1、本科毕业设计（20_届）戊糖乳杆菌产双乙酰的条件优化所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录1引言142方法材料1521实验菌株1522培养基1523实验试剂及仪器15231试剂15232仪器1624测定原理及方法16241双乙酰测定原理16242双乙酰的测定方法1625实验方法16251菌种活化17252产双乙酰发酵条件的优化17253产双乙酰营养成分的优化17254正交实验183结果与分析1831产双乙酰发酵条件18311接种量18312PH值19313培养时间1932产双乙酰培养基营养成分20321葡萄糖20322柠檬酸铵20323小牛浸膏21324正交试
2、验214结论225展望23致谢错误未定义书签。参考文献232附录错误未定义书签。摘要乳酸菌发酵产生芳香性代谢产物双乙酰，影响发酵乳风味。本实验采用邻苯二铵比色法测定发酵乳中双乙酰的含量，通过发酵条件和培养基营养成分对戊糖乳杆菌产双乙酰的条件进行优化。得到戊糖乳杆菌发酵产双乙酰的最佳发酵条件是接种量3，温度37，培养时间24H。培养基葡萄糖7，柠檬酸铵08，小牛浸膏3。双乙酰产量59872G/ML。满足食品行业对天然双乙酰风味物质的需求，为食品工业中生产风味酸奶以及乳制品的进一步研究提供有力的理论依据。关键词戊糖乳杆菌；双乙酰；发酵条件；营养成分ABSTRACTLACTICACIDBACTERI
3、AFERMENTSTOPRODUCEAROMATICDIACETYLITINFLUENCETHEFLAVOROFFERMENTEDMILKTHEPRESENTSTUDYDETERMINEDTHEDIACETYLCONTENTOFFERMENTEDMILKBYOPHENYLENEDIAMINECOLORIMETRICOPTIMIZATIONTHEFERMENTATIONCONDITIONSANDTHENUTRITIONOFMEDIUMOBTAINEDTHEBESTFERMENTATIONCONDITIONISINOCULUM3,TEMPERATURE37,INCUBATIONTIME24HMED
4、IUMGLUCOSE7,AMMONIUMCITRATE08,CALFEXTRACT3DIACETYLPRODUCTION59872G/MLMEETTHEDEMANDOFFOODINDUSTRYNATURALFORDIACETYLFLAVORITPROVIDESSTRONGTHEORETICALBASISFORTHEFOODINDUSTRYINTHEPRODUCTIONOFYOGURTANDDAIRYPRODUCTSINFURTHERRESEARCHKEYWORDSLACTOBACILLUSPENTOSUSDIACETYLFERMENTATIONCONDITIONSNUTRITION141引言食
5、品的风味FLAVOR主要包括气味ODOR，即嗅觉感官特性，是挥发性气体作用嗅觉细胞所产生的感觉；滋味TASTE，即味觉感官特性，是水溶性物质作用味觉细胞的结果；有的文献也会使用香气AROMA一词，它是指使人产生愉快感觉的气味1。风味物质虽然在食品中含量很少，但却决定着食品的品质和风味，是食品的重要感官指标，风味物质大都具有挥发性,部分成分受热分解，或在酶的作用下分解。因此，在原料加工中，一些天然的风味物质会随加热、破碎、杀菌等工艺而损失，使原料原有的香味变淡甚至消失，进而影响产品品质2。为了解决风味和芳香物质的损失问题，通常采用的方法是添加风味物质以保证产品的品质。乳酸菌（LACITICACI
6、DBACTERIA）是一类革兰氏阳性杆菌或球菌、不形成芽抱、不运动、过氧化氢酶阴性、对葡萄糖发酵能产生50以上乳酸的细菌的总称3。乳酸菌能赋予食品柔和的酸味和香气，改进食品的品质和营养，还具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态环境、抗肿瘤、抗变异原和增强免疫力等重要生物学功能，在食品工业中被广泛地运用3。随着人们生活水平的提高，人们对发酵乳风味的要求越来越高，发酵乳的风味已成为消费者在选择发酵乳时除了保健功能以外的另外一个重要因素4,5。双乙酰是发酵乳风味物质的主体成分之一。双乙酰，又名丁二酮，化学名2，3丁二酮2,3BUTANEDIONE又称双乙酸DIACETYL，简称DC，是一种黄色至浅绿色，具
