1、毕业论文 开题报告 生物工程 灵菌红 素的稳定性研究 1 选题的背景 和 意义 随着毒理学和分析技术的不断发展 ， 合成色素对人体健康的危害越来越引人注目 ， 有的还有致癌作用 ， 因此合成色素作为食品添加剂的用量越来越少 ， 甚至被众多国家禁止使 1。而天然色素作为食品添加剂具有较高的安全性 ， 无毒、色泽亮丽诱人 ， 尤其是一些天然色素本身就是人们日常饮食的成分 ， 有一定的营养价值和药理保健作用 ， 因此倍受人们的瞩目 2。 目前在我国的天然红色素中 ， 占市场主导地位的是从植物中提取的红色素 ， 但阻碍植物红色素发展的一个原因就是植物的生长周 期比较长 ， 而且提取工艺比较复杂 ， 给
2、天然红色素的数量及质量带来了很大的影响。利用微生物发酵生产天然红色素很好地解决了这个问题。微生物的生长周期一般为 1d 3d， 而且不受环境因素的影响 ， 提取工艺比较简单 ， 产品质量能够保证。本实验以产红色素细菌的摇瓶发酵液为原料 ， 对发酵所产生红色素的稳定性进行了研究。 2 相关研究的最新成果及动态 随着科学水平和生活质量的不断提高 ， 合成色素的安全性问题也逐渐呈现 ， 从自然界中提取天然色素是未来发展的主要方向。 色素分为人工合成色素和天然色素两大类，在实际生活中应用广泛。由于合成色 素的安全性问题，不少合成色素在各国允许使用的程度被大大限制，尤其在食品、医药、和化妆品行业 3。开
3、发天然色素是世界应用色素发展的总趋势 ， 很多天然色素具有安全可靠 ， 没有毒副作用 ， 色调自然 ， 接近天然物质等优点 ， 天然、营养、多功能是色素发展的趋势。天然色素如 -胡萝卜素是人体必需的营养物质 ， 又如黄酮类天然色素 ， 同时具有一定的药理作用。随着加工行业的发展 ， 色素的应用也随之不断扩大 ， 对天然色素的需求在不断的提高。目前天然色素的获得主要 3 条途径 4：一是 直接提取 ， 二是人工合成 ， 三是利用生物技术产生。但前两者受到资源 和环境等多种因素的限制。近年来随着生物技术的发展 ， 利用生物技术生产天然色素为人们开辟了广阔的领域。通过微生物资源发酵生产红曲色素、类胡
4、萝卜素等多种天然色素已成为现实 。同时雨生红球藻和法夫酵母（生产虾青素）也是目前仅有的具有大规模工业生产酮类胡萝卜素的微生物系统。三孢布拉霉已经被俄罗斯用于工业生产 -胡萝卜素多年。 目前，对天然色素的研究主要为从植物中提取，另一个方面从微生物发酵产生色素探究。根据以上研究成果，归结如下 ； 2.1 植物中提取天然色素 2.1.1 超声波提取茄子皮天然红色素 王顺民、周丽娟 5等人利用超声波确定提取天然红色素的最佳工艺条件：料液比为 1 6，浸提温度为 70 ，浸提时间为 30min。紫茄红色素在可见光区的最大光吸收波长为 530nm，在弱酸性、中等温度、避光条件下稳定；紫外线、常见食品添加剂
5、蔗糖和乙酸对该色素都具有增色作用；氧化剂对其影响较小，但还原剂对其有较大影响，并且还会使色素产生白色沉淀。 2.1.2 树脂纯化前后玫瑰花红色素的稳定性研究 玫瑰花花瓣层厚，色彩鲜艳，适合提取色素。玫瑰花红色素属于花色苷类物质，是世界各国普遍允许使用的一类天然红色素 6。作者研究了纯化前后的 玫瑰花红色素在不同贮藏条件、不同食品添加剂及不同金属离子环境中的稳定性 7。 酸性条件下该色素的稳定性在上述条件下有较强的稳定性 ， 玫瑰花红色素稳定性由强到弱的贮藏条件是 ： 低温避光、室温避光室温光照 ； 在试验所用的浓度范围内 ， 亚硫酸钠使该色素稳定性增强 ， 抗坏血酸使其稳定性减弱 ； 离子 F
