1、基金项目：南昌市科技支撑计划(课题编号：2010KJZCJH-YYYYLQX-065)。作者简介：饶小勇（1975-） ，男，在读博士，工程师，研究方向为中药制剂技术研究。Tel:0791-87119617,Fax:0791-87119620,E-mail:通讯作者：罗晓健（1960-） ，男，博士，教授，研究方向为中药新剂型和新技术。Tel:0791-87119619,Fax:0791-87119620,E-mail:抗流感口服液提取工艺的筛选与优化饶小勇 1，何双凤 1，吴志鹏 1，黄恺 1，张国松 1，张尧 1，罗晓健 1，2*1. 中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，南昌 33000
2、62. 江西中医学院，南昌 330006摘要：目的 优选抗流感口服液的提取工艺。方法 分别以解热药效和有效成分黄芩苷的转移率为指标，采用药效跟踪和正交试验法同步优选抗流感口服液的最佳提取工艺。结果 确定了最佳提取工艺参数为加 12倍量水，提取 3次，每次 1小时。结论 采用药效跟踪保障了产品有效性，且确定的提取工艺参数稳定、可行、操作性强。关键词： 抗流感口服液；提取工艺；药效；正交试验法；黄芩苷Optimization of Extraction Process of Kangliugan Oral LiquidRAO Xiao-yong 1,HE Shuang-fengg1,WU Zhi-
3、peng 1,HUANG Kai1,ZHANG Guo-song 1,ZHANG Yao, LUO Xiao-jian1,2*(1.NationalPharmaceutical Engineering Center for Solid Preparation in Chinese Herbal Medicine，Nanchang 330006；2.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China)AbstractObjective To optimize extraction procedure o
4、f Kangliugan Oral Liquid. Methods As indicators to antipyretic efficacy and baicalin transferring rate, the extraction procedure of Kangliugan oral Liquid optimized by using orthogonal experiment and pharmacodynamic index. Results The optimum extraction process was adding 12 times amount of water an
5、d extracting for 3 times , 1 hours each time. Conclusion the use of pharmacodynamic tracking ensures the effectiveness of products,the determined parameters of the extraction process are stable, viable and workable.Key words: Kangliugan Oral Liquid, extraction process, pharmacodynamic,orthogonal des
6、ign ,baicalin抗流感处方是治疗风热引起的流行性感冒、临床疗效确切的中药验方，方中由黄芩、柴胡、牛蒡子等六味药材组成，具有清热解毒、利咽的功效，主治风热感冒引起的发热、咽痛、咳嗽等症。本方临床上以汤剂给药，由于传统汤剂存在煎煮携带不方便、口感不佳、贮存不方便、单次服用剂量大、易霉变等缺点，且制备工基金项目：南昌市科技支撑计划(课题编号：2010KJZCJH-YYYYLQX-065)。作者简介：饶小勇（1975-） ，男，在读博士，工程师，研究方向为中药制剂技术研究。Tel:0791-87119617,Fax:0791-87119620,E-mail:通讯作者：罗晓健（1960-） ，
