1、指导教师：卢兴浩,课题：基因治疗,孙梓桉、孟芳梅、张小萌、李珊、李子剑、董玮琪、梁其冬、葛煜、孙康、刘龙飞,小组成员：,第一次的讨论：孙梓桉为主席,第二次的讨论：孟芳梅为主席,第三次的讨论：葛 煜为主席,2018/9/23,汇报内容,基因治疗的概念基因治疗应用的途径常见疾病的基因治疗基因治疗存在的危险性,基因治疗,基因治疗定义1.（从原理）指将正常和野生型的基因插入靶细胞的染色质基因组中，以补充缺失基因或置换致病基因，从而产生新的表型的一种治疗方法。2.（从应用）试图从基因水平调控细胞中缺陷基因的表达，或以正常基因矫正、代替缺陷的基因，以此治疗基因缺陷所致的遗传病、免疫缺陷、或治疗因癌基因激活
2、/或抑癌基因失活所致的肿瘤。,基因治疗技术,1）化学法：将正常基因DNA（及其拷贝）与辅助物混合，形成的物质直接倾入培养基中与细胞接触，将DNA输入细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，在适当的条件下，整合基因得以表达。这种方法简单，但效率极低。,2）物理法：包括电穿孔法和直接显微注射法。 电穿孔法：通过电击使细胞细胞膜发生变化，周围基质中的DNA可渗进细胞，但有时也会使细胞受到严重损伤。显微注射法：显微注射是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。,3）同源重组法：同源重组法是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上，在该座位因有同源序列，通过单一或双交换
3、，新基因片段替换有缺陷的片段，达到修正缺陷基因的目的。但对于体细胞基因治疗，体外培养细胞的时间不能过长，筛选量大，故在临床上应用也受限制难以进行。若提高重组率，这种方法则得以发展。,基因治疗技术,4）病毒介导基因转移：（目前最常用）病毒介导基因转移是以病毒为载体，将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让重组病毒去感染受体宿主细胞。目前应用的有两种病毒介导基因转移方法。 反转录病毒载体：反转录病毒是RNA病毒，RNA利用反转录生成为DNA，再整合到宿主细胞基因组。优点：转化细胞效率高；感染广谱动物物种和细胞类型；可长期存留，一般无害于细胞。缺点：只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染
4、色体；有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性；由于病毒整合基因组是随机的，可能激活细胞的原癌基因，以及因随机插入发生插入突变。DNA病毒介导载体：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒。后来证明，载有外源DNA的复制缺陷腺病毒呈现与普通DNA相同繁殖的特点。,病毒性疾病的基因治疗,随着对乙型肝炎病毒（HBV）基因组的序列、结构蛋白的功能及其生命周期的进一步了解，产生了一系列针对阻断病毒基因的表达或功能的基因治疗方法。,1反义寡核苷酸 反义寡核苷酸指合成的20个碱基左右的一小段核苷酸，按照沃森-克里克碱基配对原则，与特定的靶序列杂交，从而抑制基
5、因的表达。当反义寡核苷酸特异地与HBVmRNA结合形成RNA-DNA（反义DNA）或RNA-RNA（反义RNA）杂交体，可定向抑制和阻断其复制和表达。 2核糖核酸酶 核糖核酸酶是一类具有催化活性的小分子RNA，能特异地结合于靶RNA上，形成RNA-RNA杂交体，催化特定序列RNA分子的切割。 核糖核酸酶基因能通过多种病毒（载体传递系统被传递，并在靶细胞中持续表达。由于其可以不可逆的使靶RNA失活，可在体外循环利用，催化效率高，能避免重复给药，可能产生终生保护。 3显性失活突变体（DN突变体） 细胞内干扰性多肽蛋白的合成能干扰其正常对应物的生理功能。显性失活突变体在体外可特异性抑制HBV复制，是
6、值得研究的新型抗病毒剂。 显性失活突变体优于核糖核酸酶、反义寡核苷酸,潜在优势在于它与病毒序列变异无相关性，从而减少了形成或累积成“治疗逃逸突变株”的危险；而且产生抗病毒作用所需的细胞内浓度相对较低；再者，DN突变体不影响细胞的转录，所以对转染的细胞没有直接的毒性作用。,癌症的基因治疗,1.基因导向酶解药物前体治疗（GDEPT） GDEPT是通过利用肿瘤细胞和正常细胞之间基因表达的差异，使某一酶基因仅在肿瘤细胞转录表达，以增加肿瘤基因治疗，破坏细胞的特异性。2.插入自杀基因 将编码某一敏感性因子的基因转入靶肿瘤细胞，使该细胞对换某种原本无毒或低毒的药物产生特异的敏感性而死亡。这一表达敏感性因子
