1、荆州市猪瘟、口蹄疫、猪繁殖障碍与呼吸综合征血清学调查与防控第 1 章 文献综述1.1 疫病的发现及其危害猪瘟又称欧洲经典猪瘟（Hog Cholera，HC或Classical Swine Fever，CSF) ，是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV或Hog Cholera Virus，HC）引起猪的一种急性、热性和高度接触传染性传染病，以发病急促、高稽留热、细小血管壁变性引起全身泛发性小点出血、内脏器官（脾）梗塞和坏死、非常强的传染性和非常高致死率等为主要特征 1。据报道，猪瘟疫病最早约出现于 1810 年的美国田纳西州，大约在 1833 年又在美国俄
2、亥俄州暴发，又有报道，该病于 1862 年首先出现于英格兰，然后传到欧洲大陆；在我国关于猪瘟的报道，最初可追索到东南大学农科系于 1925 年研究 CSF 免疫血清的记载开始，至于何时发现和证明猪瘟存在，没有明确的文字记载 2。口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)，我国民间俗称为 “口疮” 、 “鹅口疮” 、 “蹄癀”或“脱蹄症” ，是由口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus ，FMDV）引起猪等偶蹄兽的一种急性、烈性、高度接触性传染病，以口腔黏膜、蹄部、乳房、鼻镜以及皮肤等处病初出现水泡，继而发生溃疡、传播速度极快，发病率极高为主要特征
3、 2。据报道，口蹄疫流行历史悠久，最早出现于 1514 年，H Fracastorius 描述了当时意大利牛群中相继发生的一种疾病，症状类似于现在的口蹄疫，但是直到 1898 年，德国微生物学家莱夫勒(FLoeffler)和弗罗施(PFrosh)才确定，引起牛口蹄疫的病原体是口蹄疫病毒(foot and mouth disease)，从而纠正了之前人们认为 FMD 的病原是细菌、霉菌或原虫的错误认识，这也是人类认识的第一个滤过性动物病毒 2。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) ，又称为猪蓝耳病（Blue-e
4、ar disease） ，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV) 引起的以母猪繁殖障碍 (早产、流产、弱仔、死胎、木乃伊胎等) 、幼龄仔猪发生呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病 1,3。该病于1987年首次在美国的中西部发现，并分离到病毒株，其后在全美迅速蔓延，并迅速遍及加拿大、德国、法国、荷兰、英国、西班牙、比利时、澳大利亚、日本、菲律宾等国1,4。1996 年，我国学者郭宝清等首次从国内疑似PRRS 爆发流产的猪胎儿中分离出PRRSV，从而证实了本病在我国的存在 1,5。猪瘟、口蹄疫和猪
5、繁殖与呼吸综合征是危害养猪业的极其重要的疫病。因此，猪瘟和口蹄疫被世界动物卫生组织（Office International des Epizooties OIE）列为A类动物传染病和国际重要的检疫对象，且口蹄疫位列之首，在我国列为一类动物疫病；猪繁殖与呼吸综合征列为B类动物传染病，在我国列为二类动物疫病。据世界粮农组织一世界动物卫生组织一世界卫生组织(FAOOIE WHO)出版的动物卫生年鉴公布，全世界有44个国家和地区存在猪瘟。美国、阿尔巴尼亚等24个国家与地区宣布消灭了猪瘟。但到1993年后，一些己宣布消灭了猪瘟的国家和地区，如德国、英国、荷兰、瑞士、比利时、瑞典、西斑牙等，又先后出现了
6、猪瘟的复发 6。19971998年，德国、荷兰、意大利、西班牙、比利时发生接力式的猪瘟流行，造成了数十亿欧元的经济损失，其中特别是荷兰损失最大：爆发猪瘟424起，3个月内扑杀近1 000万头猪，占总养猪量的2/3，经济损失高达20亿美元 7-10。目前该病主要在亚洲、欧洲、非洲、拉丁美洲的国家与地区流行，尤其在亚洲，猪瘟爆发事件和病例呈逐年上升趋势。近来，宣布自1918年就已消灭了猪瘟的南非也报告爆发了猪瘟 11。我国是养猪规模最大的国家，也是猪瘟流行比较严重的地区，各省市均有猪瘟流行的报告，每年因猪瘟死亡的病例约占病死猪的l/3 以上，给我国造成近100亿元的经济损失 12。猪口蹄疫爆发不仅