7、男，博士，教授，研究方向为中药新剂型和新技术。Tel:0791-87119619,Fax:0791-87119620,E-mail:艺随意、质量控制指标缺乏，难以保障产品的稳定性和可控性，严重影响了该品种在临床上广泛应用。因此，本文在保障产品有效的前提下，采用现代制剂技术将其研制成安全、有效、可控、方便的中药口服液。现代相关文献报道黄芩苷是方中君药黄芩中的有效成分，具有解热、抗炎、抗病毒作用 1，其含量多少是反映黄芩药材及相关制剂质量重要指标。为此，本文采用药效跟踪及黄芩苷转移率为指标相结合的方法，对抗流感口服液的提取工艺进行考察及优化，通过研究为其研制成口服液奠定基础。1 材料与仪器黄芩、牛
8、蒡子、荆芥、柴胡、桔梗、甘草均购于江西南昌黄庆仁药店, 经江西中医学院冯育林副教授鉴定均符合中国药典 （2010 版一部）中药材标准；黄芩苷（110715-200212，供含量测定用）购于中国药品生物制品检定所；双黄连胶囊（河南天方药业中药有限公司批号：050117） ；SD 大鼠，60 只，雄性，体重150200，均由江西医学院动物实验中心，合格证号：SCXK(赣)2005-0001；酵母菌（法国乐斯福公司，批号：20041222） ；甲醇（色谱纯）山东禹王实业有限公司禹城化工厂；其余试剂均为分析纯。ZNHW型电热套（巩义市予华仪器有限责任公司） ，KQ-250E 型超声波清洗器（昆山市超声
9、仪器有限公司） ，TE612-L 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司） ，Powerlab sp/8 生理记录仪（澳大利亚，Powerlab） ，Agilent HP1100 series高效液相色谱仪，DAD 检测器，Chemstation 化学工作站； AL104/01电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司） 。2 方法与结果2.1 提取溶媒的筛选根据处方的功效为“清热解毒、利咽” ，用于治疗风热引起的发热，因此，选择解热作为其主要药效指标。2.1.1 不同提取溶媒样品的制备根据文献报道，方中君药黄芩的现代药理药效研究表明水提液和醇提液都具有抗菌、抗病毒作用 2、3 。且黄芩药材中的主要
10、有效成分为黄芩苷 4，黄芩苷既可以采用水提也可以采用乙醇提取 5。方中臣药柴胡水提液亦具有解热作用 6，其挥发油也具有抗炎作用。因此，拟进行如下试验：（1）水提法：按方中比例称取药材，加水煎煮 2小时，滤过，浓缩，得供试品液 A。（2）水提法和收集挥发油：按方中比例分别称取药材，取柴胡、荆芥、桔梗加水煎煮，收集挥发油，滤过，滤液备用；药渣与其余药材加水煎煮 2小时，滤过，合并滤液，浓缩，加入挥发油得供试品液 B。（3）分开水提法：按方中比例称取药材，黄芩加水煎煮 2小时，滤过，浓缩，加浓盐酸调 pH34，静置 1小时后，滤过，滤液再于 40调 pH1.52，保温 30分钟，静置，浓缩，得提取物
11、 7，备用；其余柴胡等五味药材加水煎煮 2小时，滤过，浓缩，备用；合并提取物和浓缩液，得供试品液 C。（4）醇提法：按方中比例称取药材，加 60乙醇煎煮 2小时，滤过，浓缩，得供试品液 D。2.1.2 药效供试液配制 取上述供试品液 A、B、C、D 以蒸馏水稀释得其混悬液；阳性药是将双黄连胶囊研成细粉后以蒸馏水制得混悬液；酵母混悬液是将干酵母菌用蒸馏水配成 20%酵母菌混悬液。2.1.3 药效试验方法 A、B、C、D 抗流感各组给药剂量为 16g生药/kg 体重，相当于成人临床用量的12倍，给药浓度为 1.6g生药/ml；双黄连给药剂量为 1.0g生药/kg 体重，相当于成人临床用量的 12倍
12、，给药浓度为 0.1g生药/ml；模型组给予等容量蒸馏水。各组口服灌胃给药容量均为 10ml/kg，其中模型组给予等容量蒸馏水，连续给药三天，每天一次，末次给药后 1h，各组动物背部皮下注射 20的酵母菌溶液 1ml/100g复制发热模型，记录动物造模后 0h，4h、6h、8h、10h、12h 动物体温，并以各时间点体温与 0h的体温差进行分析。结果见表 1。表 1 六种抗流感提取液对干酵母致大鼠发热的影响体温变化（， SD）X组别动物数剂量（g 生药/kg体重） 2h 4h 6h 8h 10h 12h模型组 10 - 1.60.9 2.70.5 2.90.4 2.80.4 2.00.3 0.
