1、毕业论文文献综述生物技术藻类耐高温胁迫分子机理的研究进展摘要藻类生活的特殊的水体环境使其有着独特的抗逆机制。近年来由于环境恶化而导致的全球海洋温度升高已经严重威胁着藻类养殖业的健康发展。本文从活性氧胁迫及抗氧化系统、信号转导系统和热激蛋白三个方面对藻类耐高温胁迫的分子机理做了综述，并介绍了相关方面的最新研究成果，以期为今后关于这方面的研究提供参考。关键词藻类；高温胁迫；活性氧（ROS）；分子机理以紫菜、海带为代表的大型经济海藻不但维持着海洋生态系统的平衡，而且是重要的食品、药物、工业化工原料的来源，藻类栽培业作为我国水产养殖业的支柱之一，近年来由于环境恶化而导致的全球海洋温度升高已对其健康发展
2、造成了严重威胁。究其本质，是由于高温胁迫引发了藻类一系列生理生化变化，最后导致整个植株质变，并走向死亡。深入了解藻类的耐高温机理对全面藻类健康养殖并进行抗逆品种培育有着重要意义。在植物中的大量研究表明，活性氧胁迫及抗氧化系统、信号转导系统、热激蛋白等在植物高温胁迫应答过程中起重要作用，藻类中也有相关研究报道，杨锐等（2007）研究了坛紫菜的耐高温机理，推测其对热胁迫应答的可能模式为热胁迫活性氧ROS上升细胞感受到过量的ROS信号，并传递、转导渗透压调节系统和自由基清除非酶促保护系统迅速反应，并伴随HSP70等功能基因的表达。1活性氧胁迫及抗氧化系统有氧代谢是大多数植物生存所必须的，植物将氧气还
3、原成水，为植物的生长和发育提供能量。但还原过程不完全时，就会产生一类化学性质活泼，氧化能力极强的含氧物质H2O2、单线态氧和羟自由基等，即通常说的活性氧（REACTIVEOXYGENSPECIES，ROS）。ROS是所有需氧生物代谢过程中不可避免的产物。在正常生长条件下，植物细胞内活性氧自由基的产生与清除处于动态平衡状态。当外界条件如温度、盐度等急剧变化时，这种平衡就会被破坏，致使活性氧自由基大量积累，进一步形成氧化损伤，随着胁迫时间的延长，有可能导致植株死亡。从本质上讲，活性氧代谢的失调是植物逆境伤害的共同机理之一（MAHALINGAMANDFEDOROFF,2003）。在长期的进化过程中，
4、植物自身形成了一整套完备的ROS防护机制，从而免于被ROS伤害，这就是植物抗氧化系统，包括酶促和非酶促两类。在植物的抗逆研究中，越来越多的学者将目光转移到抗氧化系统的研究。11酶促抗氧化系统植物体内酶促抗氧化系统包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、还原型抗坏血酸过氧化物酶（ASP）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽还原酶（GR）等。SOD在ROS的清除系统中发挥着特别重要的作用，是植物体内清除ROS系统的第一道防线，在保护系统中处于核心的地位（马旭俊，朱大海，2003）。其主要功能是清除O2，催化反应为2O22HH2O2O2。CAT和POD清除生物体
5、内的H2O2，其催化反应为2H2O22H2OO2。GPX构成了利用谷胱甘肽来减少H2O2、脂质氢过氧化物和其他氢过氧化物的另一个酶家族。抗坏血酸过氧化物酶（APX），脱氢抗坏血酸还原酶（DEHYDROASCORBATEREDUCETASE，MDAR），单脱氢抗坏血酸还原酶（MONODEHYDROASCORBATEREDUCTASE，MDAR）和谷胱甘肽还原酶（GLUTATHIONEREDUCTASE，GR），以及2种小分子量的物质（ASA和谷胱甘肽）共同组成叶绿体中的抗坏血酸（ASA）/谷胱甘肽循环，是清除活性氧的主要系统。此外，还有硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶系统。12非酶促抗氧化系统非酶促