7、的基因称为药物敏感基因或自杀基因。 多数自杀基因疗法研究是通过编码病毒或细菌的酶来介导药物敏感性，即肿瘤细胞产生的酶把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，从而抑制核酸合成。自杀基因治疗的缺点是仅杀伤S期细胞，即仅能诱导一小部分分裂细胞发生死亡。3.肿瘤细胞药物增敏基因治疗 该疗法是指将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对药物的敏感性。 如将钙调素基因转入癌细胞，利用其对癌细胞MDR的逆转作用，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。4.肿瘤耐药基因治疗 通过基因转移技术转移耐药基因到正常器官组织，以保护其免受化疗药物的毒性作用。该疗法可以提高化疗效果。,基因治疗成功案例,重症联合免疫缺陷（sci
8、d）是由于腺苷脱氨酶ADA缺陷所致。ADA活性缺陷性疾病为常染色体隐性遗传病。患者表现为，易感染。检查可发现外周血淋巴细胞数减少（严重的淋巴细胞减少症）和低免疫球蛋白血症。 法国巴黎某医院的一位博士及其同事已成功治疗了4例(4/5)scid患儿。他们去除患儿骨髓，修复未成熟免疫细胞的遗传缺陷，然后将修正的细胞再输入患儿体内。不足4个月，4名患儿体内即出现了成熟t细胞和自然杀伤细胞，治疗2年多后其t细胞反应仍接近正常。,干细胞治疗,干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞， 是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万
9、用细胞”。 干细胞治疗是把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。干细胞疗法就像给机体注入新的活力，是从根本上治疗许多疾病的有效方法。,1、干细胞治疗神经系统疾病如：脑瘫、脊髓损伤、运动神经元病、帕金森病、脑出血 、脑梗塞后遗症、脑外伤后遗症等； 2、干细胞治疗免疫系统疾病如：糖尿病、皮肌炎、肌无力、血管病变、硬化病、白血病等；3、干细胞治疗其他疾病：如肝病、肝硬化、股骨头坏死等；4、干细胞治疗肾病 。,基因治疗的危险性,1.病毒载体的安全性 将外源基因导入细胞的方法很多，但最常用的方法是以病毒作用载体进行的基因转移，如腺病毒载体、反转录病毒载体等
10、载体等介导的、基因转移这些关于基因治疗的载体系统都是经过人工改造的一些缺陷性病毒。 可是是否存在着在人体组织细胞内通过重组或突变儿“复活”的可能。虽然在人体内通过回复突变儿“复活”的可能性极小，而且随着技术的改进，这种回复突变的可能性又有所下降，但是我们也不能因此而放松警惕。,2.癌基因的活化问题 当病毒载体携带基因进入人体后，它本身是无法定位的，这种不确定性表现在两个方面：一是靶细胞的转移是非特异性感染；二是基因组的整合为非定点整合。经基因治疗的疗效发挥以及副作用的产生带来了很大的不确定性，插入突变可能使一个重要基因失活或者更严重的是激活一个愿癌基因。这个问题的危险程度到底多大现在未知。,3
11、.免疫反应病毒载体可能引起免疫反应而使受治疗者死亡，且这一方面很难克服。,相关案例,相关案例,基因治疗存在的不良反应,1、病毒介导的炎症反应病毒载体能够导致脑和脊髓的炎症。虽然用于转染的腺病毒不能在细胞内自我复制，但这种复制缺陷重组腺病毒在体内不仅能引起中枢的局部炎症还能引起外周的免疫反应。复制缺陷重组腺病毒能直接损伤细胞但却不引起明显的全身免疫反应和炎症反应，提示病毒介导的细胞损伤可能不全依靠细胞免疫和体液免疫。另一方面，有些病毒蛋白能防止神经元的凋亡，而另一些却加强了对TNF介导的凋亡的敏感性。2、外周免疫反应 将病毒导入脑和脊髓能诱发外周的免疫反应。 免疫抑制能降低腺病毒介导的炎症反应并
