1、 毕业论文 开题报告 生物工程 灵菌红素染色性能及染色后抗菌稳定性的研究 一、选题的背景、意义 灵菌红素 (prodigiosins， PG)是一类天然红色素的总称，是由一些放线菌、沙雷氏菌及其它细菌产生的次级代谢产物，具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、 抗原生动物 、 抗肿瘤 等 免疫抑制 活性 ， 在医药、食品、印染、纺织、饲料添加剂、环境治理等领域，均具有巨大的应用潜力和广阔的市场前景， 因此成为研究的热点。 PG 通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构， 1929 年由 Amak 等研究 Serratia 生长时发现，包括 prodigioSin， prodigio Sin 25-C
2、，metacyc1oprodigiosin (MP)desmethoxyprodigiosi 和 uncedy1prodigiosin(UP)等。 PG 属于脂溶性色素， 难溶于水， 易溶于甲醇和丙酮，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶； PG 对温度稳定，但受 pH的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大。 研究表明， 灵菌红素 具有一定的抗菌性。 Cang 等以沙雷菌发酵生产的 PG 做抗菌实验，结果表明，对芽孢杆菌具有显著地 杀菌作用。 PG 的结构类似物具有显著的抗 Trichopyton spp.等真菌的活性，在临床
3、测试中表现出对 Coccidmycosis 引起的一种地方 性 真菌传染病有良好的治愈作用。 灵菌红素作为具有良好抗菌活性的天然色素，在纺织、食品等方面有较好的应用前景。本研究通过系统的考察灵菌红素对常见细菌的抗菌性，并进一步探讨其染色性能和染色后的抑菌性，为灵菌红素的进一步开发利用提供理论基础。 二、相关研究的最新成果及动态 近年来灵菌红素的在医学上、环境治理以及农业上的应用越来越广泛，所起的作用也越来越大，以下就最 近的研究成果及动态作一表述。 1. 灵菌红素在医学上的应用 首 灵菌红素 医学上的应用是人们最关注的方面，即抗肿瘤作用。灵菌红素对比起另外一些化学疗法药剂，如 环磷琉胺 （ c
4、yclophosphamide）具有低细胞毒作用，只有当浓度大于 300nM时才 具有明显的淋巴细胞抑制作用。而后者在其有效浓度时毒性已非常高 7。灵菌红素能对抗一系列的癌细胞，如 肺 ， 结肠 ，肾和 乳房 的癌细胞系。灵菌红素 抗癌机制主要如下： 第一，它能在 铜 离子配合下破坏癌细胞的双链 DNA。而癌细胞相比起非癌组织具有较高的铜离子浓度（ 3.5 倍），这 也成为灵菌红素对癌组织具有高针对性的一个基础。灵菌红素在 pH6.8（如乳癌细胞）下表现出最有效的 DNA 破坏作用，而普通细胞的 pH 则为 7.4 左右，这种性质更助长了其抗癌针对性。另外灵菌红素可能可以通过抑制细胞中型拓扑异
5、构酶 I 和 的活性而进一步达到破化 DNA 复制的目的。 第二，灵菌红素可以破化细胞内的 线粒体 ， 高尔基体 和 溶酶体 对细胞质的 pH 梯度， 降低细胞内 ATP 水平。这是由于灵菌红素可以在这些细胞器的膜上起到离子孔（ Ionophore）的作用，而抵消氢氯离子的同向转运。 第三，灵菌红素可以激活细胞内 细胞凋亡 途径。一方面，灵菌红素激活前半胱天冬酶 8（ Pro-Caspase 8），继而启动了细胞内半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。另一方面，它也可以使线粒体释放其细胞凋亡诱导因子（ Apoptosis inducing factor，简称 AIF）而触发非半胱天冬酶依赖的细胞凋亡。除此
6、之外，灵菌红素还会通过一系列诱导或抑制的作用达到抑制 细胞周期 的目的。另外，根据 Zhang, et al.的研究，灵菌红素还可以促进细胞集结，阻止癌细胞对周遭组织的入侵或是 远端转移 。 2. 灵菌红素在环境治理上的应用 在环境治理上，韩国科学家于 1996 年首次在海洋中发现一种微生物，并且在国际学术会议上将它初步定名为 “哈赫拉 ”（ Hahella）。韩国生命工学研究院和韩国海洋研究院的科学家最近从位于朝鲜半岛以南的美罗岛海域再次找到了这种海洋微生物，并将其命名为 “哈赫拉 下济州 ”。韩国科学家对 “哈赫拉 下济州 ”进行了基因组测序分析后发现，这种微生物能产生可以清除赤潮的灵菌红
