1和ORF2）进行PCR反应，扩增出一条约670BP左右的片段特异条带（图8）。与推测的序列的MNSOD基因编码区（ORF）大小相符，测序结果表明该片段同原始拼接序列的同源性为100，确为MNSOD基因编码区（ORF）序列，长度为675BP。图8MNSOD基因编码区片段特异条带FIG8THESPECIFICBANDOFMNSODCDNA233MNSOD基因CDNA序列分析利用D
40、NAMAN软件将5RACE与3RACE序列拼接后，重叠95BP，得到一个全长为935BP的CDNA序列，其中间部分与CDNA核心片段完全重叠，说明已经获得完整的CDNA全长序列（图9）。坛紫菜MNSOD基因CDNA全长935BP，氨基酸编码区起始于本序列的118BP，终止于792BP；包含1个长675BP的可阅读框（ORF），编码234个氨基酸，含一个终止密码子TAA，5端非编码区的长度为117BP，3端非编码区的长度为143BP；末端可见典型的PLOYA结构。MNSOD基因编码区密码子1、2、3位的GC含量分别为533、445和889，平均为622。从中可以看出编码同一个氨基酸的同义密码子的
41、第三位碱基偏好使用G或C。这与坛紫菜孢子体EST（密码子1、2、3位的GC含量分别为585、420和731）以及条斑紫菜孢子体EST的GC含量分析图7MNSOD基因3RACE和5RACE电泳FIG7AGAROSEELECTROPHORESISOF3RACEAND5RACEOFMNSODGENEMDL2000MARKER；13RACE产物；25RACE产物675BP12结果（密码子1、2、3位的GC含量分别为580、420和720）具有类似的分布趋势17,18。图9坛紫菜MNSOD基因CDNA全长序列FIG9THEFULLLENGTHOFCDNAOFMNSODGENE天然蛋白质的20种氨基酸共有
42、61个密码子，每种氨基酸可由1个至6个密码子（最多的有6个）编码,编码同一氨基酸的密码子称为同义密码子（SYNONYMOUSCODONS）。在蛋白质编码过程中，某一物种或某一基因通常倾向于使用一种或几种特定的同义密码子，这种现象称为氨基酸密码子偏好性CODON13PREFERENCE17。利用MEGA软件，我们分析了MNSOD氨基酸的密码子使用情况（表8）。表8坛紫菜MNSOD基因密码子使用分析TABLE8CODONUSAGEOFMNSODGENEOFPORPHYRAHAITANENSIS24MNSOD基因组全长的获得及分析241MNSOD染色体步移结果MNSOD基因通过三轮巢式热不对称PCR
43、扩增，获得上下游目的片段。上游和下游均获得约800BP的条带（图10）。经回收、克隆测序后，切除载体片段，利用DNAMAN60软件拼接，上游步移序列与基因核心片段重叠了179BP，下游步移序列与基因核心片段重叠了230BP，获得了大小为1637BP的基因组片段（图11）。MNSOD基因上游步移结果MNSOD基因下游步移结果图10MNSOD基因上下游步移结果FIG10THEWALKINGRESULTSOFMNSODGENE14图11坛紫菜MNSOD基因组序列FIG11THESEQUENCEOFMNSODGENE242MNSOD的基因组结构利用软件VECTORNTI将该基因的基因组DNA序列（GD
44、NA）与CDNA序列进行序列比对之后可以发现GDNA中的4段离散序列与CDNA序列完全匹配，由此可以证明坛紫菜MNSOD的基因组序列含有4个外显子15（EXON）和3个内含子（INTRON）组成。在3个内含子的5和3端均分别发现了典型的真核生物内含子剪切位点保守序列“GT/AG”，说明在坛紫菜初级转录后，内含子剪切均符合“GTAG”规则。原核藻类MNSOD基因是连续的，没有内含子；真核生物中该基因的外显子和内含子的数量存在差异，例如人类有5个外显子和4个内含子，高等植物大多数为6个外显子和5个内含子。本研究发现坛紫菜只有4个外显子和3个内含子（图12）。从蛋白序列长度上看，各种植物MNSOD氨
45、基酸的数目大多在220240AA之间，因此该基因外显子长度变化不大；但因内含子的大小差异很大，由于在进化上的机动性问题，内含子的长度没有外显子的长度那么稳定，不同的基因之间变化很大。在不同植物中，MNSOD的基因组序列长度变化很大，如条斑紫菜只有1416个核苷酸，而豌豆则长达4292个核苷酸（表9）。图12坛紫菜MNSOD基因组结构简图FIG12THESTRUCTUREOFMNSODGENE表9几种植物MNSOD基因的结构TABLE9THESTRUCTUREOFMNSODGENEOFSOMEPLANTS物种核苷酸序列长度（BP）外显子内含子外显子内含子外显子内含子外显子内含子外显子内含子外显子
46、11223344556坛紫菜6929915271450171141条斑紫菜6929915268450174141豌豆322658478411113448132681138893萝卜295213471001257857130789093橡胶树2949734779125124584297890199红千叶286773471051251435692578724107243MNSOD蛋白质性质分析推导的坛紫菜MNSOD氨基酸全长224AA，预测该多肽的分子量为244524DA，推测该多肽的分子式为C1107H1667N287O331S5，理论等电点（PI）为563。理论推导半衰期大于10H，不稳定参数
47、为2998，属于不稳定蛋白（图13）。MNSOD首先由核基因编码合成后，在定位于线粒体，与细胞质型SOD的显著区别之一是它含有转运肽，而后者没有，这些转运肽富含碱性氨基酸，羟基氨基酸和疏水性氨基酸，缺乏酸性氨基酸20。推测坛紫菜MNSODN端的24个疏水氨基酸比例很高的残基为转运肽，作用是将该蛋白转运并定位于线粒体19。氨基酸序列中第27、84、178位的组氨酸（H）及第174位的天冬氨酸（D）是与MN2的结合位点（图13加A氨基酸）。和其它物种一样，在该氨基酸序列中也发现了MNSOD中高度保守的金属结合结构域“DVWEHAYY”（图13阴影氨基酸）。16结合其它物种MNSOD的氨基酸结构，推
48、测该多肽有六个跨膜螺旋区，分别为110，3870，90103，130146，164177，196219。结合其它物种的MNSOD蛋白结构，推测该多肽的功能位点（表10）。图13坛紫菜MNSOD氨基酸序列FIG13THEAMINOSEQUENCEOFPORPHYRAHAITANENSISMNSOD下划线RACE引物序列；加A氨基酸与MN2结合的保守位点；阴影结合金属的保守结构域图14坛紫菜MNSOD蛋白二级结构预测图FIG14NUCLEOTIDESEQUENCEANDAMINOSEQUENCEDEDUCEDFROMPORPHYRAHAITANENSISMNSODALPHAHELIX（H）螺旋；E
49、XTENDEDSTRAND（E）延伸直带；RANDOMCOIL（C）自由卷曲17表10MNSOD多肽功能位点TABLE10THEFUNCTIONALSITEMNSODPEPTIDE名称区域序列2个N糖基化位点8386NHSF207210NYTA1个蛋白激酶C磷酸化位点6971SIK4个酪蛋白激酶II磷酸化位点6568SLPD9699SIAE107110SSIE115118SFDE5个N豆蔻酸位点4954GALKGL5358GLSLSA7984GGHWNH132137GSGWAW214219GGLPAF1个锰和铁离子结合位点174181DVWEHAYY244MNSOD二级结构分析推测的坛紫菜MNSOD二级结构中螺旋所占比例较大（4018），与大