13、90.5双黄连组 10 1.0 1.10.4 2.40.4 2.70.7 2.50.8 1.80.8 0.60.3*处方 A 组 10 16 0.90.3 2.10.3 2.40.5 2.20.4 1.30.5 0.40.3*处方 B 组 10 16 0.90.4 2.30.7 2.50.5 2.20.3 1.40.5 0.30.4*处方 C 组 10 16 1.00.4 2.10.3 2.50.3 2.20.2 1.60.6 0.40.3*处方 D 组 10 16 0.90.2 2.60.2 2.80.2 2.60.6 1.80.7 0.50.1*与模型组比较 P0.05 *与模型组比较 P
14、0.01从表 1数据分析可知，干酵母注射后大鼠体温逐渐上升，6 小时后到达高峰，升温 2.90.4，此后缓慢降温，观察至 12小时接近正常体温。连续三天给予双黄连，造模后大鼠体温缓慢升高，与模型组比较体温显著降低（ P0.05） 。结果显示，分别给予抗流感处方 A、B、C、D 的模型大鼠，6 小时后体温均略有升高，但升温幅度低于模型组，与模型组比较均有统计学差异（ P0.05） ，然而与阳性药双黄连比较未见统计学差异。经进一步比较，结果表明抗流感处方 A、B、C 三组之间没有显著性差异，但解热效果为 ACB，且降温效果均优于 D，所以选择制备方法为 A法，即水提法。2.2 指标成分含量测定方法
15、的研究2.2.1 色谱条件与系统适用性试验：大连依利特 Hyperisil ODS2 C18柱(5um，4.6mm250mm)，流动相为甲醇水磷酸(47:53:0.2)，流速为 1.0 mL/ min；柱温：25；检测波长：280nm。2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取在 60减压干燥 4 小时的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每 1ml含 60g 的溶液，即得。 2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取药材煎煮液适量，相当于黄芩生药材约0.003g，置 10ml量瓶中，加 70乙醇至刻度，摇匀，即得。2.2.4 阴性供试品液的制备 取处方中缺黄芩的阴性样品，照供试品溶液制备项下操作，即得阴性供
16、试品液。 2.2.5 干扰性试验 分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液各 10L，按“2.2.1”条色谱条件进行测定，对照品、供试品和阴性对照溶液色谱图分别见图1、2、3。图 1 黄芩苷对照品色谱图图 2 供试品液色谱图图 3 阴性供试品液色谱图2.2.6 标准曲线的制备 取黄芩苷对照品溶液液（0.137mg/ml） ，分别进样1、2、4、8、10、16、20、32、40l。按照上述测定方法测定含量，分别记录黄芩苷的峰面积。以进样量(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标作图并进行线性回归，得回归方程 Y=677.14X-172.47（r=0.9999） ，结果说明黄芩苷对照品在进样量为0.137
17、g5.48g 范围内线性关系良好。2.2.7 精密度试验 取黄芩苷对照品溶液连续进样 6 次，按照上述测定方法测定含量，记录黄芩苷的峰面积，经计算求得 RSD为 0.92% (n=6)。2.2.8 重复性试验 取同一供试品溶液五份，按照上述测定方法测定含量，记录黄芩苷的峰面积。经计算求得其 RSD为 1.44% (n=5)。2.2.9 稳定性试验 取同一份供试品溶液，在 0、2、4、8、12、24h 分别进样10L，记录峰面积，经计算求得其 RSD为 0.88%。2.2.10 加样回收试验 分别取同一批已测定含量的药材煎煮液适量，相当于黄芩生药材约 0.003g，置 10ml量瓶中，分别精密加
18、入一定量的对照品溶液，加 70乙醇至刻度，共 9份，分成三组，分别测定样品中黄芩苷含量，计算平均加样回收率为 99.5%，其 RSD为 0.74% (n=9)。2.3 提取工艺参数的筛选及优化根据预试验可知，影响药材提取的主要因素有加水倍量、煎煮次数、煎煮时间，所以选用 L9(34)正交表进行实验，以提取时间（A）、加水倍量（B）、提取次数（C）为考察因素，进行 3因素 3水平的正交试验，因素水平见表 2。按抗流感的处方比例称取药材 9份，按表 3安排进行实验，以黄芩苷的转移率为指标确定药材煎煮的时间、次数及每次加水倍量，结果见表 3和表 4。表 2 提取正交实验因素因素水平A（时间） B（加