7、有强烈奶油香味的重要香料6。同时也是奶油、干酪、奶酪以及许多需要奶味的非乳制品中的一种重要风味物质，在食品工业中，双乙酰主要应用于软饮料、冷饮、焙烤食品、糖果、发酵乳等的增香剂，同时双乙酰也广泛应用于配制奶油香精、草莓香精、乳猪饲料香精、合成脂肪增香剂以及作明胶硬化剂和照相的粘结剂，但我国此类相关研究开展的较少7,8。因此通过在含乳酸菌制品中分离相对高产双乙酰的乳酸菌以及通过发酵条件的优化系统研究如何提高乳酸菌代谢双乙酰的能力有重要意义9。虽然双乙酰的合成方法很多，但是我国仅有少数的厂家生产双乙酰10。由于受生产工艺限制，产量小、质量差、收率低且生产成本较高，产品质量也很难达到替代进口产品的要
8、求11。工业中双乙酰的检测方法很多，如邻苯二铵比色法、气相色谱法、荧光分析法、极谱法、肌酸比色法等各种方法都有其侧重面及其局限性邻苯二铵比色法由于其操作简单、实用、实验仪器简单等特点而得到普遍应用12,13,14。双乙酰测定过程中，样品的处理是必要的过程。以往双乙酰的测定过程中，将样品用蒸馏水稀释后倒入蒸馏瓶中，采用蒸馏的方法，再利用乙醚等有机溶剂冰浴回收，然后萃取得到双乙酰待测样品15。这种方法耗时长，样品中的双乙酰在回收时有一定的损失。应用16的TCA将样品中的蛋白沉淀，然后离心机离心后得透溶液,然后进行测定。这种方法需要时间少,也减少了样品中双乙酰的损失,确保了测定的准确性16。众所周知
9、，我国生产的酸奶制品的菌种主要是由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌种发酵而成，其特征风味是以乙醛为主的醛香型酸奶17。目前欧美已经出现单独或者结合使用乳酸菌复配作发酵剂，生产主要风味为双乙酰的酮香型酸奶。酸奶对人体有益，具有丰富的营养价值和良好的保健功能，其产销量呈迅猛增长之势18。用乳酸菌发酵生产双乙酰在我国尚未见到报道，因此研究乳酸菌的发酵生产双乙酰可以解决化学合成生产双乙酰带来的环境污染问题等一系列的问题，满足食品行业对天然双乙酰等风味物质的需求，满足消费者对天然绿色食品的要求，对食品工业具有重要意义，为我国乳制品的进一步研究提供理论依据，推动我国乳制品的发展19。戊糖乳杆菌是本实验室在
10、发酵乳中分离提取的一种高产双乙酰的菌种，因此选择戊糖乳杆菌作为本实验研究的菌种。本文对戊糖乳杆菌在发酵产生双乙酰的过程中接种量、发酵温度、PH、发酵时间、柠檬酸铵及糖类等添加量的影响进行研究，同时对发酵条件及主要影响因素进行优化，得到戊糖乳杆菌的最佳发酵条件及各15影响物质的最佳添加量。2方法材料21实验菌株戊糖乳杆菌，本实验室分离和保藏。22培养基脱脂乳培养基含有12的脱脂奶粉MRSMANROGOSASHARPEBROTH液体培养基，其制备参照文献20。表1MRS培养基的配制方法TAB1THEPREPARATIONMETHODSOFLIQUIDMRSMEDIUMMRS液体培养基的配方牛肉膏1
11、00G蛋白胨100G酵母粉50G蒲萄萄200G乙酸钠50G柠檬酸氢二胺20G吐温8010ML磷酸氢二钾20G七水硫酸镁02G七水硫酸锰005G蒸馏水1000ML121灭菌15MIN23实验试剂及仪器231试剂脱脂奶粉黑龙江省完达山乳业股份有限公司蛋白胨生化试剂上海东海制药厂麦芽糖生化试剂上海丽珠东风生物技术有限公司吐温80CR中国医药（集团）上海化学试剂公司蛋白胨生化试剂中国医药（集团）上海化学试剂公司牛肉浸膏生化试剂中国医药（集团）上海化学试剂公司磷酸二氢钾天津市博迪化工有限公司葡萄糖天津市博迪化工有限公司邻苯二胺天津市博迪化工有限公司盐酸CR中国医药（集团）上海化学试剂公司三氯乙酸天津市博
12、迪化工有限公司小牛浸膏生化试剂中国医药（集团）上海化学试剂公司16232仪器LDAX40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂YP202N型电子天平ACCULAB公司PHS25型数显PH计上海精密科学仪器有限公司CENTRIFUGE5810R型高速冷冻离心机上海美迪西生物医药有限公司紫外分光光度计北京普析通用仪器有限责任公双层落地恒温振荡器太仓光明实验分析仪器24测定原理及方法241双乙酰测定原理据现有的条件选择邻苯二胺比色法测定发酵乳中的双乙酰含量。原理是邻苯二胺和双乙酰反应生成2，3二甲基并吡嗪，利用生成物的盐酸盐在335NM下有最大吸收值，可对双乙酰进行定量测定。242双乙酰