7、导致动物死亡、病畜及可疑病畜被屠杀焚毁、患病期间肉和奶的生产停止、病后肉和奶产量长期减少、种用价值丧失，还造成对疫区周围的广大范围必须隔离封锁、禁止动物转移和畜产品调运上市、畜产品出口贸易被禁止、对相关产业的影响（如饲料业、畜产品加工业等） 、旅游业的影响、环境的污染、成为生物武器的可能。经济的巨大损失，政治上的影响，民众的恐慌。2001 年，英国在英国英格兰艾塞斯郡的一家屠宰场，发现了待宰的 28 头猪患有口蹄疫症状，很快口蹄疫在英国迅速大规模暴发。据统计，英国2001 年集中宰杀、焚烧了近 700 万头感染口蹄疫的牲畜，牲畜及畜产品出口受到抵制、禁运，畜牧业遭受毁灭性打击，造成直接经济损失
8、 51 亿英镑，间接损失达 200 亿英镑（相当于英国国内生产总值的 2.5%） ，虽然 2002 年元月 15 日英国宣布已消灭了口蹄疫，但欧盟在 2002 年 9 月 25 日起才解除贸易禁运令 13。我国台湾 1997 年爆发口蹄疫，3 月 10 日新竹县的一个牧场首先报告了第 1 例可疑猪 O 型口蹄疫病例，截止 3 月 22 日，全省共有12 个县、市 106 个猪场，3.7 万头猪发病，死亡 1.1 万头；25 日共有 357 个猪场，9.2 万头猪发病，死亡 2 万头，扑杀 1.9 万头；26 日疫情波及到 13 个县市 543 个猪场，病猪达13.6 万头，死亡 3.3 万头，
9、扑杀病猪 2.2 万头；29 日有 14 个县市 842 个养猪场发病，病猪达 74 万头；至 8 月底全岛共扑杀病猪和同群猪 600 万头，此次疫情造成的直接经济损失高达 15 亿美元，间接经济损失达 103 亿美元，更为严重的是台湾 3 年内很难出口生猪和畜产品，每年损失 15.5 亿美元的外汇收入，相关的饲料业和肉类加工业的损失也达上亿元新台币，给台湾的养殖业造成致命打击 14。猪繁殖与呼吸综合征于 2006 年的 68 月份集中发生于我国高湿高温的南方地区如江西、湖南、湖北、江苏、安徽、浙江等南方省份，疫情传播快，来势猛，波及范围广，各种年龄和各种品种的猪均易感染，临床抗生素治疗效果差
10、或根本无效71。在一些疫区，发病率、死亡率高达 60以上。由于当时确定不了病因，但所有发病猪均出现高热症状，故称为“高热病” ，随后该病毒逐渐扩散和蔓延到相临省份以及我国的大部分养猪地区。截至2007 年 7 月份，我国农业部通报全国已有 26 个省份发生了高致病性猪繁殖与呼吸综合征，疫点 309 个，防控形势相当严峻。该疫情在全国范围内广泛流行，导致生猪大批死亡和淘汰，给养猪生产造成了严重损失，引起国内外广泛关注 15,16。此后，该病一直是严重威胁我国生猪养殖业的重要疫病。猪瘟、口蹄疫和猪繁殖与呼吸综合征常常混合感染或继发。1.2 病原学1.2.1 猪瘟病毒(Classical Swine
11、 Fever Virus ，CSFV)猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)属于黄病毒科 (The Family Flaviviridae)瘟病毒属(The Genus Pestivirus)。CSFV 是具有囊膜的单股正链 RNA 病毒，核苷酸约 12 kb。病毒粒子的直径为 40-50nm，略呈圆形，脂蛋白囊膜有 55 kD 和 46kD 两种糖蛋白，上有类似穗样的糖蛋白纤突。病毒粒子有二十面体对称的核衣壳，核衣壳则由 36kD 的蛋白质组成。病毒分子量约为 4x106Da，在蔗糖密度梯度中的浮密度 1.15-1.16g/cm3，等电点是 pH4.8，
12、沉降系数为 140-180S1,2。目前仍认为HCV为单一血清型，尽管分离出了不少变异性毒株，但都属于1个血清型。只有毒力强弱之分，不同毒株之间存在显著差异，强毒株引起死亡率高的急性猪瘟，中等毒株一般产生亚急性或慢性感染，胎儿感染低等毒力株可引起轻微症状或亚临床感染，但胚胎感染或初生仔猪感染则可导致死亡。中等毒力株感染的后果部分取决于猪的年龄、免疫能力和营养状等宿主因素，而强毒株或低毒株感染，宿主因素近4起很小的作用。有的HCV的毒力性状是不够稳定的，通过猪体1代或多代后可使毒力增强 1。不同毒株之间抗原存在明显差异，根据对单克隆抗体的反应，可将 HCV 分为 2 大抗原群，但未能发现抗原群与
13、毒力之间的关系。在实验条件下，CSFV 很稳定，但温度对培养上清液毒活性有很大影响，病毒粒子在 50可存活 3d，在 37可存活 7d，在70可存活多年(约 4 年) 而不明显丧失其感染性，在冷冻的尸体中至少可存活 2 个月。病毒在超过 60且持续 60min 才能保证完全破坏血清、血液或尿液中的病毒。病毒在 PH5.0-10.0 时稳定，但在 pH3.0 时迅速失活，脱纤血中的病毒在 pH5.0-5.5 时最为稳定。乙醚、氯仿、去氧胆酸盐、诺乃洗涤剂 P40 和皂角素等可使其迅速失去感染性。病毒对胰蛋白酶中度敏感，二甲基亚砜（ DMSO）可使病毒稳定，故常将其用于 CSFV 的冻存液。前列腺
