1、 本科毕业论文 （ 20 届） 龙头鱼微卫星标记的开发及筛选 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 本科毕业论文 目录 目录 摘要 . 错误 !未定义书签。 Abstract . 错误 !未定义书签。 引言 .1 1.材料与方法 .2 1.1 材料 .2 1.1.1 仪器与设备 .2 1.1.2 药品与试剂 .2 1.2 实验方法 .2 1.2.1 龙头鱼基因组 DNA 的提取 .2 1.2.2 酶切 .3 1.2.3 接头的制备与连接 .3 1.2.4 龙头鱼基因组文库的建立 .3 1.2.5 探针杂交和磁珠富集 .4 1.2.6 富含微卫星序列的
2、PCR 产物及测序 .4 1.2.7 微卫星 PCR 引物和电泳 .5 1.2.8 聚丙烯酰胺凝胶银染 .5 2. 结果与分析 .7 2.1 DNA 提取结果 .7 2.2 酶切及适宜基因组片段的获得 .7 2.3 菌落 PCR 检测重组率 .8 2.4 测序结果及序列分析 .9 3.小结 . 11 3.1 磁珠富集法 . 11 3.2 测序结果及序列分析 . 11 3.3 讨论 .12 参考文献 .15 致谢 . 错误 !未定义书签。 本科毕业论文 中文摘要 I 摘要摘要 为了研究 龙头鱼（ Harpodon neherus） 的群体遗传结构，本实验采用富集文库法构建 龙头鱼 的 微卫星富集
3、 文库 。 将龙头鱼基因组 DNA用 Mse 限制性内切 酶精心酶切后， 回收 并 纯化 250bp-1000bp左右的片 段 ， 用生物素标记的简单重复序列作探针与其杂交 ， 杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上 ， 经一系列的洗涤过程 ，去除磁珠表面不含有微卫星的片段。将吸附在磁珠上的片段洗脱 ， PCR扩增放大 ， 再进行克隆和测序 ， 根据微卫星两端的保守序列设计引物 ， 即可得到微卫星分子标记。从菌落中筛选出的 90个 阳性克隆进行测序，其中有 62个具有微卫星序列，所占的比例为 68.9%。 根据自行分离得到的序列 共 设计引物 28对 ， 其中有 21对能成功扩增出条带， 对
4、舟山 海域 的龙头鱼 样本 进行群体遗传多样性研究，其中 5对引物扩增出条带清晰，多态性高的目的片段。 筛选出的微卫星标记可为今后研究龙头鱼的分子遗传育种提供有效的遗传标记 。 关键词 微卫星 ；龙头鱼；种群多样性；多态性；分子标记 。本科毕业论文 英文摘要 II Abstract Abstract Partial genomic library was constructed in order to study the genetic structure of Harpadon nehereus. In this experiment, we isolated microsatellite
5、DNA from Harpadon nehereus genome with this method. Harpadon nehereus genomic DNA was extracted and digested with restriction enzyme MseI. Fragments over 250bp were isolated and purified and then ligated with short linkers. This genomic DNA was hybridized with a biotin-labeled microsatellite probe (
6、CA) 15. The hybrid mixture was incubated with magnetic beads coated with streptavidin. After washing to remove the non-SRS fragments the eluted single-stranded DNA contains the selected microsatellite DNA. Ninety positive clones from the (CA)15 enriched genomic library were sequenced and 62 (68.9%)
