1、,一、背景,公司成立于2003年，依托牛津大学科研技术开发新产品基于T细胞检测的技术平台最先获得认可产品：T-SPOT.TB 在欧洲、美国、加拿大和其它地区正式上市,Oxford Immunotec 公司简介,Above: UK headquarters Abingdon, OxonBelow: US headquarters, Marlborough, MA,结核病全球关注的问题全球20亿人口感染结核新增活动性结核病人约900万/年每年130万患者死亡中国450万活动性结核病人新增活动性结核病人约145万/年死亡人数约13万/年,试剂盒研制临床背景,活动性结核与潜伏感染,接触活动性结核病患者
2、,暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除,没有症状,结核杆菌仍旧存在而不能被侦测 X-光/ CT 扫描显示正常没有抗体应答诊断困难传统的结核感染检测只有 TST（PPD）,机体被感染,受机体免疫力抑制没有临床症状,终身处于感染状态,潜伏感染,有临床症状具有传染性,结核杆菌可以通过涂片、培养检测出胸部的 X-光或 CT 扫描显示异常 肺外结核难以诊断 (特别是儿童),活动性结核,5%,5%,再次激活,控制结核的关键,早发现早治疗,二、方法原理,-干扰素释放实验 （IGRAs，interferon- gamma release assays ）酶联免疫斑点技术 （ELISPOT，Enzyme-Li
3、nked ImmunoSpot assay）结核杆菌特异抗原 早期抗原靶6（ESAT-6，early secreted antigenic target 6 ） 培养滤液蛋白10（CFP 10，culture filtrate protein 10 ）,试剂盒研制技术背景,-干扰素释放实验（IGRAs）,干扰素检测阴性,干扰素检测阳性,结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-）。因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有
4、临床症状。基于IGRAs原理的产品目前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等国家写入本国的结核诊疗指南中,-干扰素释放实验（IGRAs）,1983年，在南北两个半球地理位置相距遥远的两个研究小组几乎同时、独立地创立了这项技术。一个研究小组位于澳大利亚西部的柏斯Peth，牵头人是当时正在当地Margaret 女王医院儿童医学研究所攻读博士学位的Jonathon D. Sedgwich （Sedgwick JD et. al., 1983）。另一个研究小组位于北欧瑞典城市哥德堡Gothenburg，带头人是哥德堡大学医学微生物系的学者Cecil C. Czerkinsky
5、（CzerkinskyCC et. al., 1983a）。,酶联免疫斑点技术（ELISPOT）,近二十多年来，随着抗体制备、PVDF膜材料等技术改良，ELISPOT 分析技术已经是当世公认的最灵敏的抗原特定T细胞的体外检测技术结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况，灵敏度高。其技术原理，可一句话概括为：用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。,酶联免疫斑点技术（ELISPOT）,酶联免疫斑点技术（ELISPOT）,由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丢失
6、该基因序列绝大多数的环境分枝杆菌也不存在RD1区,结核杆菌特异抗原,ESAT-6与CFP 10抗原,采用-干扰素释放实验原理，依靠结核特异 抗原保证效应T淋巴细胞的特异性结合酶联免疫斑点技术的特性，提高检测灵敏度,三、试剂及检测过程,试剂盒主要原材料研究,试剂盒主要组成成分结核杆菌特异抗原（ESAT-6、CFP 10）植物血凝素（PHA）对照抗原预包被的培养板、标记二抗、底物显色液,国外上市情况2004年-英国MHRA认证和欧盟CE认证（EU）2005年-加拿大上市许可2006年-韩国上市许可2008年-美国FDA的PMA认证2010年-中国、新加坡和俄罗斯的产品注册,试剂盒国外上市及应用情况