14、素 A1 能抑制 CSFV 的增殖，50g/mL 浓度能抑制 99%病毒的生成。CSFV 的自然宿主是猪和野猪，不能凝集鸡、豚鼠、猪、牛和人的红细胞。CSFV 可在猪的骨髓、睾丸、肺、脾和肾的细胞培养物及白细胞中增殖，最常用的是 PK-15、SK-6 和 CPK 细胞系，其中最易感的是 PK-15、PK-2a 和 ST 等几株猪肾和猪睾丸细胞系 1,2。1.2.2 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV) 口蹄疫病毒属于小RNA病毒科(Piconlaviridae)，口蹄疫病毒属 (AphtllovinlS)。到目前为止，已发现了7个血清型，即O 、A
15、、C型(称欧洲型)，SATl、SAT2 、SAT3( 即南非l 、2、3型，称非洲型)和AsiaI(即亚洲I型，称亚洲型) ，其中欧洲国家主要有 O型、A型、C型，近年来O1型和A22型发生较多；亚洲国家为O型、A型、C型和Asia型，中东地区发生过A22型；非洲国家为O型、A型、C型、SAT型、SAT型、SAT型；拉丁美洲国家为O型、A型、C型。7个血清型可根据核酸同源性大小分为两群，0、A 、c和AsiaI 为第l 群，sATl、sAT2、sAT3为第2群。群内各型同源性达6070 ，但两群之间同源性仅为25一40，血清型间无血清交叉和交叉免疫现象 1。口蹄疫病毒粒子为正二十面体结构，直径
16、 2030 衄，分子量为 69X106u。完整的病毒颗粒包括衣壳和 RNA 两部分，衣壳由 vPl、vP2 、vP3、 vP4 各 60 分子组成，另外还有若干分子的前体蛋白 VPO，无囊膜结构。完整的病毒粒子的沉降系数为140s146s。FMDV 的 RNA 大约由 8500 个核苷酸组成，5端无帽结构。1.2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)猪繁殖与呼吸综合征病毒属于动脉炎病毒科(Arteriviridae family)的动脉炎病毒属(Arterivirus)。PRRSV 为有
17、囊膜的单股正链 RNA 病毒，经纯化的病毒粒子在电镜下呈球形，直径为 45-83nm，核衣壳直径为 25-35nm，呈二十面立体对称，囊膜表面有时可以看到明显的纤突，外包一层脂质双层膜。PRRSV 在 CsCl 和蔗搪密度梯度中的浮密度分别是 1.13-1.199cm3 和 1.181.149cm3 17。病毒的基因组 RNA 具有感染性 18,19。基因组大小约为 15kb，包括 8 个开放性阅读框(ORFs)，其顺序依次为：5 -ORFIa_ORFIb-ORF(2-7)-3。位于 ORF l 上游 5端是非编码区(Non-Coding Region NCR)，核酸序列高度保守。第一个开放性
18、阅读框 ORF l 位于基因组的 5端，约包含了整个病毒基因组大小的 80。从 ORF2 到 ORF7 的所有基因都位于基因组的 3末端。ORF7 终止密码子之后为 3非编码区，含有一个 poly(A)尾 20据报道Lv 株 3非编码区为 114 nt，比美洲株 3端非编码区少 22 nt，两者同源率为 59%，利用这种差异可进行 PRRSV 的分子诊断或毒型鉴定。PRRSV 每个阅读框的编码产物都己经鉴定。ORFI 编码 RNA 的复制酶和几个非结构蛋白(Nsps)， ORF2 一 ORF7 的所有基因编码结构蛋白。ORF2 到 ORF7 基因编码的蛋白的分子量大小分别是 2930KDa，4
19、550KDa，3卜 35KDa,25KDa，18-19KDa15KDa，分别对应的蛋白名称是 GP2，GP3，GP4，E(GP5) ，M 和 N 蛋白(GP 代表糖蛋白) 。ORFI 编码病毒 RNA 复制酶其氨基酸序列含有 EAV 和LDV 的保守成分 21。蛋白质是 PRRSV 病毒粒子的主要成分，具有重要的功能。主要阐述一下 E 蛋白和 M蛋白GP5 又称 E 蛋白，属于糖基化囊膜蛋白，由 ORF5 编码，分子量为 26ku 一30ku。GP5 蛋白含有 2-4 个糖基化位点和一段含有 31 个氨基酸的信号肽，另外还含有一段很大的内部疏水区，可能起锚定膜的作用。GP5 有 6 个抗原决定