7、sequences contained sufficient repeat motifs (di-, tri-and tetra-nucleotide). To study the Zhoushan population genetic diversity of Harpadon nehereus From the primers designed for the 28 microsatellite loci, and 21 were successfully amplified and 5 loci were polymorphic. The microsatellite loci of H
8、arpadon nehereus obtained from the present study are potential for further investigation of genetic diversity in Harpadon nehereus. Key words Microsatellite; Harpadon nehereus; Population diversity; Polymorph; Molecular markers 本科毕业论文 引言 1引言 龙头鱼（ Harpodon neherus） 属于脊索动物门 ,硬骨鱼纲 ,灯笼鱼目 ,狗母鱼科 ,龙头鱼属。分 布
9、于印度洋和太平洋、我国南海、东海和黄海南部均产之，尤以浙江的温、台和舟山近海以及福建沿海产量较多。属暖水性底层近岸鱼类，缓潮时常到上层。一般只在近海作短距离移动。属捕食性鱼类，生长甚快 。以 3 4 月和9 12 月渔获为大 1 。 微卫星 (microsatellite) 是近十几年来发展起来的一种分子标记技术，它是少数几个核苷酸 (1 6 个 ) 多次重复的简单序列，其中以双核苷酸的重复最为常见。微卫星具有多态性高， 提供的遗传信息多， PCR 扩增结果重复性好，以及在基因组中分散分布等优点， 常应用于物种遗传多样性、种 群的亲缘关系、遗传图谱的建立和基因定位、微卫星 DNA 指纹库的建立
10、等 2-7。由于微卫星研究所用 DNA 的数量极少，非损伤性取样或陈旧样品就能进行有效分析，检测种群的生存力，并且可以利用历史标本完成操作，因此，该法适用于濒危物种及进化的研究。 微卫星上不同长度的等位基因按简单的孟德尔方式遗传，由于微卫星具有高度的多态性，在基因组中含量丰富且分布均匀等优点 ，因此成为目前研究种群遗传多样性及遗传结构的最有力的分子标记之一。 本文研究的目的是 利用 富集法建立微卫星富集文库，进行测序分析、基因分型后筛选到一批具有高度多态 性的微卫星分子标记，可以用于后续的 检测龙头鱼个体基因型，统计群体中的微卫星位点等位基因的数目和频率，结合分子遗传学和数量分类学原理，计算遗
11、传变异程度、生存稳定性， 用于 评估龙头鱼的遗传多样性 8-10。 为 龙头鱼 分子遗传学研究奠定良好的基础。 本科毕业论文 材料与方法 2 1.材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器与设备 PCR 仪 (MyCycler 和 S1000)为 BIO-RAD 公司生产 ， DYY-10C 型电泳仪为北京六一仪器厂生产 ， 凝胶成像系统由 BIO-RAD 公司生产 ， YXQ-LS-50A 型压力蒸汽灭菌锅由上海云泰仪器仪表有限公 司生产 ， HHS 型电热恒温水浴锅由上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产 ， 微型离心机（ Qspin BAYGENE） ， 干燥箱（ PH070A型，上海 -恒
