1、 1 毕业论文 开题报告 生物工程 灵菌红素合成酶基因的克隆 一、选题的背景和意义 灵菌红素 ( Prodigiosins)是可是一类含有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构的化合物，由沙雷氏菌、放线菌及多种海洋细菌（包括 Hahella chejuensis KCTC2396 和假单胞菌）产生的一种天然色素 1 Microbiology,Dec2006:887-899.，其中以 Serratia 属微生物生物合成灵菌红素的报道居多。由于具有抗细菌、 抗疟疾、抗真菌、 抗原生动物、 抗癌 2、 免疫抑制活性 3,4 和快速杀死导致赤潮的大部分浮游生物 5 等重要生物活性 ,因此它在医药、 食
2、品添加剂、 环境治理、 纺织染料 6 和农业病虫害防治 7 等方面具有广阔的应用前景和巨大的研发价值。用化学合成法大量制备 PG 一直未能实施，人们寄希望于微生物发酵生产。 目前国内外对产 PG 微生物的研究主要集中在陆地微生物沙雷氏菌上。人们的研究主要集中在其抗肿瘤方面，美国国立癌症研究 (NSI)Melvin 等发现 PG 在平均 IC50 为 2.1 molL-1时对包括白血病、肺癌、中枢神经系统癌、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肾癌 、卵巢癌在内的八种癌细胞株中的 57 种不同的人癌细胞均有抗性作用 8。然而，灵菌红素的应用远远不止这些，由于其无毒抗菌性能，可以作为一种绿色的饲料添加剂，且
3、由于其是一种天然色素，可以作为纺织工业中的染料。 随着畜牧业规模化、商业化的发展，兽药及饲料添加剂在畜牧业生产中广泛运用，在促进了养殖业生产发展的同时，也带来很大的负面影响。动物的高密度饲养带来的环境污染，饲料添加剂带给动物产品的体内残留量过高而导致人类疾病的危险性增大，特别是一些要求限制的促生长激素和有毒物质的添加更引起消费者的恐慌。有些对人的健康产生 直接危害，细菌的耐药性给抗生素及其他药品的现代化学疗法带来了极大的困难，还造成环境污染，对动物健康产生危害而影响畜牧业发展 ，因禽兽产品安全问题而影响出口贸易等。开发高效、无残留、无公害的安全饲料添加剂是社会发展的要求和必然结果。近年来，国内
4、外广大学者对安全饲料添加剂的开发和应用进行了大量的研究，相继开发出了大量产品，如酶制剂、微生态制剂、功能性寡糖、酸化剂和中草药制剂等 9,10,11,12,。 （ 1）茶皂素，其作为畜禽饲料添加剂，能明显提高机体的免疫功能，增强抗病能力；但糖萜素有明显的溶血毒性，不能添 加到鱼类饲料和养殖池塘中。 2 （ 2）微生态制剂，以活体形式在动物消化道中与病原菌进行竞争抑制，增强动物机体的免疫功能，并直接参与胃肠道微生物的平衡，加快达到胃肠道功能的正常化，产品没有抗药性和药物残留。但目前适宜的菌种较少，且较易失活，耐 pH 较差 难以与微生物竞争时处于优势地位 6。 （ 3）酶制剂，酶制剂研究中最为重
5、要的问题是在生产及其处理过程中如何保持酶的稳定性和饲喂效果。 （ 4）酸化剂，利用几种特定的有机酸和无机酸制成复合酸化剂，能迅速降低 pH 值，保持良好的缓冲值和生物性能。 但其只能减少抗生素的使 用而不能替代。 （ 5）寡聚糖，促进动物后肠有益菌的增殖，提高动物健康水平的微生态调节剂功能；通过促进有害菌的排泄、免疫佐剂和激活动物特异性免疫等途径，提高其整体免疫功能，防治疾病发生。但寡糖本身成本较高，生产效率较低， 且属于非消化糖类不能添加过量。 （ 6）中草药制剂，从天然植物提取，主要成分有多糖、植物黄酮、植物类黄酮 (多酚类 )、以绿原酸为代表的植物有机酸和寡糖。具多种功能如提高兽类生长速
6、度，免疫活性等无毒副作用，安全性较高 。但目前一些中草药饲料添加剂在开发应用中还存在产品添加量大、有效成分不明、作用机 理不清、作用效果不稳定、剂型单一、缺乏毒理安全方面的研究，原料和产品质量控制标准不完备等问题 13。 二、相关研究的最新进展与动态 20 世纪 80 年代以来，人们开始从基因水平研究 PG 的生物合成途径及其调节， 1983年 Feitelson 等 14克隆了天蓝色链霉菌与 PG 合成相关的基因簇， Thomason 等 15则首次将分离得到的 Serratia PG 生物合成基因转入欧文氏菌（ Erwinla carotovora）质粒，成功表达并得到了 PG。 1-二羟
7、吡咯 -5-羧酸还原酶催化合成脯氨酸的最后一步，该酶由 proC 基因编码。对链霉菌来说，脯氨酸是合成灵菌红素的前驱物质。 Barona-Gmez 等 16研究发现多拷贝 proC 基因可使链霉菌 A3(2) 产生灵菌红素，但是删除该基因却不会引起脯氨酸缺陷型的突变。streptorubin B (cyclic)和十一烷基灵菌红素的合成在动力学上有着一定地联系。 Jeffery T. Davis17研究发现灵菌红素具有可作为单质子配体与阴离子结合，包括 Cl-和HCO3-。它可以穿过磷脂双分子层，具有很强跨膜阴离子载体功能，可成为 HCl 的协同转运体。 3 三、课题的研究内容 及拟采取的研究
8、方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 3.1 研究内容： 本课题研究内容主要是设计合适的扩增引物，对 PigC 基因的 PCR 扩增，然后对扩增的目的基因进行序列测定，以确定是否为新的基因，并在数据库中注册。 3.2 采取的研究方法、技术路线： 3.3 课题的研究难点： 对灵菌红素进行克隆表达有以下几个难点： 1 现今国内外对其研究还较少，所能借鉴的经验较少 2 找出与实验菌种同源性较高的编码灵菌红素的完整的基因 序列也面临着一些挑战 3 编码灵菌红素的基因片段太大，进行体外克隆也有一定地难度 4 实验不稳定因素较多。 3.4 实验方案 18-28： 提取筛选出粘质沙雷氏菌的总基因组 DNA
