1、慢性压力负荷性心衰大鼠肾脏细胞凋亡作者：周泉 李志梁 胡高频 王素华 陆青 【关键词】 心力心衰 关键词: 大鼠;心力心衰;缺口末端标记术;肾脏细胞;凋亡 摘 要:目的 了解慢性心脏后负荷增加导致慢性心力衰竭时肾脏细胞凋亡的情况，探讨慢性心脏后负荷增加及引起慢性心力衰竭时影响肾脏功能不全的机制. 方法 复制慢性后负荷增加引起心力衰竭大鼠（n=24）模型，检测血液动力学（BP，LVSP）变化，应用末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测肾脏细胞凋亡. 结果 对照组大鼠肾脏及慢性后负荷增加早期肾脏均未出现细胞凋亡，心力衰竭时肾脏出现细胞凋亡，细胞凋亡程度肾髓质（36-ND）肾近曲小管（17
2、-ND）肾小球（6-ND） ，肾血管平滑肌细胞及致密斑亦出现细胞凋亡. 结论 慢性后负荷增加引起心力衰竭时肾脏出现细胞凋亡，它与慢性心力衰竭密切相关，是肾功能不全的重要原因. Keywords:rat;heart failure;TUNEL;renal cells;apoptosis Abstract:AIM To observe renal cells apoptosis in chronic heart failure which resulted from the chronic excessive heart post-load.To study the molecular mecha
3、nism of renal failure in chronic heart failure resulting from the excessive post-load.METHODS The models of chronic heart failure which resulted from chronic excessive post-load were made in rats（n=24）.The change of blood dynamics was detected.The presence of apoptotic renal cells was demonstrated b
4、y the method of terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling（TUNEL）.RESULTS The pres-ence of apoptotic renal cells was not demonstrated in the con-trol groups and the early stage of chronic excessive post-load，and was demonstrated in chronic heart failure groups.The degree o
5、f renal medullas apoptosis（36-ND）was highest.The degree of renal juxtaglomerular tubules apoptosis（17-ND）was lower;the degree of glomerulus（6-ND）was low-est.The apoptotic renal vascular smooth muscle cells and apoptotic macula densa were also present.CONCLUSION Renal apoptosis is demonstrated when e
6、xcessive post-load re-sults in chronic heart failure，and is closely related with chronic heart failure，so is an important cause of renal fail-ure. 0 引言 细胞凋亡（apoptosis） ，是一种细胞死亡的特殊形式1 .慢性压力负荷增加所至心力衰竭是否可引起肾脏细胞凋亡未见报道.我们研究慢性心脏后负荷增加引起心功能不全时大鼠肾脏细胞凋亡的情况，探索其之间的相关性. 1 材料和方法 1.1 材料 NSA- 型医学信号处理系统（南京隆海科技公司产品）;
7、PE50 动脉测压导管（美国 Becton Dickinson 公司产品）;凋亡检测试剂盒（美国 Oncor 公司产品）;胰蛋白酶（德国 Merck 公司产品）;DAB 显色液（Sigma 公司产品）;多聚赖氨酸（武汉博士德生物工程有限公司产品）.体质量（22020）g，雄性 SD 大鼠 24 只（第一军医大学动物实验中心提供）. 1.2 方法 将大鼠随机分为手术组（ n=12）和假手术组（n=12）.两组大鼠各 6 只，分别在 10wk 与 18wk 留取肾脏标本.戊巴比妥钠 60mg kg-1 ip 麻醉.手术组（n=12）在左肾动脉下方 0.5cm 处游离腹主动脉，将去尖 7 号针头与游