13、的测定方法2421建立双乙酰标准曲线12的脱脂乳115OC灭菌10分钟，将其配制成双乙酰含量分别为0、2106、5106、10106、15106、20106、25106、30106、35106G/ML、40106/ML、45106ML的标准液，加等体积16的TCA混匀，3500转10分钟离心，取上清液20ML加入到2支1号和2号试管中10ML/管，向1号管中加入05ML1的邻苯二铵，2号管中不加,摇匀后置于暗处放置30分钟，然后加入4N的HCL溶液1号管20ML，2号管25ML终止反应,混匀后以不加邻苯二铵的2号管作为参比液，在335NM波长下用石英比色杯测定OD值。每样至少做两个平行取平行值
14、，然后以双乙酰浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，见图1图1双乙酰标准曲线FIGURE1STANDARDCURVEOFDIACETYL2422样品中双乙酰含量的测定取待测样品,用上述方法测出吸光值,查双乙酰标准曲线可获得待测样品中双乙酰浓度。25实验方法17251菌种活化无菌条件下将实验室保藏的菌种少许接入灭菌的MRS培养基中，37条件下培养24H，即菌液浑浊后连续培养3代，再可进行接种。252产双乙酰发酵条件的优化2521接种量接种量大，菌体增殖速度快，发酵周期短，产量大，但产酸量大，使生长过早进入衰亡期造成菌体自溶；接种量小，延滞期长，菌体增殖速度缓慢，发酵周期较长，产量降低。因此接
15、种量是影响发酵产双乙酰的重要因素21,22。在150ML三角瓶中倒入100ML脱脂乳液体培养基，杀菌冷却后分别按1、2、3、4、5的接种量接入菌种，于37条件下在摇床中培养24H，取样分别采用邻苯二胺比色法测定吸光值，查标准曲线测量双乙酰产量。2522PH值每种微生物都有自己的PH值适宜范围。而微生物细胞对PH值的改变是很敏感的，环境中的氢离子浓度如果超过了微生物的适应范围，就会降低或抑制这些微生物的生命活动23。因此，是否具有合适的PH对其发酵产双乙酰的产量影响很大。用氢氧化钠和盐酸调节培养基的初始PH值在75、70、65、60四个点上。在150ML三角瓶中分别装入100MLPH调至以上4个
16、值的脱脂乳培养基以及作为空白对照的脱脂乳培养基，接种后37条件下在摇床中培养24H，取样分别采用邻苯二胺比色法测定吸光值，查标准曲线测量双乙酰产量。2523培养时间发酵时间是影响乳酸菌发酵产香的重要因素之一，想要确定其他因素对乳酸菌芳香性代谢产物的影响，首相要确定最佳发酵时间24。菌种活化扩培后，按照最佳接种量接种于脱脂乳培养基中，每隔4H取样采用邻苯二胺测定OD值，查标线测定双乙酰含量，确定最佳产量的培养时间。253产双乙酰营养成分的优化2531葡萄糖碳源是微生物生长所必需的营养物质，每种微生物生长代谢所需的碳源也各不相同25，通过实验发现戊糖乳杆菌发酵产双乙酰过程中葡萄糖对其影响较大。在1
17、50ML三角瓶中分别装入100ML的脱脂乳培养基，活化后的菌株以3接种量接种于分别补充了1、3、5、7、9、11、13葡萄糖的脱脂乳培养基中,固定除葡萄糖以外的其它因素，培养温度37，摇床中培养24H，取样分别采用邻苯二胺比色法测定吸光值，查标准曲线测量双乙酰产量。2532柠檬酸铵氮源是微生物生长所必需的营养物质，每种微生物生长代谢所需的氮源也各不相同，通过实验发现戊糖乳杆菌发酵产双乙酰过程中柠檬酸铵对其影响较大。在150ML三角瓶中分别装入100ML的脱脂乳培养基，活化后的菌株以3接种量接种于分别补充了04、08、12、16、20、24柠檬酸铵的脱脂乳培养基中,固定除柠檬酸铵以外的其它因素，