12、科学仪器有限公司） ， 超净工作台（ SB JC IA 型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂） ， 电子天平（ BS124S 型，塞多利斯科学仪器 (北京 )有限公司） ，超纯水器（ DPWS-T-20L/H 型，杭州永洁达净化科技有限公司） ， 锥形瓶（容量200mL， 250mL， 500mL 中国医药（集团）上海化学试剂公司） ， 烧杯（容量 50mL，100mL， 500mL， 1000mL，国药集团化学试 剂有限公司） ， 量筒（容量 50mL， 100mL，500mL 中国医药（集团）上海化学试剂公司） ， EP 管 ， 移液枪 Eppendorf Research可调量程移液 。
13、1.1.2 药品与试剂 苯酚 :氯仿 :异戊醇 (25:24:l)， Tris-Hcl， EDTA， SDS， 蛋白酶 K、 Taq酶、 dNTP均由 Tiangen公司生产， 限制性内切酶 Mse ， Mse- -N， TEN100， TEN1000， TE，PMD18-T， Solutron- ， X-Gal， IPTG， 硝酸银，无水乙醇， 75%乙醇，氢氧化钠，10%APS（ 烷基磺 酸 ）， 甲醛溶液， TEMED（四甲基二乙胺），亲和硅烷，剥离硅烷，琼脂粉，酵母浸膏， Bis-acrylamide（ 甲叉双丙烯酰胺 ），尿素， acrylamide（ 丙烯酰胺 ）， 磁珠， 琼脂糖
14、凝胶 DNA回收试剂盒（ DP209-02） 购自 天根生化科技 (北京 )有限公司， PCR扩增引物由上海英潍捷基贸易有限公司生产 。 1.2 实验方法 1.2.1 龙头鱼基因组 DNA 的提取 实验用龙头鱼样本采自于舟山海域， 按酚 /氯仿抽提法从 龙头鱼 尾鳍中提取基因组 DNA 的详细方法和步骤如下 511： (l) 将样品放入离心管剪碎。加入 300 L裂解液 (0.02M Tris-Hcl， 0.05M EDTA，l%SDS)，于振荡器上震荡均匀。 本科毕业论文 材料与方法 3 (2) 加入蛋白酶 K 6-7L后，放入恒温水槽 37 水浴 3-4 小时至溶液澄清，期间约30min
15、颠倒混匀一次。 (3) 从水槽中出后凉至室温，加 300L等体积苯酚 :氯仿 :异戊醇 (25:24:l)，温和颠倒混匀至乳浊 10min。 (4) 离心 (10000r/min)10min，小心吸取上清液至另一新的干净离心管。 (5) 重复步骤 3、 4 ， 3-4 次。尽量使上清液保持澄清 。 (6) 在得到的上清液中加入 600L 冰乙醇（无水，体积为苯酚 :氯仿 :异戊醇的 2 倍）10000r/min 离心 10min。 (7) 此时离心管底部能看到絮状的沉淀，小心的弃去上清，加入 70%乙醇约100L，缓缓吹洗 DNA 絮状沉淀， 10000r/min 离心 10min 后弃上清。
16、 (8) 重复步骤 7， 1-2 次 (注 ： 不要将 DNA 沉淀倒掉 )。 (9) 将 DNA 样品置于金属加热器中干燥 (视管中乙醇残留量多少适当调整干燥时间 )， 加入适量 TE(10mM Tris-HCL， lmM EDTA， pH8.0)溶解，置 4 冰箱待用或长期保存于 -20 待用。 1.2.2 酶切 基因组 DNA利用限制性内切酶酶切 ，具体步骤按照限制性内切酶说明书进行。 1.2.3 接头的制备与连接 用单链的寡核苷酸制备接头，每种单链寡核苷酸的浓度均为 10 mol /L。本实验采用 Brown 接头：等比例混合两组寡聚核苷酸链，这两条链的序列是 OligoA 和Olig
17、oB，首先 95 变性 10 min，然后缓慢冷却至室温，最终形成双链接头。建立20 L 的反应体系 ( 接头 10mol /L， 1 .5 L； T4 DNA 连接酶 1 L， 10 Buffer2 L，纯化的酶切片段 10 L，无菌水 补足体积至 20 L) 。 16 连接过夜。 1.2.4 龙头鱼基因组文库的建立 1.2.4.1 PCR 扩增 PCR 程序 ： 94 变性 5 分钟， 94 30s； 55 1min； 72 1min， 30 个循环，循环结束后再 72 延伸 10 分钟。 连接产物 PCR 反应 10Buffer 5L dNTP 3L Mse- -N 10L Taq 0.