20、簇，可诱导产生中和抗体，能在体外中和病毒的感染性，其中和抗原表位既有线性表位，又有构象表位，且 GP5 的胞外区是最重要的中和表位。通过对 GP5 中和抗原表位的研究，发现 GP5 的糖基化与中和活性无关，但其内部构象对中和活性抗体的产生有重要作用。病毒中和作用与抗 GP5 抗体效价呈显著相关性，而且针对 GP5 的单抗比 GP4 的单抗在中和病毒方面更为有效可靠。用含编码 GP5 的质粒 DNA 免疫，可使接种猪产生抗 GP5 的特异性中和抗体。也有研究表明，该蛋白可诱导细胞凋亡。从目前研究看来，GP5 蛋白 B 位点抗原对设计 PRRSV 疫苗十分有用。M 蛋白即膜基质蛋白，由 ORF6
21、编码，分子量为 18ku 一 19ku，为非糖基化的膜蛋白。M 蛋白在所有的 PRRSV 株间高度保守，在欧、美型毒株间也最为保守。 M 蛋白的 N 端有 3 个疏水性跨膜区，位于第 17-88 位氨基酸残基。 M 蛋白聚集于粗面型内质网上，有一个短肽段暴露于病毒粒子表面，可能与病毒的聚集和结合有关，并与 GP5 形成异源二聚体。通过感染猪康复血清的 Western-bolt 证明了 M 蛋白具有很强的免疫原性，感染后 l0 d 即可激发产生可检测的抗体应答，故表达的重组 M 蛋白可以作为血清学试验的靶抗原。尽管康复猪血清中具有针对该蛋白的抗体，但该蛋白并不涉及病毒中和作用。用针对该蛋白的单抗
22、从北美洲分离株和欧洲分离株中识别了 2 个共同的和 1 个独特的抗原决定簇 1,21。1.3 流行病学1.2.1 猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)该病发生于亚洲大部分国家和地区、中美及南美、非洲及部分欧洲国家。 在自然条件下，猪、野猪是猪瘟病毒唯一的自然宿主，病猪和带毒猪是最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。感染猪在发病前即可从口、鼻及泪腺分泌物、尿和粪中排毒，并延续整个病程。康复猪在出现特异抗体后停止排毒。强毒株感染后 1020 d 内排出大量病毒，而低毒株感染后排毒期短。强毒株在猪群中传播快、造成的发病率高。慢性型的感染猪不间断排毒或间歇排
23、毒。 当 HCV 低毒株感染妊娠母猪时，起初常不被觉察，但病毒可侵袭子宫中的胎儿，造成死产或出生后不久即死去的弱仔，分娩时排出大量 HCV。如果这种先天感染的仔猪在出生时正常，并保持健康几个月，它们可作为病毒散布的持续感染来源而很难被辨认出来。因此，这种持续的先天性感染对猪瘟的流行病学具有极重要的意义，Liess 用低毒力的野毒Glertoif 株给妊娠 40 日龄、70 日龄、90 日龄的母猪滴鼻感染，结果引起母猪繁殖障碍。40日龄感染猪发生死胎、木乃伊胎和流产；70 日龄感染，所生的仔猪约有 45带毒，出生后出现先天性震颤，多于 1 周死亡；90 日龄感染生后仔猪可存在 2-11 个月，猪
24、无明显症状，此种感染猪终身带毒、散毒，为 HCV 的主要贮存宿主，当有这些猪存在时，即可形成猪瘟常发地区或猪场。 猪群引进外表健康的感染猪是猪瘟暴发最常见的原因。病毒可通过猪肉和猪肉制品传播到远方。未经煮沸消毒的含毒残羹是重要的感染媒介。人和其他动物也能机械地传播病毒。HCV 可在野猪群中形成循环感染，这在有些国家和地区是对家猪的严重威胁。 在自然条件下 HCV 的感染途经是口鼻腔，间或也可通过结膜、生殖道黏膜或皮肤擦伤进入。经口和注射感染后，病毒复制的主要部位是扁桃体，然后经淋巴管进入淋巴结，继续增殖，随即到达外周血液，从这时起，病毒在脾、骨髓、内脏淋巴结和小肠的淋巴组织繁殖到高滴度状态，导
25、致高水平的病毒血症。 该病一年四季均可发生，一般以春季、秋季较为严重。急性暴发时，先是几头猪发病，往往突然死亡。继而病猪数量不断增多，多数猪呈急性经过和死亡，3 周后逐渐趋向低潮，病猪多呈亚急性或慢性，如无继发感染，少数慢性病猪在 1 个月左右恢复或死亡，流行终止。 近年来猪瘟流行发生了变化，出现非典型猪瘟、温和型猪瘟，以散发性流行。发病特点临床症状或不明显，死亡率低，病理变化不特征，必须依赖实验室诊断才能确诊。1.2.2 口蹄疫(Foot-and-mouth disease ，FMD)猪口蹄疫的发生和流行同样离不开传染源、传播媒介、易感猪三者构成的链条，其流行强度、波及范围与病毒株、宿主抵抗