6、e2+、 Sn2+对玫瑰花红色素起到了稳定作用 ， Pb2+、 Mg2+对稳定性有一定影响 ；Ca2+、 Na+对稳定性几乎有影响 ； 纯化后的色素在一些常见离子中稳定性较强 ， 为玫瑰花在保健食品和中药开发及综合利用提供了理论依据 7。 2.1.3 萝卜红色素的树脂吸附提纯 徐忠等 8应用 DA101 大孔树脂，对萝卜红色素进行了提纯，色素溶液经吸附、解吸后纯度有很大的提高。张晴 9、权清转 10等 X-5 大孔树脂提纯萝卜红色素进行了研究，结果表明， X-5 大孔树脂对萝卜红色素具有较好的吸附能力，提纯后色素溶液的色价比国家标准提高了 13 倍。李浩明、张晴等应用 AB-8、 X-5、 N
7、KA-9、 D4020、 D3520、 S-8、聚酰胺等 7种树脂对萝卜红色素的提纯进行了比较，他们的结论不太一致。前者的实验表明 AB- 8 树脂具有最佳的提纯效果， X-5 树脂次之，而后 者却得出恰恰相反的结论。 2.1.4 辣椒红色素的稳定性研究 近年来，微胶囊技术已逐渐成为辣椒红色素的稳定化研究与开发的热点 11。辣椒红色素的微胶囊化是将一定比例的辣椒红色素与 -环糊精及其它壁材在一定比例的丙酮 -乙醇溶液中进行包埋，真空干燥制得样品。 其主要工艺流程为：配料 乳化 均质 喷雾干燥 微胶囊。 天津市工业微生物研究所采用微胶囊包埋技术制成的微胶囊食用天然辣椒红色素，包埋率高达 98%。
8、向云峰采用微胶囊包埋辣椒红色素，芯材包埋率和微胶囊收得率也达到 90%以上。辣椒红色素微胶囊技术的开发与应用 极大地提高了色素稳定性，从而提高了食品质量， 有助于提高产品档次，节省生产成本，为辣椒产业的发展注入了新的科技含量。 2.2 产红色素的微生物研究 2.2.1 灵菌红素的稳定性研究 灵菌红素（ PG）属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶， PG 对温度稳定，但受 pH 的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大； A13+，Ca2+， K+， Ba2+等金属离子对 PG 的稳定性
9、影响不大， Zn2+有使 PG 增色的作用， M92+和Mn2+对 PG 有一定的破坏作用， Pb2+可以络合 PG，使之成为沉淀，白光和蓝光使 PG 发生光解，在红光和远红光下 PG 则不会降解。 袁保红 12将从广东大亚湾海水中分离的红色海杆菌 (Rhodomarinobacter sp.)的发酵条件进行了优化。李厚金对从大亚湾海水中分离的 pseudomonas sp 的 GYP 液体培养基中选用自来水 20， 50， 80， 100海水作介质对照研究 NaCl 在 PG 产生中的作用。结果表明，盐度越高细菌菌体生长和色素产生的速度越快。 Nakashima 等研究用细菌， y-prot
10、eobacterium 生产 PG 时发现， y-proteobacterium 同样具有 quorumsensing(QS)系统， N acyl homoserine lactones(N.AHL)是此系统的一种关键性物质，在发酵中通过控制 N AHL 的浓度可提高 PG 的产量。 20 世纪 80 年代以来，人们开始从基因水平研究 PG 的生物合成途径及其调节， 1983 年 Feitelson 等克隆了天蓝色链霉菌与PG 合成相关的基因簇， Thomason 等首次将分离得到的 Serratia PG 生物合成基因转入欧文氏菌 (Erwinla carotovora)质粒，成功表达并得到