18、8L 本科毕业论文 材料与方法 4 10稀释链接液 20L ddH2O 补至 50L 1.2.4.2 特定大小的 DNA 片段的回收 琼脂糖 电泳 10-15 分钟，紫外灯下切胶回收 250-300bp 以上的胶装入 EP 管，然后利用 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收目的片段 。 1.2.5 探针杂交和磁珠富集 详细步骤参考文献 12 1.2.6 富含微卫星序列的 PCR 产物及测序 1.2.6.1 连接载体 将纯化的 PCR 产物与 T 载体链接，按照 以下体系于 16 连接过夜 PMD18-T 1L DNA 4L Solution- 5L 1.2.6.2 克隆、转化和阳性克隆的挑选 连
19、接产物转入大肠杆菌感受态中 (100L 分成 50L2 管 )，然后冰浴 30min， 42热激 90s，然后再冰浴 3min。之后加入 300-400L LB(不含 Amp)摇床 2h(37 ，200r)。然后把菌液涂到预先涂过 X-Gal 40L 和 IPTG 10L 的平板上， 37 恒温培养箱培养过夜 13。 隔天早上就可以挑选阳性克隆，在超净台中挑选已经转入目的 DNA 的白色菌株，加入事先加入 500L LB 的离心管中。 1.2.6.3 菌落 PCR 根据以下体系 ： Tap 酶 0.4L 10Buffer 1.5L dNTP 1.2L P1 0.3L P2 0.3L 菌液 1L
20、 H2O 补足到 15L 菌落 PCR 反应程序为： 95 变性 5min ， 95 30s ； 55 30s ； 72 40s ，30 个循环， 72 延伸 10min 本科毕业论文 材料与方法 5 1.2.6.4 检测 取 1L 左右用 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，检测后我们挑选 300bp 以上的阳性克隆寄出去测序。序列的测定由商业公司 (上海美季生物公司 )完成。 1.2.7 微卫星 PCR 引物和电泳 1.2.7.1 微卫 星的 PCR 引物 从测序结果而开发的 28 对微卫星引物中 多样性 分析 ： PCR 的体系为以下 Taq 酶 0.4L dNTP 1.2L 10Buffer
21、 1.5L DNA 0.6L 引物 1 1L 引物 2 1L ddH2O 补足到 15L PCR 反应程序为： 95 变性 5min， 95 30s； 52 30s； 72 30s， 30 个循环。72 延伸 5min。 1.2.7.2 电泳 (1) 电泳装置的准备，将玻璃板充分洗净，在玻璃上 分别 涂上剥离硅烷 和 亲和硅烷。凉干后，放上胶条，将两块装好，放平。 (2) 灌胶，用 l00mL量筒量取 50ml 6%聚丙烯酰胺贮备液， (含 TBE)， 250L 10%APS和 30L TEMED。充分混匀。混匀后迅速灌胶，期间用吸耳球轻轻敲打，使胶均匀扩散，完成后在板一侧慢慢插入梳子，注意梳
22、齿下不要有气泡产生，室温聚合 2h 以上。 (3) 将聚合好的 PAGE 胶组装到电泳仪上，拧紧螺丝。 (4) 在 DNA 加入等体积的变性剂， 96 变性 9min， 迅速放入 -20 冷却待点样。 (5) 点样。 (6) 电泳，向胶槽中倒入电泳缓冲液 (1TBE)， 200W 电泳 2h 左右 14-17。 1.2.8 聚丙烯酰胺凝胶银染 银染色法是近年来建立的一种非放射性核素标记的核酸序列测定方法。原理是通过高灵敏度的银盐显色步骤来检测末端终止法完成的测序凝胶其具体步骤及注意事项为 18。 本科毕业论文 材料与方法 6 (1) 固定 ： 电泳后的 PAGE 把玻璃拿下来，把带胶的放入 7
23、5%的乙醇 1L 摇动15min(以前沿指色为准 )固定可过夜。 (注意 :固定液 不可用太 多次，最好 4-5 次换液 ) (2) 水洗：纯水 1L， 摇动 10min (3) 银染 ： 将水洗后的凝胶放入染色液 (硝酸银 1.8g，水 1L，甲醛 3mL) 15min。 (注意 ： 当外界温度较高时 (一般 15 以上 )染色时间和显色时间应缩短，且染色效果较好 ； 当环境温度较低时 (15 以下 )，要相应的延长时间和显色时间，也可用增加染色液和显色液的浓度来代替时间的延长 (4) 水洗 ： 倒掉染色液，水洗 10s。 (注意 :染色后洗胶，作用是洗去没有和 DNA 嵌合的 Ag+，因此 ， 洗胶时间过短，没有嵌合的 Ag+不能完全被洗掉，造成背景色较深、对比度较小、甚至看不出电泳条带 ;若洗胶的时间过长，与 DNA 嵌合的 Ag+也会被洗掉，造成电泳条带染色较浅，甚至完全脱色 )。 (5) 显影 ： 将凝胶放入显色液 (氢氧化钠 20g，甲醛 4mL，水 1L)中以显出清晰的带为标准。一般约 10min 就可以 (显色液先预冷显色效果更佳 ) (6) 水洗：纯水 1L，洗去多余的 NaOH，然后晾干，留以后分析用。