26、力和环境等多种因素有关。处于口蹄疫潜伏期和发病期的动物，几乎所有的组织、器官以及分泌物、排泄物等都含有 FMD 病毒。病毒随同动物的乳汁、唾液、尿液、粪便、精液和呼出的空气等一起排放于外部环境，造成严重的污染，形成了该病的传染源。FMD 病毒传播方式分为接触传播和空气传播，接触传播又可分为直接接触和间接接触。目前尚未见到 FMD 垂直传播的报道。（1）接触传播 直接接触主要发生在同群动物之间，包括圈舍、牧场、集贸市场、展销会和运输车辆中动物的直接接触，通过发病动物和易感动物直接接触而传播。间接接触主要指媒介物机械性带毒所造成的传播，包括无生命的媒介物和有生命的媒介物。野生动物、鸟类、啮齿类、猫
27、、狗、吸血蝙蝠、昆虫等均可传播此病。通过与病畜接触或者与病毒污染物接触，携带病毒机械地将病毒传给易感动物。（2）空气传播 FMD 病毒的气源传播方式，特别是对远距离传播更具流行病学意义。感染畜呼出的 FMD 病毒形成很小的气溶胶粒子后，可以由风传播数十到百千米，具有感染性的病毒能引起下风处易感畜发病。影响空气传播的最大因素是相对湿度（RH）.RH 高于 55%以上，病毒的存活时间较长；低于 55%很快失去活性。在 70%的相对湿度和较低气温的情况下，病毒可见于 100km 以外的地区。FMD 病毒可经吸入、摄入、外伤和人工授精等多种途径侵染易感猪。吸人和摄入是主要的感染途径。近距离非直接接触时
28、，气源性传染（吸入途径）最易发生。此外，不可忽视其他可能的途径，如皮肤创伤、胚胎移植、人工自然授精等。1.2.3 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)猪繁殖与呼吸综合征是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。PRRSV 只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和 1 月龄以内的仔猪最易感。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。主要传播途径是接触感染、空气传播和精液传播，也可通过胎盘垂直传播。易感猪可经口、鼻腔、肌肉、腹腔、静脉及子宫内接种等多种途径而感染病毒，猪感染病毒后 214 周均可通过接触
29、将病毒传播给其他易感猪。从病猪的鼻腔、粪便及尿中均可检测到病毒。易感猪与带毒猪直接接触或与污染有 PRRSV 的运输工具、器械接触均可受到感染。感染猪的流动也是本病的重要传播方式。持续性感染是 PRRS 流行病学的重要特征，PRRSV 可在感染猪体内存在很长时间。1.3 临床症状与病理变化1.3.1 猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)猪在胎儿期接触到猪瘟病毒有可能终身感染，潜伏期一般为几个月。仔猪接触病毒后潜伏期为 7 10 天，通常在感染后 5 10 天具感染性，但慢性感染病例一般在 3 个月后才具感染性。 急性型：高热稽留(4142)。食欲减退，偶尔呕吐。嗜睡、挤堆
30、。呼吸困难，咳嗽。结膜发炎，两眼有脓性分泌物。全身皮肤黏膜广泛性充血、出血。皮肤发绀，尤以肢体末端(耳、尾、四肢及口鼻部)最显著。先短暂便秘，排球状带黏液( 脓血或假膜碎片)粪块；后腹泻排灰黄色稀粪。大多在感染后 515天死亡，小猪病死率可达 100。 慢性型：体温时高时低，呈弛张热型。便秘或下痢交替，以下痢为主。皮肤发疹、结痂，耳、尾和肢端等坏死。病程长，可持续 1 月以上，病死率低，但很难完全恢复。不死的猪，常成为僵猪。多见于流行中后期或猪瘟常发地区。温和型：多年来一些地区散发一种所谓“无名高热”症，经研究证明多为猪瘟。因其潜伏期长，症状较轻不典型，病死率一般不超过 50，抗菌药物治疗无效
31、，称为“温和型 ”猪瘟。病猪呈短暂发热(一般为 4041，少数达 41以上)，无明显症状。母猪感染后长期带毒，受胎率低、流产、死产、木乃伊胎或畸形胎；所生仔猪先天感染，死亡或成为僵猪。 病理变化 急性型：白细胞及血小板减少。全身性出血、淤血，尤以(耳根、颈部、胸腹下、四肢内侧)皮肤、淋巴结、喉头、膀胱、肾、回盲处明显。脾不肿大，边缘有暗紫色稍突出表面的出血性 梗死，为猪瘟特征性病变，但一般不常见，仅5070病例出现梗死病变。常见全身淋巴结肿大、出血，切面周边出血显著，杂有贫血变化，呈红白相间的大理石状，多见于颌下、颈部和腹腔淋巴结。慢性型：主要为坏死性肠炎，一般在回盲瓣口、盲肠及结肠黏膜上形成