11、了 PG。随着生物操作技术的发展和对 PG 的深入研究，人们将更加清晰地认识 PG 的产生和作用机制，大量生产制备 PG，用于替代在癌症及免疫治疗中对人体有害作用的化学药物，造福于人类。 2.2.2 天然色素的基因工程菌的构建 通过重组技术改变微生物的新陈代谢可以实现在不产生色素的微生物中产生天然色素。比如埃希氏大肠杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母和运动发酵单孢菌已经被用于研究产类胡萝卜素。在微藻、细菌、植物、真菌中，大约种类胡萝卜素酶的个基因被克隆。除少数外，大部分类胡萝 卜素基因都可以在不同的寄主生物体中表达，并且远源种系的多酶聚集可使类胡萝卜素生物合成。 3 课题的研究内容及拟采取的研究方法
12、（技术路线）、难点及预期达到的目标 3.1 研究内容 ： 本课题所要研究探讨的是某微生物 次级 代谢产物 -红色素的稳定性研究。 3.2 采取的研究方法、技术路线 ： 从不同的环境条件中研究红色素的稳定性。 3.3 课题的研究难点 ： 对微生物产红色素的稳定性相关课题的研究并不多，而且对现在产红色素，并不能具体确定其菌属，所以研究方向没有针对性，同时，实验条件也不是很完善。 3.4 实验方案 本次实验采用单因素对照法， 分别考察 光照、温度、 pH、金属离子、氧化剂、还原剂等对红色素的稳定性进行探究。 3.5 实验方法 3.5.1 色素溶液的配制 称取一定量纯化过的灵菌红素，溶于 45%乙醇水
13、溶液，使其有合适的吸光度。 3.5.2 光照对色素稳定性影响 取配制好的色素溶液， 分别以室外直射和室内散射光进行照射 ,每隔 0.5h对其吸光度进行测定 ,直至吸光度降到较小数值。 3.5.3 温度对色素稳定性影响 取配制好的 色素溶液置于 40,60,80,100,120 下 ,每隔 0.5h测定其吸光度 。 3.5.4 pH值对色素稳定性影响 取配制好的 色素溶液 ,用 1mol/L盐酸和 1mol/LNaOH 调色素溶液的 pH 值 ,pH值范围 1-12,然后测定其吸光度及观察其颜色变化。 3.5.5 金属盐离子对色素稳定性影响 取配制好的 色素溶液 ,分别加入 NaCl、 FeCl
14、36H2O、 ZnSO47H2O、 CaCl2为0.001,0.005,0.01,0.05,0.1mol/L五 种用量 ,另 MgSO4为 0.001,0.002,0.003,0.004,0.005mol/L,测定吸光度并观察颜色变化。 3.5.6 氧化剂双 氧水对色素稳定性影响 取配制好的 色素溶液分别加入双氧水为 0.001,0.005,0.01,0.05,0.1mol/L,测定吸光度值并观察颜色变化。 3.5.7 还原剂亚硫酸钠对色素稳定性影响 取配制好的 色素溶液分别加入亚硫酸钠为 0.001,0.002,0.003,0.004,0.005mol/L,测定吸光度并观察颜色变化。 3.6
15、 预期达到的目标 ：找到各种环境条件下，红色素最稳定的环境条件。为红色素的提取和保存提供基础数据。 4 论文详细工作进度和安排 1 月 15 号 -2 月 15 号：查阅文献资料，完成外文翻译和 文献综述的初稿工作，了解实验方案； 2 月 16 号 -2 月 28 号：继续查阅文献资料，完成开题报告的初稿工作，了解微生物摇瓶和发酵罐的培养过程； 3 月 5 号 -5 月 30 号：开始正式对红色素的稳定性实验，并在期间测定相关实验数据，以及论文的撰写工作。 5 参考文献 1 黄文 , 王宁 , 刁海鹏 , 等 . 荸荠皮棕色素的提取及稳定性研究 J. 中国酿造 . 2005(9): 1719.
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