7、素。将灵菌红素撒在赤潮中，只需十亿分之一的浓度，一小时后就能将导致赤潮的浮游生物大部分杀死。这对治理河湖的富营养化及海里的赤潮，维护地球环境具有非常重要的 意义。目前，韩国科学家已经为灵菌红素申请了韩国和国际专利。灵菌红素有望经过毒性试验和环境影响检测，在 3 年后作为治理赤潮的产品投入应用。 3. 灵菌红素在天然色素方面的应用 3.1 作为天然染料 PG 作为由发酵产生的具有重要生物活性的微生物次级代谢产物，是一类 呈暗红色的天然色素，色泽亮丽诱人 ，有抗菌活性 ，有较好的生物可降解性和环境相容性 ，是一种多功能染料， 在印染、纺织领域， 应用优势相当明显 ， 在高档真丝制品、保健内衣、家纺
8、产品、装饰用品等领域中拥有广阔的发展前景 ， 具有巨大的 商业潜力 。 由于纤维自身结构与染料亲和 力的原因， PG 染腈纶织物的上染率要比染羊毛织物的上染率高，且耐皂洗牢度和摩擦牢度也要比羊毛织物的好 ， 经 A13+媒染剂处理后的羊毛织物的各项牢度均有所改善 。 4 Cang 等 9以沙雷 氏 菌发酵生产的 PG 做抗菌实验，结果表明，对芽孢杆菌具有显著地杀菌作用。钟绵国等 对 灵菌红素羊毛、腈纶染色性能进行研究，确定其最佳染色工艺 。灵菌红素羊毛织物的最佳染色工艺条件为：染料用量 4%（ o.w.f），乙醇：水为 1： 3，浴比 1： 50， pH 值为 7.0，染色温度 80，染色 6
9、0min；灵菌红素腈纶织物的最佳染色工艺条件为：染料用 量 3%（ o.w.f），乙醇：水为 1： 2，浴比 1： 40， pH 为 6.0， 95条件下染色 50min。 并 通过抑菌率的测试 证明灵菌红素具有较好的抗菌性能 4。 3.2 作为食品添加剂 色素是一种食品添加剂，人类最初使用的都是天然色素，但是当合成色素发明之后，天然色素逐渐被所取代。随着毒理学和分析技术的不断发展和人们生活水平的提高，大家对饮食也越来越讲究，人们发现某些合成色素食用过量有致癌的危险，合成色素对人体健康的危害越来越引人注目 ， 因此合成色素作为食品添加剂的用量越来越少 ， 甚至被众多国家禁止使用 。而天然色 素
10、作为食品添加剂具有较高的安全性 ， 无毒、色泽亮丽诱人 ， 尤其是一些天然色素本身就是人们日常饮食的成分 ， 有一定的营养价值和药理保健作用 ， 因此倍受人们的瞩目 。可是天然色素又远不能满足现代食品工业发展的需要，开发新品种的天然色素，对原有的天然色素的生产工艺进行改进，已成为添加剂行业非常迫切的问题。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 1. 研究内容 （ 1）平板抑菌圈法定性探讨灵菌红素对常见细菌的抑菌性 （ 2）考察灵菌红素对常见织物的染色性能，确定其最佳的染色工艺条件 （ 3）通过震荡法测定经灵菌红素染色后织物的抑菌率，进一步考察其抑菌稳定性 2.
11、 试验方法 2.1 灵菌红素的制备 采用本实验室保存的沙雷氏菌，经活化后发酵，待发酵完成后取出发酵液，倒入离心管，摇匀， 0 10000r/min 离心 10min，弃上清液，然后用移液枪移取适量丙酮于离心管中，用枪头搅拌沉淀，使吸附于菌体上的色素完全溶于丙酮中，再在 0 10000r/min 离心 10min，得到灵菌红素丙酮溶液。使用旋转蒸发仪蒸发大部分丙酮，余下自然风干，收集色素并于干燥暗处保存。 2.2 平板抑菌圈法定性测定灵菌红 素对常见微生物的抗菌性能。 待测菌种活化，制成了一定浓度的菌悬液。菌液含量采用分光光度计法及稀释法测定。取 0.1ml 菌悬液 涂布平板，再于平板中央加入经
12、灵菌红素浸泡的滤纸片， 37 1倒置培养24h，记录抑菌圈大小，初步判断抑菌效果。 2.3 灵菌红素对织物染色 取常见的织物真丝，探讨不同的染色条件如染色时间、染色温度、溶剂比例等对染色结果的影响，染色结果用上染率来评定。 2.4 经 灵菌红素染色后织物的抗菌性性。 通过平板抑菌圈法初步判断染色织物的抗菌性，再通过震荡法定量的测定染色织物的抑菌率，考察 其染色织物的抗菌性，为进一步的研究奠定基础。 3.研究难点 （ 1） 红色素作为次级代谢产物，受到多种实验条件的影响，且在提取红色素和菌体时不容易提取完全，给后续实验引入杂菌，干扰结果 （ 2）灵菌红素见光、高温均易分解， 给染色和灭菌造成一定
13、难度，对实验结果造成一定影响。 4. 预期达到的目标 （ 1）灵菌红素对常见细菌的抑菌性强弱 （ 2）灵菌红素对真丝染色时的最佳染色工艺条件 （ 3）经灵菌红素染色后织物的抗菌性能 四、论文详细工作进度和安排 2010.12，任务书下达 2010.12-2011.1，查阅文献，完成 文献综述和外文翻译 2011.1-2011.2，灵菌红素抑菌性能研究 2011.3-2011.4，灵菌红素染色性能研究 2011.4-2011.5，染色后织物的抗菌性能研究 2011.5-2011.6，撰写论文，完成答辩 五、主要参考文献 1 Farzaneh Alihosseini, Kou-San Ju, Jo
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