32、同心轮状的纽扣状溃疡，突出于黏膜面，颜色黑褐,中央凹陷。通常无出血及炎性病变。全身性淋巴组织萎缩。仔猪常见胸腺萎缩，肋软骨连接处外生骨疣。1.3.2 口蹄疫(Foot-and-mouth disease ，FMD)口蹄疫自然感染的潜伏期为 2496 h，人工感染的潜伏期为 1872 h。猪口蹄疫主要症状表现在蹄冠、蹄踵、蹄叉、副蹄和吻突皮肤、口腔腭部、颊部以及舌面粘膜等部位出现大小不等的水疱和溃疡，水疱也会出现于母猪的乳头、乳房等部位。病猪表现精神不振，体温升高，厌食，在出现水疱前可见蹄冠部出现一明显的白圈，蹄温增高，之后蹄壳变形或脱落，跛行明显，病猪卧地不能站立。水疱充满清朗或微浊的浆液性液
33、体，水疱很快破溃，露出边缘整齐的暗红色糜烂面，如无细菌继发感染，经 l2 周病损部位结痂愈合。若蹄部严重病损则需 3 周以上才能痊愈。口蹄疫对成年猪的致死率一般不超过 3%。仔猪受感染时，水疱症状不明显，主要表现为胃肠炎和心肌炎，致死率高达 80%以上。妊娠母猪感染可发生流产。病死畜尸体消瘦，除鼻镜、唇内粘膜、齿龈、舌面上发生大小不一的圆形水疱疹和糜烂病灶外，咽喉、气管、支气管和胃粘膜也有烂斑或溃疡，小肠、大肠粘膜可见出血性炎症。仔猪心包膜有弥散性出血点，心肌切面有灰白色或淡黄色斑点或条纹，称虎斑心，心肌松软似煮熟状。1.3.3 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive a
34、nd respiratory syndrome，PRRS)各 种 年 龄 的 猪 发 病 后 大 多 表 现 有 呼 吸 困 难 症 状 ， 但 具 体 症 状 不 尽 相 同 。 母 猪 染 病 后 ， 初 期 出 现 厌 食 、 体 温 升 高 、 呼 吸 急 促 、 流 鼻 涕 等 类 似 感冒 的 症 状 ， 少 部 分 （ 2%） 感 染 猪 四 肢 末 端 、 尾 、 乳 头 、 阴 户 和 耳 尖 发 绀 ， 并以 耳 尖 发 绀 最 为 常 见 ， 个 别 母 猪 拉 稀 ， 后 期 则 出 现 四 肢 瘫 痪 等 症 状 ， 一 般 持续 1 3 周 ， 最 后 可 能 因
35、为 衰 竭 而 死 亡 。 怀 孕 前 期 的 母 猪 流 产 ， 怀 孕 中 期 的母 猪 出 现 死 胎 、 木 乃 伊 胎 ， 或 者 产 下 弱 胎 、 畸 形 胎 ， 哺 乳 母 猪 产 后 无 乳 ， 乳猪 多 被 饿 死 。 公 猪 感 染 后 表 现 咳 嗽 、 打 喷 嚏 、 精 神 沉 郁 、 食 欲 不 振 、 呼 吸 急 促 和 运 动障 碍 、 性 欲 减 弱 、 精 液 质 量 下 降 、 射 精 量 少 。 生 长 肥 育 猪 和 断 奶 仔 猪 染 病 后 ， 主 要 表 现 为 厌 食 、 嗜 睡 、 咳 嗽 、 呼 吸 困难 ， 有 些 猪 双 眼 肿 胀
36、， 出 现 结 膜 炎 和 腹 泻 ， 有 些 断 奶 仔 猪 表 现 下 痢 、 关 节 炎 、耳 朵 变 红 、 皮 肤 有 斑 点 。 病 猪 常 因 继 发 感 染 胸 膜 炎 、 链 球 菌 病 、 喘 气 病 而致 死 。 如 果 不 发 生 继 发 感 染 ， 生 长 肥 育 猪 可 以 康 复 。 哺 乳 期 仔 猪 染 病 后 ， 多 表 现 为 被 毛 粗 乱 、 精 神 不 振 、 呼 吸 困 难 、 气 喘 或耳 朵 发 绀 ， 有 的 有 出 血 倾 向 ， 皮 下 有 斑 块 ， 出 现 关 节 炎 、 败 血 症 等 症 状 ，死 亡 率 高 达 60%。 仔 猪
37、 断 奶 前 死 亡 率 增 加 ， 高 峰 期 一 般 持 续 8 12 周 ， 而胚 胎 期 感 染 病 毒 的 ， 多 在 出 生 时 即 死 亡 或 生 后 数 天 死 亡 ， 死 亡 率 高 达100%。病变单纯感染，以肺脏为主，肺有出血斑，或有肝变病灶(暗红色) ，腹股沟、肺门等淋巴结肿大，出血，胸、腹腔积液，脑积液，如继发感染，则病变复杂化，可出现相应的病理变化，如心包炎、胸膜炎、腹膜炎及脑膜炎等。猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的繁殖障碍所致的死产仔猪和胎儿很少有特征性病变，猪繁殖与呼吸综合征病毒致死的胎儿病变是子宫内无菌性自溶的结果，没有特异性；流产的胎儿血管周围出现以巨噬细胞