7、,采集样本（外周抗凝全血）密度梯度离心分离外周血 单个核细胞（PBMCs）洗涤PBMCs,检测过程,把PBMCs与结核特 异抗原一同加入到 预包被抗-干扰素 抗体的培养孔中37二氧化碳孵育16-20小时,检测过程,洗涤培养孔加标记二抗孵育1小时,检测过程,洗涤培养孔加显色液用蒸馏水终止反应,检测过程,1个斑点=1个效应T细胞,检测过程,阴性结果,阳性结果,空白对照抗原 AESAT-6抗原 BCFP10阳性对照（PHA）,实际效果图,四、比较,结核病的常规诊断方法,（1）细菌学检查 是结核病诊断的金标准，但涂片阳性率低，培养又耗费时日（2）分子生物学检查 虽然快速、灵敏，但操作烦琐、技术要求高（
8、3）结核抗体诊断 诊断价值有限，但其简便、快速，可以作为结核病的辅助诊断方 法之一（4）PPD（TST）实验 传统的结核感染检测方法，对于接种过卡介苗(BCG)或环境分枝 杆菌感染的受试者会出现一定的假阳性结果，对于使用激素或免 疫抑制剂的受试者会出现一定的假阴性结果,1、方法学比较细菌学,细菌学检测涂片、培养结核病诊断的“金标准”涂片：快速，简便，特异性较好，灵敏度差培养：耗时长，特异性高，灵敏度稍高于涂片 美国FDA临床数据国内临床数据国内外文献,2、结核菌素皮试PPD,PPD的临床意义阴性结果：1、表示未受结核菌感染2、某些情况下不排除已受结核菌感染, 使用免疫抑制剂等;免疫功能低下如重
9、症结核病,慢性消耗性疾病,肿瘤,艾滋病,高龄等。3、阴性也不表示没有结核感染.值得注意的是假阴性情况,在临床上有感染结核的确切依据而患者PPD试验却阴性,这种情况常见于以下疾病：初次感染结核菌48周以内,重度营养不良,恶性肿瘤,机体免疫缺陷性疾病（先天性免疫缺陷症,艾滋病）,免疫抑制剂使用者等,个别老年人因机体变态反应功能低下也常呈阴性反应。,结核菌素皮试PPD,PPD的临床意义阳性结果：1.一般阳性和中度阳性：结核病现症患者；已受结核菌感染但并不意味着发病或患病；卡介苗接种所致变态反应；2.强阳性：结核病患者；感染结核菌未发病者.强阳性人群结核病的发病率高,在未找到病变时可作预防性治疗。,T
10、-SPOT.TB 与皮试的比较,皮试TST(PPD)的影响因素1、免疫力状况年龄、药物2、交叉反应卡介苗、环境分枝杆菌3、检测操作、结果判断,方法学比较TST Vs T-SPOT.TB,假阳性卡介苗接种环境分枝杆菌假阴性免疫力状况年龄（新生儿、老年人）药物,特异性不受卡介苗接种影响不受环境分枝杆菌影响灵敏度基本不受免疫力状况影响肺外结核检出率高药物、年龄,例：研究数据,293例怀疑结核病的非洲儿童平均年龄3岁，约46% HIV抗体阳性，多数合并营养不良57例确诊结核病的儿童中，ELISPOT阳性率81%；TST阳性率35%年龄、 HIV感染状态和营养不良的严重程度对ELISPOT结果无影响，但
11、均能导致TST结果的显著差异,Liebeschuetz et al Lancet. 2004,方法学比较TST Vs T-SPOT.TB,五、临床及评价,1、将该产品（方法学IGRA）写入诊疗指南的国家（Guidelines）,英国、爱尔兰、德国、法国、意大利、瑞士、荷兰、葡萄牙、丹麦、挪威美国、加拿大日本、韩国、澳大利亚等,指南解读（一）,建议用IGRA替代TST用于结核筛查德国、英国、瑞士、丹麦、波兰等适用于抗TNF- 治疗人群,指南解读（二）,TST和IGRA两者均可美国、法国、澳大利亚、日本等卡介苗(BCG)接种人群首选IGRA（美国）,指南解读（三）,两步法：先用TST，再用IGRA
12、以提高灵敏度与特异性加拿大、西班牙、荷兰、韩国、澳大利亚等主要适用于接触追踪,2、应用方向,1）结核病辅助诊断/疗效评价“菌阴”结核病患者的辅助诊断肺外结核的鉴别诊断抗痨治疗的疗效评价2）免疫力低下/受抑制患者的结核诊断/感染筛查使用生物制剂/免疫抑制剂患者的结核感染筛查HIV感染者/肾透析患者/器官移植患者3）儿童结核病的辅助诊断4）结核密切接触者/高危人群的结核感染筛查结核病患者的家属/医务工作者/监狱囚犯5）接触追踪,对于“涂阴”结核病患者有很高的检出率（94.2%）对于肺外结核病患者有很高的检出率（90.3%）对于结核潜伏感染的检测，不受卡介苗（BCG）接种影响，比PPD检测更准确 不
13、能够提示临床患者的病变部位不能够根据斑点数量的多少来判断受试者是活动性结核病患者或是潜伏感染者对于结核/癌症患者的鉴别诊断，须结合临床症状进行判断,科室特点,消化科腹水待查肠结核的鉴别诊断发热待查生物制剂治疗前结核筛查,科室特点,呼吸/传染/感染科呼吸系统疾病与结核鉴别诊断胸水/心包积液鉴别诊断肺外结核辅助诊断发热待查,科室特点,风湿免疫科生物制剂/免疫抑制/激素等药物的使用结核筛查肺结核与肺间质病的鉴别诊断发热待查,科室特点,儿科儿童肺结核的辅助诊断儿童肺外结核的鉴别诊断,评 价,特异性好，不受卡介苗（BCG）接种与环境分枝杆菌影响灵敏度高，受个体免疫功能低下影响小快速，24小时报告结果,评 价,不能够提示临床患者的病变部位不能够根据斑点数量的多少来判断受试者是活动性结核病患者或是潜伏感染者儿童结核的辅助诊断，需要结合临床,