18、培养温度37，摇床中培养24H，取样分别采用邻苯二胺比色法测定吸光值，查标准曲线测量双乙酰产量。2533小牛浸膏在150ML三角瓶中分别装入100ML的脱脂乳培养基，活化后的菌株以3接种量接种于分别补充了1、182、3、4、5、6、7小牛浸膏的脱脂乳培养基中,固定除小牛浸膏以外的其它因素，培养温度37，摇床中培养24H，取样分别采用邻苯二胺比色法测定吸光值，查标准曲线测量双乙酰产量。254正交实验通过上面单因素试验确定影响乳酸菌培养最显著的因素，采用三因素三水平正交试验法确定培养基中各显著影响成分的最佳添加量。其装液量100ML150ML三角瓶，接种量30，培养温度37，接种后在摇床中培养24
19、H，取样用邻苯二胺法测定吸光值，查标准曲线确定双乙酰产量。正交试验26,27因子及水平如下表2所示表2正交试验因素水平TAB2FACTORSANDLEVELSOFORTHOGONALTEST水平A葡萄糖（）B柠檬酸铵（C小牛浸膏（）17042290833111243结果与分析31产双乙酰发酵条件311接种量将乳酸菌接种量作为一个因素，其他因素均相同，研究其对乳酸菌产双乙酰产量的影响。结果如下图2图2乳酸菌接种量对双乙酰产量的影响趋势FIGURE2DIACETYLOFLACTICACIDBACTERIAINOCULUMYIELDTRENDS由图2可知，在一定范围内，双乙酰含量随着接种量的增加而增
20、大，接种量为3时乳酸菌的双乙酰产量达到最大，之后又有所下降。由以上结果可知，不同接种量对最终乳酸菌发酵产双乙酰有一定影响，接种量大，菌体增殖速度快，发酵周期短，从而增加产量，但是由于菌体增殖快，产酸量大，使生长过早19进入衰亡期造成菌体自溶；若接种量小，延滞期长，菌体增殖速度缓慢慢，发酵周期较长28。从多方面考虑，最终确定3为较合适的接种量。312PH值在乳酸菌生长的最适PH值范围内，细菌不仅生长繁殖快，而且活力强29。乳酸菌在生长过程中，细胞对氢离子有一个自我调节机制，能把代谢中产生的氢离子不断排出胞外，以保证胞内一个相对优良的生长环境，这也是为什么乳酸菌相对更耐酸的部分原因。但当胞外氢离子
21、浓度达到一定程度后，胞内氢离子往外排放也会受阻，积累过多就会对细胞造成损伤29,3031。所以在发酵的过程中，有必要通过控制胞外氢离子浓度，缓解乳酸菌细胞内部调节PH的压力，达到增殖菌体数量和减少活性损失的目的。为了得到最佳发酵的条件，在配制脱脂乳培养基时分别把初始PH值调至75、70、65、60，接入相同条件的菌种，24H后测双乙酰含量，结果如图3所示。图3PH值对双乙酰产量的影响趋势FIGURE3PHVALUEOFTHEYIELDTRENDOFDIACETYL由图3看出，不同PH，对乳酸菌发酵产双乙酰影响差异度非常小，因此，在发酵培养时，可不调PH，自然条件下培养发酵即可。313培养时间发
22、酵时间是影响乳酸菌发酵产香的重要因素之一,想要确定其他因素对乳酸菌芳香性代谢产物的影响，首先要确定最佳发酵时间。在前面优化的培养条件的基础上，为了进一步确定发酵产双乙酰的最佳条件，在相同培养条件下，不同时间进行双乙酰含量测定，结果如图4所示20图4培养时间对双乙酰产量的影响趋势FIGURE4INCUBATIONTIMEONTHEYIELDOFDIACETYLTREND由图4可知，双乙酰产量随发酵时间的延长而增大,在24H左右双乙酰产量达到最大值。24小时后随时间的延长双乙酰产量开始下降，但变化比较缓慢。因此，取24H为发酵产双乙酰的最佳发酵时间。32产双乙酰培养基营养成分321葡萄糖加糖量的多
23、少会影响到整个发酵环境的糖度、渗透压等因素。葡萄糖也是乳酸菌发酵所需的重要碳源之一32。培养基中葡萄糖含量对乳酸菌发酵产双乙酰的影响如图5所示，由图可知，随着脱脂乳培养基中葡萄糖含量的增加双乙酰产量先升高后降低，当培养基中葡萄糖添加量为7时双乙酰产量达到最大。图5葡萄糖添加量对双乙酰产量的影响趋势FIGURE5GLUCOSEADDITIONONYIELDTRENDSOFDIACETYL322柠檬酸铵发酵乳制品中添加柠檬酸对提高乳制品风味有一定的促进作用，众所周知，随着季节地区的不同乳中21柠檬酸的含量变化也很大，因此为了平衡乳中柠檬酸的含量，提高产品风味水平，可在原料乳中添加适量的柠檬酸33,