38、和淋巴细胞浸润为特征的动脉炎、心肌炎和脑炎。脐带发生出血性扩张和坏死性动脉炎。生长猪较成年猪更常见特征性组织性病理变化，肺的组织学病变具有普遍性，有诊断意义。单纯的猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的肺炎以间质性肺炎伴随正常的呼吸道上皮为特征。其特点为肺泡间隔增厚，单核细胞浸润及肺型上皮细胞增生，肺泡腔内有坏死细胞碎片。猪繁殖与呼吸综合征合并细菌、病毒感染时，病变依合并感染的细菌/病毒的不同而有所变化，合并感染细菌性病原常引起复杂的猪繁殖与呼吸综合征肺炎，间质性肺炎常混合化脓性纤维素性支气管肺炎或被化脓性纤维索性支气管肺炎所掩盖。有些感染病例还可见胸膜炎。鼻甲部黏膜的病变是猪繁殖与呼吸综合征感染后
39、期的特征，其上皮细胞纤毛脱落，上皮内空泡形成和黏膜下层淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润。淋巴结、胸腺和脾脏的组织病理学变化，以发生中心肥大和增生、生发中心坏死、淋巴窦内有多核巨细胞浸润为特征，病早期可见脾脏白髓、胸腺皮质核、扁桃体滤泡淋巴细胞坏死，后期脾核淋巴结细胞增生；另外 猪繁殖与呼吸综合征病毒感染引起的血管、神经系统、生殖系统的病变也主要表现为淋巴、巨噬细胞、浆细胞的增生和浸润。1.4 疫病流行病学调查方法研究进展1.4.1 猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)1.4.1.1 琼脂扩散试验(AGPl可溶性抗原与抗体在半固体琼脂内扩散，在比例适当的情况下，若抗原与抗体能
40、够结合，就会出现白色沉淀线，此为阳性反应。可选用病猪脾、淋巴结做抗原，但以脾脏较好。该法是将琼脂糖按 1浓度加入 pH8.6 硼酸盐缓冲液或生理盐水中煮沸溶解，倒入平皿中，冷却后置 4 保存，临用时打孔，中央打 1 孔，周围打 6 孔。各孔据试验目的加人样品，并同时设立对照，置湿盒内于 37 孵育，48 h 后观察结果。优点：取材方便、经济、操作简单。缺点：特异性和敏感性差，适用于群体抗体检测。1.4.1.2 直接免疫荧光试验(FA)是最常用的检查猪瘟病毒抗原的方法。Robertson 等 1965 年首次将 FA 用于猪瘟病料和组织培养物的的检测(Robertson et a1 ，1965)
41、。将病死猪脏器，如扁桃体、肾脏、脾脏、淋巴结、肝脏和肺等直接组织触片或制成冰冻切片，亦或者是病毒分离时待检的细胞玻片，将液体吸干后经冷丙酮固定 510 min，晾干。滴加猪瘟荧光抗体覆盖于切片或细胞片表面，置湿盒中 37作用 30 min。然后用 PBS 液洗涤，自然干燥。用碳酸缓冲甘油(pH9 095 ，05 M)封片，置荧光显微镜下观察。必要时设立抑制试验染色片，以鉴定荧光的特异性。FA 检测 CSFV 抗原，方法简单、快速、技术可靠，同时也可检测批量样品，检测成本相对较低，许多国家将它作为执行猪瘟消灭计划的法定试验。国内中国兽医药品监察所丘惠深研究员、王在时研究员等采用免疫荧光抗体法(F
42、A)净化猪瘟已经在一些猪场取得成功，净化后猪瘟疫情得到了有效控制。1.4.1.3 正向间接血凝试验(IHA)正向间接血凝试验是利用 CSFV 致敏红细胞， 将待检血清梯度稀释后在血凝板上进行抗原抗体反应，根据红细胞的凝集程度判断结果。此法能够测出猪瘟抗体效价，简便易操作，可用于免疫抗体的监测。近年来，该方法已运用比较普遍，蔡葵蒸等(2002)采用间接血凝试验(IHA)和斑点酶联免疫吸附试验(DotEL ISA)检测仔猪血清猪瘟母源抗体，结果表明：IHA 比 Dot-ELISA 能更客观地反映仔猪早期的母源抗体水平，适用于生产中仔猪母源抗体或免疫早期抗体的监测 22。刘杰标等(2002)对广西宜
43、州市和环江县共 790 份猪血清进行了猪瘟免疫抗体检测，结果表明两地的猪瘟免疫抗体效价较高，与实际免疫情况基本相符 23。然而该方法受主观判断影响，并且存在批间差异较大的问题，适用于群体抗体监测。1.4.1.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)酶联免疫吸附试验(ELISA) 原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。该方法具有高度敏感性和特异性，而且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害，特别是商品试剂盒和自动化仪器的应用，使其成为一种适用于各级检验部门的免疫标记技术。随着检验医学的不断