12、增强转染基因的稳定性。,基因治疗的某些观点,基因治疗存在技术上的缺陷和不安全因素，病人不但可能得不到有效合理的治疗，而且容易成为新生物医学技术的试验品。基因治疗中最大的问题就是外源基因不能稳定地、持续地、高效地表达，在动物实验中最长的报道也仅二年，大多在36个月之间，医学临床上的疗效也多为暂时性的。由于缺少基础研究，纵使哪些人们认为已经比较清楚的疾病，也并非没有问题。而遗传病、癌症等病因异常复杂的疾病，存在的问题就更多，更不能盲目的应用于临床。 对人类的基因干预有可能引发现存人类道德不能包容的伦理难题，也是引致广泛争论的话题。,基因治疗在美国实行之初，曾经遭到社会的强烈反对，反对意见中呼声最高
13、的是人类不该取代上帝。這些意见背后包含大众对操作基因感到的恐惧与威胁；更多人担心，如果允许进行基因治疗，今后人类对于基因操纵的层面就會不断扩大，将来甚至可能发展成操纵生殖细胞，而这种危险终将給人类后代带来深远影响。,基因治疗的伦理问题,恳请各位老师同学批评指正！,基因治疗的伦理问题,关于基因治疗途径的问题 体细胞途径的基因治疗:只涉及受治者本身，基因治疗中转移的遗传物质，仅在被传导的部分的靶细胞中具有活性，不会传到相邻的其他类型的体细胞中，更不会通过其生殖细胞传给后代。 对别人或其后代无影响，从社会伦理道德这一角度上来讲，医生根据目前科学和技术的进展和条件，最大限度的发挥其治疗对病人带来的好处
14、，最大限度的降低基因治疗可能给病人造成的伤害，将整个基因治疗的程序和可能的后果详细介绍给病人，并征得病人的同意方可进行。 生殖细胞的基因治疗:是目前国际上严格禁止的。因为生殖细胞的基因治疗不仅影响到接受基因治疗者本身，而且转移的遗传物质可随生殖细胞一代一代传下去，这样生殖细胞就有可能打乱整个人类的遗传信息系统，将给整个人类带来极为严重的后果，应当严格禁止。,关于基因表达的水平问题 将一些基因导入到人体提高机体某一方面功能，改进机体的某些特点，但什么样的基因表达水平是病人最理想的，这仍然是一个无法解决的问题。 那么什么样的基因表达水平才能使病人达到正常，如将生长激素基因导入正常儿童体内使其长的更
15、高，就不符合人类基因治疗的社会伦理道德标准。,基因治疗与治疗者（病人）,基因治疗史上关于治疗者的问题,知情选择时的“治疗性误解”“研究”是要获得新知识（如有价值的数据和资料），“治疗”是要借助有明确疗效的方法来治病救人。显然，基因治疗仅仅是一种临床研究，并非成熟的治疗方案。不少研究者在实践中存在用“临床治疗”代替“临床试验”的问题。由于广大患者对不同临床阶段基因治疗的目的、安全有效性不一定很熟悉，受试者难免会认为将从中获得直接的治疗利益。当混淆了“治疗”和“研究”时，在知情同意过程中的“治疗性误解”就难以幸免。,研究者尽可能以受试者可接受的方式告知各种潜在的风险和受益，并提供估计“风险/受益”
16、比的方法。既要慎重对待各种潜在的风险，但又不可因噎废食，要在“不伤害”和“有利”之间找到平衡点。试验者考虑导入的基因是否稳定高效表达、载体的毒性等。但仅仅做到“不伤害”并非基因治疗的本意，它须对病人有预防、治愈、缓解、减轻疾病的功效，对整个人类的健康有利。,返回,基因治疗失败实例,18岁的格尔辛基因临床试验的某些失误而于1999年9月17日死亡。格尔辛基是世界上首位由基因治疗导致丧生的患者。他患先天性鸟氨酸甲酰氨基转移酶缺乏症病症，在男性身上较严重，往往引起新生男婴患者的死亡。 此次事件发生与宾夕法尼亚大学在基因治疗中急于上临床、忽视试验规则有很大关系，此次事件对基因治疗产生了一些负面影响，美
17、国各界对此极为关注。美国FDA和美国国立卫生研究院对此事件进行调查的结果认为：（ 1）对格尔辛基采用了门静脉注射最大剂量的重组病毒（1X1014VP）。临床尸检和实验室检查结果表明，门静脉大剂量注射重组病毒激发了机体致命的免疫反应，导致病人多器官衰竭而死亡。 （2）结论：临床试验存在违规行为，而与进行的基因治疗的制品本身无直接关系。,基因治疗失败实例,7月24日，美国西雅图Targeted Genetics公司向美国FDA（美国食品与药品监督局）报告说，在一项正在研究的基因疗法治疗活性炎性关节炎临床试验中，有一名受试患者死亡。尽管这名患者的生病原因不清楚，并且目前也仍然不确定，但是FDA已经让该公司停止了进一步的试验，并且不能招募新的患者继续试验。在这项试验中有100多个患者参与，没有相似的严重事件发生。但是，这名死亡患者在第二次注射这种产品时发病。 腺相关病毒一直被认为是最安全的载体，以腺相关病毒作为载体的基因疗法被称为腺相关病毒基因疗法。但是据此前科学杂志报道，一项研究发现有些人在用腺相关病毒基因疗法治疗过之后，细胞内会产生不正常的染色体。,