6、抗氧化系统主要是指植物体内所含的抗氧化物质。目前，发现植物体内抗氧化物质主要包括抗坏血酸（ASA），生育酚（VE）、维生素C、甘露醇、还原性谷胱甘肽（GSH）、类胡萝卜素等。这些物质既可直接同ROS反应，将其还原，又可作为酶的底物在ROS的清除中发挥重要作用（杜秀敏等，2001）。抗坏血酸和谷胱甘肽参与了植物细胞中抗氧化剂的再生过程。还原型谷胱甘肽作为还原剂参与抗坏血酸的再生，产生的氧化型谷胱甘肽可以通过谷胱甘肽还原酶得到还原。抗坏血酸则在生育酚和玉米黄质的再生循环中充当还原剂。维生素C能有效地清除O2H和H2O2，提高SOD和POD活性，类胡萝卜素是植物体内最重要的O2猝灭剂，从而保护细胞膜
7、系统，特别是叶绿体光合膜系统。13藻类抗氧化系统研究进展由于目前的研究多集中在高等植物上，对海藻的研究则相对较少，但是，藻类的活性氧清除机理和高等植物极其相似，因此，高等植物的抗氧化研究同样适用于藻类。谢荣等（2001）检测了ROS对3种海洋微藻生长的影响，发现低浓度的ROS可以提高藻细胞的SOD活性，说明其可能试图通过增加SOD等抗氧化系统成分来削弱ROS的影响。王悠等（2005）比较了两个海带品系耐高温海带901和热敏感海带荣成1号的抗氧化系统与耐热性的关系，发现901（耐高温海带）的抗氧化系统能对高温胁迫做出积极响应，从而提高其耐热性。王荣等（2006）克隆了条斑紫菜MNSOD的CDNA
8、和基因序列，经系统进化分析发现其与莱茵衣藻和海链藻的亲缘关系较近，并推测其可能在紫菜抗逆过程中起重要作用。郝林华等（2009）研究发现，南极冰藻CHLOROPHYCEAEL4在环境温度高于最适生长温度时各种与代谢相关的抗氧化酶系统的活性大幅度提高，显示出较高的抗高温胁迫能力。2信号转导系统与高温胁迫21ROS信号转导ROS除了导致细胞的伤害以外，还可以在植物细胞中作为一种普遍存在的信号分子起作用。ROS信号传递是通过其产生和清除实现的。诱导产生ROS的酶定位于细胞的不同区室，而酶的激活由刺激物的特点及感知路线决定。ROS爆发的最初部位、持续时间及强度差异会导致次级信号的化学性质、亚细胞定位、寿
9、命及强度的不同（MAHALINGAMANDFEDOROFF,2003）。质膜NADPH氧化酶NADPHOXIDASE被认为是是植物产生ROS的关键酶。ROS作为一种信号转导因子，启动了ROS清除系统以及抗胁迫基因系统的表达（XU等，2007）。研究表明，植物在热胁迫下，ROS作为信号分子能够诱导热激蛋白（HSP）的合成，但是ROS如何调控HSP的表达目前并不清楚（SACHIN等，2007）。ROS作为通用信号分子可能源于它们被用来感知胁迫。大部分生物及非生物胁迫扰乱了细胞中的代谢平衡，导致产生过量ROS。不同发育或是环境信号流入ROS信号转导网络并扰乱ROS的内稳态。ROS信号的改变被各种蛋白
10、质、酶或受体感知，进而调节相应的发育、代谢及防御途径。近年来，对拟南芥的研究揭示了ROS信号转导途径中的一些关键组分。虽然目前感知ROS的受体尚未发现，但人们推测植物细胞至少存在三种不同的机制感知并转导ROS信号（I）未被鉴定的受体蛋白；（II）对氧化还原反应敏感的转录因子，例如NPR1或者HSFS；（III）被ROS直接抑制的磷酸酶。（MITTLER等，2004；APELANDHIRT,2004）。药理学及遗传学研究表明，ROS信号转导中可能存在另一条由NADPH氧化酶介导的正放大回路（DAT等，2003）。这一回路可被低水平的ROS激活，导致细胞特定部位ROS信号的产生和放大；而细胞中RO