44、发展，酶免疫测定的方法、技术也得到发展和更新，Dot-ELISA、发光酶免疫测定、免疫印迹法、BAS 。酶联免疫吸附试验等方法不断得到应用。单克隆抗体制备技术的成熟，极大的推动了 ELISA 技术的发展。对于猪瘟的检测，大量的 ELISA 方法应运而生。余兴龙 (1999)等以 CSFV 的重组 E2 基因产物作为包被抗原，建立了检检测 CSFV 抗体的间接 ELISA 方法。结果表明该方法具有特异性高、易纯化和成本低等特点 24。Lin M 等研究使用 Ems 蛋白对 3 个主导的抗原区作为抗原进行分别研究，结果表明用 Erns aal09160 作为抗原的 ELISA，优于单纯使用完整 E
45、ros 片段或Ems 片段的部分抗原区的 ELISA，并且可将 CSF 的血清学诊断时间提早到感染后 7d。他们后来又进一步研究使用一种嵌合蛋白(C21 EmsE2)作为 ELISA 的抗原，该蛋白包含CSFV 结构蛋白 Ems 的 3 个抗原区的公共区，并且包含 E2 蛋白的抗原激活区。结果表明将嵌合蛋白(C21ErmE2)作为 ELISA 的抗原，其诊断结果优于单独用 Erns 和 E2 蛋白片段作为抗原，重要的是该种 ELISA 也能检测出感染猪瘟病毒 7d 后的血清抗体 25,26。ELISA 方法检测猪瘟抗体已经比较成熟，国内外均形成了成熟的商品化试剂盒，在各专业实验室及基层都得到了
46、很好的运用。在检测猪瘟病原方面，市面上虽然存有商品化的ELISA 试剂盒，目前仍然存在敏感性不高，非特异性明显的问题，仅适用于发病猪的检测，在温和性猪瘟与持续性带毒较为普遍的情况下，猪瘟抗原 ELISA 检测方法还有待进一步提高。1.4.1.5 反转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）聚合酶链反应(PCR)技术的建立带动了分子生物学的飞速发展，应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术成功测定了多株 CSFV 的全基因序列，为猪瘟的致病机理、免疫机制、检测防控提供了坚实的基础。尤其是 CSFVAlfort 株和 Bresica 株基因组全序列的成功
47、测定，使 RT-PCR 技术在 CSFV 的研究中被广泛应用。用 RT-PCR 检测 CSFV，其特异性强、灵敏度高、重复性好，整个过程在 ld 内即可完成，能达到快速检测的目的，并且适合于各种含毒材料的检测，也可用于临床。此外，RT-PCR 技术还可区别与 CSFV 相关的病毒，如BVDV 以及能引起和 CSF 相似临床症状的猪病的病毒，如亚洲 CSFV、伪狂犬病病毒，其灵敏度可达 100%。这一方法在追踪 CSF 传播方面被认为比血清学方法更有效、更优越。迄今为止，各国学者利用 RTPCR 反应扩增并测定 CSFV 基因 eDNA 片段序列，用生物软件分析毒株间的遗传进化关系追踪 CSFV
48、 传播来源和对猪瘟进行诊断，对猪瘟的防控和扑灭将起到不可替代的作用。贾建军(2002)等从经临床和血清学初步诊断为 CSF 的病料中扩增了 CSFVE2 基因片段，为 CSF 的诊断和检疫提供了一种特异可靠的方法 27。陆芹章等(2004)应用 RT-PCR 方法检测了广西 19 个养猪场的 58 份疑似猪瘟病料，结果显示，阳性数为 34 份，阳性率为 5862 28。罗廷荣等(2005)应用 RT-PCR 对来自广西不同地区的 135 份疑似 CSF病料进行检测，阳性数为 84 份，阳性率 62.2%29。大量的研究表明，应用 RT-PCR 进行猪瘟的诊断已经成熟。1.4.1.6 Real-
49、Time RT-PCR目前 Real-Time RT-PCR 方法以其快速、灵敏、低污染率的优点跻身于各种检测方法中，在猪瘟的早期检测及预防、控制上起到重要作用。温国元(2004)等采用荧光定量 PCR 技术对 CSFV 进行快速定量检测，结果表明：该方法的检测灵敏度可达 10copy/L。将该方法与 RT-PCR、RT-nPCR 进行比较，发现该方法检测灵敏度比 RT-PCR 高 100 倍，与 nPCR具有相同的灵敏度，该方法的最大优点是避免了常规 PCR 电泳检测所带来的高污染率 30。Ophuis 等(2006) 用 Real-Time RT-PCR 方法检测猪瘟病毒感染猪体后病毒的动态分布，结果在攻毒后的第 1d 于扁桃体检测到病毒，在第 3 天 d 时于下颌淋巴结、脾脏、回肠和肠系膜淋巴结检测到猪瘟病毒 31，为预防和控制该病作出早期诊断有较大意义。1.4.2 口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)1.4.2.1 琼