19、水量） C（次数）1 1小时 5倍 12 1.5小时 8倍 23 2小时 12倍 3表 3 正交实验结果试验号 A B C 黄芩苷转移率（%）1 1 8 1 29.232 1 5 2 38.333 1 12 3 79.694 1.5 8 2 50.225 1.5 5 3 69.546 1.5 12 1 48.557 2 8 3 80.788 2 5 1 26.989 2 12 2 72.09 147.25 160.23 104.76 168.31 134.85 160.64 179.85 200.33 230.01R 32.6 65.48 125.25表 4 方差分析方差来源 离差平方和 自由
20、度 方差 F值 P值A 182.162 2 91.081 5.101 .164B 726.643 2 363.321 20.348 .047C 2624.704 2 1312.352 73.500 .013a R Squared = .990 (Adjusted R Squared = .960)由表 3直观分析可知，极差值大小表明影响因素大小为 CBA，说明煎煮次数对指标成分黄芩苷的转移率影响最大、加水量次之、煎煮时间影响最小。根据直观分析可知提取工艺参数以 A3B3C3为较好提取工艺。由表 4方差分析可知，B 和 C因素对提取过程中黄芩苷的转移率具有显著性影响，而 A因素无显著性影响，说明
21、A因素水平值对黄芩苷转移率影响很小。综合表 3和表 4分析可知，A 因素以 1小时水平最好，B 因素以加 12倍量水最好，C 因素以 3次最好，因此，确定最佳的提取工艺参数为 A1B3C3，即为加水 12倍量，提取 3次，每次提取 1小时。2.4 验证实验按照上述确定的制备工艺，进行 3次试验，取滤液分别测定提取液中黄芩苷的含量，并计算黄芩苷的转移率分别为 85.20%、84.81%、86.21%。3 讨论在确保产品安全有效的前提下，拟将临床抗流感复方汤剂研制成口服液，可以有效克服汤剂存在诸多问题，降低患者服用剂量，并进行相关口感的矫味，可以提高患者顺应性。本文通过对其提取工艺进行全面研究，可
22、以有效保障产品质量，提高产品的可控性。本文根据抗流感复方汤药的临床症候，结合方中药物的药效药理相关研究文献资料，以药物对干酵母菌导致的发热大鼠的解热效果为指标筛选了本方的提取溶媒，研究结果表明本方提取液及阳性对照组对造模动物体温有显著降低作用，但两者没有显著差异性，说明本方提取液解热效果与阳性对照药双黄连相当，进而说明本方对解热是有疗效的。此外，实验结果表明采用水和乙醇为溶媒，两者提取液的解热效果没有显著性差异，考虑工业化生产的可行性、有机溶剂生产成本高、污染环境等因素，且以水溶媒符合临床汤剂入药习惯，所以确定采用水为抗流感复方的提取溶媒。黄芩为方中君药，具有解热、抗菌、抗炎、抗病毒等作用，黄
23、芩苷作为黄芩的有效成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌及抗病毒等广泛药理作用，因此以黄芩苷转移率为指标，采用正交试验方法，结合总体分析及方差分析优化抗流感口服液的提取工艺，有效保证制剂满足生产及临床的需要。正交试验结果选用了加水量为最大水平 12倍量，主要考虑方中药材大多为根茎类药材，加水量达到 12倍已能够很好浸没药材，基于工业化生产耗能问题，所以未进一步考察更大于 12倍量的水平。并通过验证实验表明优化的提取工艺稳定、可行、重现性好。参考文献1张曦，李宏，候茂君等.黄芩及其有效成分的药理学研究进展.天津药学，2000，12(4):82史跃杰. 黄芩黄连水煎剂对厌氧菌的体外抑菌活性J.中国实验方剂学杂志, 2011, 17(17):226-227. 3曾超珍,刘志祥,韩磊. 黄芩总黄酮提取技术及其抑菌活性研究J.时珍国医国药, 2009, 20(6): 1342-1343. 4叶定江主编中药炮制学上海科学技术出版社，236-2375 李 韦,杨伟鹏,梁日欣等. 栽培黄芩和野生黄芩抗炎、解热和免疫作用比较研究J. 中国实验方剂学杂志，2009，15(1):29-31. 6肖培根主编新编中药志第 1卷，化学工业出版社，7848097韩会玲，宋小妹，张选军.黄芩苷提取工艺的改进J.陕西中医学院学报，1997，20(4):35-36.