24、34。在研究添加柠檬酸胺对双乙酰的影响是，我们发现,戊糖乳杆菌在添加08的柠檬酸胺时双乙酰产量最大。结果如图6所示图6柠檬酸铵添加量对双乙酰产量的影响趋势FIGURE6CITRATECONTENTONTHEYIELDOFDIACETYLTREND323小牛浸膏培养基中小牛浸膏含量对双乙酰产量的影响如图6所示。随着小牛浸膏含量的升高双乙酰产量先升高后降低，由图可知，培养基中小牛浸膏含量3时乳酸菌发酵产双乙酰产量最大。图6小牛浸湿添加量对双乙酰产量的影响趋势FIGURE6CONTENTONTHEWETCALFDIACETYLYIELDTRENDS324正交试验从单因素的分析中，可以判断得出葡萄糖，
25、柠檬酸铵，小牛浸膏这三个因素对于乳酸菌生长发酵产双乙酰的影响最大，因此将这三个因素作为正交试验的三个水平，进一步优化确定乳酸菌发酵产双乙酰的最22佳的条件。结果如下表所示表3正交试验结果及分析TABLE3RESULTSANDANALYSISOFORTHOGONALTEST试验号ABC双乙酰产量111152032212259872313348549421243139522345273623140664731330486832136098933243395K1534844188642931K2430254708148802K3366604420341436极差R1682451957366表4正交试
26、验方差分析TABLE4ANALYSISOFVARIANCEOFORTHOGONALTEST变异来源DFSSMSFF005F001A24329820006252301514109B240645000710216C290959000180483总和856459通过方差分析（表4），可以看出，在显著性水平001和005上，葡萄糖对试验结果有显著影响，柠檬酸铵和小牛浸膏则无显著影响。由上表可确定优化方案为ACD，即葡萄糖为最主要因素，其次为小牛浸膏。本正交试验中柠檬酸铵影响最小，分析原因可能是所选的三个水平的柠檬酸铵浓度差异较小且比较适宜。根据双乙酰产量的极差分析可知，优化方案是A1C2B2，即葡萄糖
27、7，小牛浸膏3，柠檬酸铵08。4结论运用邻苯二铵法测量发酵乳中双乙酰含量，首先确定出菌种最佳接种量为3，菌种发酵的最佳外部条件37OC，恒温培养24小时。通过单因素实验得出戊糖乳杆菌发酵产双乙酰的各种影响因素中葡萄糖，柠檬酸胺，小牛浸膏含量影响比较显著，其中葡萄糖影响最大，小牛浸膏次之。在此基础上设计正交试验，通过正交优化后，双乙酰产量得到很大提高，得出戊糖乳杆菌发酵产双乙酰过程中脱脂乳培养基中葡萄糖的最佳添加量为7，柠檬酸铵的最佳添加量为08，小牛浸膏的最佳添加量为3。发酵产双乙酰过程23中各个影响因素的确定以及正交试验的优化为乳酸菌发酵生产风味酸奶提供了重要的理论基础。5展望目前，大部分（
28、约80）的食品香料和风味物质是通过化学合成法得到的35。化学合成法生产的食品香精和食品风味物质，虽然价格低，种类多，但需要高温高压及强酸反应条件，且副作用多，产物分离困难，且得到的产物多为混合物，其成分用量受到卫生标准的严格控制。与此同时，随着人们对天然产物兴趣的增加，消费者对化学合成产物的警惕性日益增加，尤其是添加到食品中的化学合成物，受到多数消费者的抵制。因此，通过微生物代谢产食品风味物质的研究近几年发展很快，是研究人员研究的重点方向。目前欧美已经出现单独或结合使用乳酸菌复制配作发酵剂，生产主要风味物质为双乙酰的酮香型酸奶，我国生产的酸奶制品的菌种主要是由保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌种
29、发酵而成，其特征风味是以乙醛为主的醛香型酸奶，因此对乳酸菌发酵产双乙酰的研究是我国发酵乳制品领域未来研究的重要方向，必然会成为研究人员及消费者关注的焦点。参考文献1袁静,李元瑞等乳酸菌的细菌素及乳链菌肽在食品工业中的发酵与应用J哈尔滨商业大学学报自然科学版,2002,1855445502汤务霞乳酸菌及其应用J四川食品与发酵,2001,37435373吴宪忠,赵辉等乳酸菌在酸奶中的应用及研究进展J中国酿造,2007,151124OTTA,HUGIA,BAUMGARTNERMETALSENSOYINVESTIGATIONOFYOGHURTFLAVOURPERCEPTIONMUTUALINFLUEN
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