11、S过量积累又会激活ROS清除路径，从而降低细胞特定部位或整个细胞的ROS水平，这是一条反馈抑制回路。目前对ROS信号途径的了解还很有限，也是研究热点。22CA2信号转导CA2是植物细胞中的主要胞内信使，许多外界信号包括各种环境刺激、胞间化学信号、物理信号等经其受体进行跨膜信号转导，调节CA2的分布及其在特定部位的瞬间变化而产生钙离子信号，钙离子信号进而影响其靶蛋白活性，从而调控基因表达及生理反应（林忠平，2000）。TORRECILLA等（2000）检测了鱼腥藻ANABAENASPPCC7120细胞内的游离CA2浓度，发现热激20MIN细胞内的游离CA2浓度达到最大值，升高的CA2既来自于细胞
12、外又来自于细胞内。CAM是植物细胞中CA2最重要的受体蛋白，是CA2参与的信号转导途径中的重要成员。CAM结合CA2后分子构象发生改变，其疏水区呈激活态后能与多种靶蛋白结合，进而调节靶蛋白的活性。CAM在具有高度保守性，目前已鉴定的植物钙调素与藻类的相似性为84100（夏快飞，梁承邺，叶秀粦，2005）。23HSF信号转导热激转录因子HSF是细胞内的一种转录调节因子，在热激条件下可以激活热激基因的表达。HSF在本质上是具有转录调节活性的蛋白质，其在热应激反应中的主要功能，是在热激基因的表达过程中与相应启动子结合，启动基因的转录过程，最终促进热激蛋白HSP的表达。在热激基因的启动子中有一小段特异
13、的DNA识别序列，它是HSF的结合位点，被称为热激元件HSE，HSF被激活后与HSE结合会启动热激基因的表达。HSE是一种顺式元件，包括TATA盒近端HSE和TATA盒远端的HSE。实验表明，不同种类的HSF受到激活的信号不同，但其中的机制还有待研究。植物中存在多种HSF，在藻类中，发现绿藻OSTREOCOCCUSTAURI中有1种HSF，莱茵衣藻中有2种HSF，单细胞红藻CYANIDIOSCHYZONMEROLAE中有3种HSF，其中莱茵衣藻中的HSF1已被证实受高温诱导，通过RNAI抑制HSF1基因的藻株对热敏感，而且热激蛋白HSP70、HSP90、HSP100等的表达都受到抑制（SCHU
14、LZRAFFELT等，2007）。24MAPKS信号转导蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是包括植物在内的生物体中普遍存在的一种重要调节机制。几乎涉及所有的生理和病理过程，它在细胞信号传导中起重要作用。MAPKSMITOGENACTIVITEDPROTEINKINASES是一类存在于各种真核生物体中的丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶，它与MAPKKMITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEKINASE,MAPKK和MAPKKKMITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEKINASEKINASEMAPKKK组成MAPK级联信号通路，接受外界刺激信号，将信号转入细胞内，影响特定基因
15、的表达，从而影响植物的生长、发育、分化和凋亡等多方面生理过程。当生物体遭遇胁迫如高温、盐碱等时，MAPK会被上游信号分子激活，再通过对下游分子丝氨酸、苏氨酸残基部位的磷酸化作用，将外界信号传递给细胞核，调节特异基因的表达（KOVTUN等，2000）。JIMNEZ等（2004）从高温、高渗透压等胁迫条件下的杜氏藻DUNALIELLAVIRIDIS中分离到了一种大小为57103的蛋白，经验证为P38MAPK，而且当用P38MAPK抑制剂处理时，盐藻的抗胁迫能力会明显下降。3热激蛋白与高温胁迫热激蛋白HSPHEATSHOCKPROTEINS，最初被定义为是生物有机体受热胁迫下诱导合成的一类应激蛋白（