8、离的腹主动脉并行后用粗丝线一起结扎阻断血流，迅速抽出针头见远端动脉充盈后缝合腹腔2 .假手术组（n=12）除未缩窄腹主动脉外其余同手术组（Fig1）. 图 1 手术缩窄大鼠腹主动脉示意图 略 两组大鼠分别在手术后 10，18wk 分离右或左侧颈总动脉，插入 PE50 管，将导管沿动脉送入主动脉，接通三通管，接压力传感器联于生理记录仪（南京隆海科技公司产品） ，测量记录血压（BP） 、左心室收缩压（LVSP）曲线.10wk 时手术组（n=6）及假手术组（n=6）在测定大鼠BP，LVSP 后，剪破右心房，经右侧颈总动脉快速推注生理盐水 120mL，再快速推注 40g L-1 多聚甲醛 150mL
9、后缓慢滴注 40g L-1 多聚甲醛400mL，整个灌注持续 2h.灌注完取出肾脏，每隔 5mm 纵截面切取肾脏.置 440g L-1 多聚甲醛后固定 412h.常规脱水石蜡包埋.标本制成4m 切片.18wk 时手术组（n=6）及假手术组（n=6）在测定 BP，LVSP 后，留取标本方法及标本制作方法同上2，3 .原位检测细胞凋亡采用Apop Taq 试剂盒原位检测细胞凋亡.其原理为:胰蛋白酶消化，末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT）将地高辛标记的核苷酸催化结合到目标 DNA 末端，过氧化酶连接的抗地高辛抗体再与被标记的地高辛结合，经过过氧化酶底物（DAB）使凋亡的细胞显色.光镜下细胞核有棕色颗
10、粒为阳性细胞4 . 统计学处理:心功能检测数据均以 x s 表示，采用 t 检验判定差异显著性.凋亡细胞用 Cambridge Quantimet970 型图像分析仪，在光镜1020 倍视野下测量:肾脏凋亡细胞核的密度数-ND（视野凋亡细胞数/视野细胞数） ，多组间比较用方差分析 q 检验.所有数据使用 SPSS8.0 统计软件处理. 2 结果 2.1 血液动力学变化 实验中观察 10wk 手术组大鼠血压明显增高，18wk 手术组大鼠（大鼠心力衰竭判断根据 1991 年 Conrad 等制定的标准）5 均出现毛 发无光泽、活动能力下降、眼睑分泌物增多、体质量增加及不同程度的呼吸急促（5/6）
11、、四肢及口唇发绀（5/6） ，18wk 手术组大鼠出现典型的慢性心功能不全的血流动力学变化（Tab1）. 表 1 大鼠血液动力学变化 略 2.2 肾脏细胞凋亡 HE 染色各期假手术组大鼠心脏结构完整、清晰，心肌细胞排列整齐，18wk 手术组大鼠心肌纤维排列紊乱，细胞增大，间质纤维增生，心肌纤维有断裂现象.10wk 手术组及各时期假手术组大鼠肾脏未出现细胞凋亡，18wk 手术组大鼠肾脏出现较多的凋亡细胞，凋亡的细胞肾髓质（36-ND）肾近曲小管（17-ND）肾小球（6-ND） ，肾皮质小血管平滑肌细胞及致密斑亦见细胞凋亡（Fig2）. 3 讨论 实验大鼠在慢性压力负荷增高的早期，肾脏均未出现细胞
12、凋亡，当出现心功能不全时，肾脏髓质及皮质、肾血管平滑肌细胞和致密斑均出现了细胞凋亡.慢性压力负荷增高引起心功能不全时肾脏细胞凋亡的机制尚不清楚，分析原因:高血压与肾脏损害确有一定的相关性，但诸多因素相互作用;慢性心功能不全时血液中血管紧张素（Ang） ，Ang受体、ACE 活性均升高，RAS 中 Ang可调节肾入球及出球小动脉不同程度收缩，增加肾小球内压力，通过压力负荷影响细胞凋亡;RAS 中 Ang直接作用于血管平滑肌细胞（VSMC） 、肾脏系膜细胞及肾小管上皮细胞，刺激细胞外基质（ECM） ，增加细胞凋亡;Ang及 ACE 活性增高的同时，血中一氧化氮（NO）降低，Ang/NO 比例增高，
13、引起肾脏细胞凋亡及肾血管平滑肌的细胞凋亡4，6，7 ;慢性心功能不全时血液中表皮生长因子（EGF） ，胰岛素样生长因子-1（IGF-1） ，白介素-1（IL-1） ，白介素-6（IL-6） ，内皮素等生物活性因子增加，促使肾脏细胞凋亡8 ;心力衰竭后部分生长因子、细胞因子活性的变化亦能增加肾脏细胞的凋亡;肾脏髓质细胞凋亡多于皮质因慢性心功能不全时血液中氧含量降低，并且心衰时肾皮质及髓质血流重新分布，使肾髓质分布的血流减少.Ang在肾髓质的密度是皮质的 45 倍，更易促使肾髓质细胞凋亡;慢性心功能不全时因血液中缺氧及钠离子的变化，促使肾脏致密斑细胞肥大、合成、分泌大量的肾素，血液中肾素-血管紧张
14、素-醛固酮系统的过度激活反过来抑制致密斑细胞，促使致密斑细胞凋亡.结论:慢性后负荷增加心力衰竭时肾脏出现较多的细胞凋亡，其与慢性心力衰竭密切相关，肾细胞凋亡是肾功能不全的重要原因之一. 图 2 手术组大鼠肾脏 略 参考文献: 1Bartling B，Milting H，Schumann H.Myocardial gene expres-sion of regulators of myocyte apoptosis and myocyte calcium homeostasis during hemodynamic unloading by ventricular assist devices
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