9、、根据 Genbank 公布的序列，然后设计特异性引物，再利用特异性引物进行 PCR 扩增，对其进行测序，最后通过比对确定是否为新的基因。 1 材料准备 提取总基因组 DNA 根据 Genbank 公布的序列 ,设计 PigC 基因特异性引物 进行测序，比对是否为新的基因 , 并在数据库中注册 建立进化树 。 PCR 扩增 4 1.1 菌种 粘质沙雷氏菌 1.2 分子生物学常用酶及试剂 RNA 酶； Taq 酶、 Marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒； DNA 连接酶； dNTP;MgCl2缓冲液。 试剂：琼脂糖、 Tris、氯仿、异丙醇、牛肉 膏、乙醇、异戊醇、 NaCl、 MgCl2、 Na
10、OH、盐酸等均为国产分析纯试剂； 1.3 常用培养基 液体培养基： 1.3蛋白胨， 0.5甘油， 0.5氯化钠， pH 自然 固体培养基： 1.3蛋白胨， 0.5甘油， 0.5氯化钠， 2琼脂粉， pH 自然 1.4 主要仪器设备 PCR 扩增仪；高速离心机；微波炉；高压蒸汽灭菌罐；超净工作台；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪，电泳仪 (水平 )、电泳槽 (垂直板 )；恒温水浴锅；恒温培养箱：恒温摇床； -20 冷冻冰柜。 2 方法 . 培养：细菌接种于 5ml 液体培养基中， 37 摇床（ 300rpm）培养过液。 . DNA 的提取 （ ）细菌收集：取 1ml 培养物于 1.5ml EP 管中，室温
11、8000rpm 离心 5min，弃上清，沉淀重新悬浮于 1ml TE（ pH8.0）中（用 ddH2O 也行 )。 （ ）菌体裂解：加入 6l 50mg/ml 的溶菌酶， 37 作用 2h。再加 2mol/LNaCl50l，10%SDS 110l， 20mg/ml 的蛋白酶 K 3l， 50 作用 3h 或 37 过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体） （ ）抽提：菌液均分到两个 1.5ml EP 管，加等体积的酚 氯仿 异戊醇 (25 24 1)，混匀，室温放置 5-10min， 12000rpm 离心 10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去） （ ）沉淀：加 0.6
12、 倍体积的异丙醇，混匀，室温放置 10min， 1 2000rpm 离心 10min。 （ ）洗涤：沉淀用 75%的乙醇洗涤。 （ ）抽（凉）干后，溶于 50 mlTE 溶液或 50l ddH2O 中，取 2-5l电泳。作 PCR 模板用。 . 通过核酸数据库的查阅，设计合适的扩增引物：根据 GenBank 上已知的粘质沙雷氏菌的基因序列，设计一对引物，引物由上海生工公司合成。 5 . PigC 基因的 PCR 扩增； 本实验 PCR 扩增反应体系为 25L，反应体系组成如表 1。 PCR 扩增条件 :94 预变性 5 min， 94 变性 1min， 52 退火 1 min， 72 延伸 1
13、.5min， 30 个循环，最后 72 延伸 10min。扩增体系在实验过程中进一步优化。 将 PCR产物依上述琼脂糖凝胶电泳进行扩增检测， PCR 终产物测序委托上海生工生物股份有限公司完成。 表 1 PCR 反应体系 试剂 用量 10xPCR buffer 2.5uL 25mM MgCl2 2.5uL 10x dNTP 0.5uL 正向引物 2.0uL 反向引物 2.0uL DNA 摸板 1.0uL Taq 酶 0.5uL 无菌水 14uL . 扩增的目的基因进行序列测定，以确定是否为新的基因，并在数据库中注册 ，建立进化树 。 3.5 预期目标 ： 根据 GenBank 上已知的 Pig
14、C 基因序列，设计扩增合适的特异性引物，成功提取目标菌株的基因组，进行体外扩增 ， 对扩增的目的基因进行序列测定，并注册在数据库中 。 四、论文进度与安排 2010 年 10 月 23 日 -10 月 30 日：查阅文献资料，确定实验方案。 2010 年 11 月 1 日 -12 月 18 日： 继续查阅文献资料，同时做好实验室的器材药品的准备工作。 2011 年 3 月 19 日 -3 月 24 日： 准备开题答辩。 2011 年 3 月 26 日 -4 月 20 日：提取基因组 DNA,设计特异性引物进行 PCR 扩增并测序。 2011 年 4 月 20 日 -5 月 19 日：对实验做初
15、步的总结与归纳，并补充相关实验数据。 6 2011 年 5 月 20 日 -6 月 5 日： 完成毕业论文及答辩。 五、参考文献 1 Neil R. Williamson, Peter C.Finian, Leeper P.C.Salmond. The biosynthesis and regulation of bacterial prodigininesJ. Nature Review. 2 Williamson N R, Fineran P C, Grist wood T, et al. Anticancer and immunosuppressive prope- rties of b
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