16、SACHIN等，2007）。当生物体受到高温胁迫时，会新合成或增强合成热激蛋白，参与生物体内新生肽的运输、折叠、组装、定位以及变性蛋白的复性和降解，缓解高温胁迫造成的伤害，产生抗热性。近年来的研究表明除高温外，其他环境胁迫（如低温、干旱、高渗透压及重金属等环境因素）也可以诱导HSP的产生。HSPS超家族包括在各种生物中大量不同分子量的HSPSHSP100CLP、HSP90、HSP70DNAK、HSP60GROEL，还有一组分子量在1600040000之间的小HSPS。另外，正常条件下生活的细胞中也有HSP，这类HSP是组成型表达的，称为HSCHEATSHOCKCOGNATEPROTEIN。FU
17、RUKI等（1996）在聚球藻SYNECHOCOCCUSVULCANUS中克隆到了HSP60（GROEL）基因，在热激条件下，该基因的转录数可增长几倍。BIERKENS等（1998）证明环境中不同的PH、温度、胡敏酸（HUMICACID）、硝酸盐、磷酸盐等都会诱导藻（RAPHIDOCELISSUBCAPITATA）HSP70的瞬时表达，其中温度、PH刺激可能会提高该藻的抗逆性。蓝藻中的DNAK蛋白与植物中的线粒体和质体的HSP70同源性较高，NIMURA等（2001）发现聚球藻SYNECHOCOCCUSSPPCC7942中的DNAK蛋白家族有三种蛋白DNAK1，DNAK2和DNAK3，其中DN
18、AK2对热胁迫反应敏感，而DNAK1和DNAK3在热胁迫下无转录增强的现象，推测DNAK2可能与热应激反应有关。IRELAND等（2004）发现高温42的胁迫下，2H时墨角藻（FUCUSSERRATUS）HSP70表达量最大，4H时浮萍（LEMNAMINOR）HSP70表达最丰富。姜国忠等（2005）从盐藻DUNALIELLASALINA胞质溶浆中克隆了HSP70的CDNA全长，发现光诱导和热休克都可以使HSP70基因表达明显上升，但以热休克最为显著。NITTA等（2005）发现聚球藻SYNECHOCOCCUSECT161中小热激蛋白HSPA在热激过程中对于维持细胞超显微结构有重要作用。4结语
19、藻类生活的特殊的水体环境使其必然具有一些不同于陆生植物的特殊功能蛋白、功能因子、信号传导和调控机制等，但是我们目前对此认识还远远不够，尤其对于藻类细胞如何感受胁迫、如何将胁迫信号传递到细胞中诱导相关转录因子的表达并调控下游功能基因的表达等一系列的分子机理都还知之甚少。深入研究藻类高温胁迫的应答机制，了解其耐高温机理，对于促进藻类的健康养殖和耐高温品种选育等都具有重要意义。另外，藻类抗逆性的应用研究也有待深入，应尽快研制适用于农业生产的高效自由基清除剂，以减轻活性氧在逆境胁迫中对藻类的伤害，从而提高海藻的抗逆性。随着分子生物学技术的不断发展，关于植物逆境胁迫下诱导表达的基因、信号的传导、基因表达
20、调控、逆境胁迫相关转录因子及抗逆胁迫的基因工程研究已经越来越深入，为了解植物对不同逆境响应的分子机理及研究人工调控生物技术等方面展示出良好的前景。参考文献1杜秀敏，殷文璇，赵彦修等植物中活性氧的产生及清除机制J生物工程学，2001，31211252郝林华，孙丕喜，王能飞等南极冰藻CHLOROPHYCEAEL4抗氧化酶活性对温度升高的响应J渔业科学进展，2009，30（3）971023姜国忠，许培荣，牛向丽等盐藻胞浆HSP70CDNA的克隆及其MRNA的诱导表达J海洋科学，2005，543494林忠平走向21世纪的植物分子生物学M北京科学出版社，20002662705马旭俊，朱大海植物超氧化物歧
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