1、本科毕业论文系列开题报告水产养殖诺卡氏菌感染对乌鳢主要非特异性免疫指标的影响一、选题的背景与意义乌鳢OPHICEPHALUSARGUS属鲈形目PERCIFORMES、鳢科OPHIOCEPHALIDAE、鳢属CHANN，俗名黑鱼、乌鱼。其肉质鲜美，骨刺少，营养丰富，经济价值高，具有去瘀、生新、补血、调养的功用。乌鳢是典型的肉食性鱼类，适应性强,在缺氧情况下，能借助鳃上器直接从空气中吸收氧，在水少的潮湿淤泥中能生活相当长时间，冬季进行蛰居生活，疾病少,生长快,容易从自然界得到苗种,有利于人工养殖。但是，随着乌鳢人工养殖规模的不断扩大，乌鳢病害也日益严重。特别是近年来在浙江萧山及绍兴一带,频现一种养
2、殖乌鳢大规模死亡的暴发性疾病，现已证实这种疾病系由鰤鱼诺卡氏菌NACARDIASERIOLEA引起的（王国良等2008）。诺卡氏菌NOCARDIA在分类学上属于放线菌目，是一种革兰氏阳性丝状杆菌。广泛分布在土壤、活性污泥、水、动植物和人的组织中，以腐生为主，一些菌株是人和动物的机会致病菌。在水产养殖中，首例报道诺卡氏菌病的是虹彩脂鱼（HYPHESSOBRYCONINNESI），以后陆续发生在虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS）、黄尾鰤（SERIOLALALANDI）、乌鳢、太平洋牡蛎（CRASSOSTREATHUNBERG）、大口鲈（MICROPTERUSSALMOIDES）、海鲈（LA
3、TEOLABRAXJAPONICUS）和大黄鱼（PSEUDOSCIAENACROCEA）等水产养殖动物中。我国鱼类诺卡氏菌病的研究是从2005年，王国良等首次在浙江沿海网箱养殖大黄鱼发现了诺卡氏菌病开始的。以后逐渐有其它鱼类诺卡氏菌病的报道。如2006年广东省佛山市顺德区某淡水养殖场发现乌鳢结节病，经鉴定病原为诺卡氏菌，该病发病持续时间较长，发病率达80，死亡率达50；2009年王国良等报道浙江萧山、绍兴乌鳢养殖场发生诺卡氏菌病，造成巨大经济损失；浙江省桐乡市大麻镇水产养殖示范园区共有乌鳢连片养殖池1155亩，在2005年的养殖生产中，乌鳢发病面积687亩，发病率595，死亡率36，总损失10
4、57万元，平均亩损失9145元。但是，由于该病是近几年发现的鱼类新疾病，所以目前国内有关于该病的研究资料较少（常藕琴2008，王国良等2009）。近年来鱼类病害发生频繁,其中某些疾病给水产养殖业造成了灾难性的危害，这就使得免疫防治技术在鱼病防治中呈现出日趋广阔的应用前景。因此，对鱼类特别是重要的经济鱼类免疫系统的研究受到国内外学者的广泛关注。鱼类的免疫系统是鱼体执行免疫功能的机构，是产生免疫应答的物质基础，由免疫器官、免疫细胞和体液免疫因子组成。与高等脊椎动物一样，鱼类也是通过免疫系统来抵御外来病原生物的侵害，通过非特异性和特异性的免疫防御机制来维持机体的正常功能及自身内环境的稳定。非特异性免
5、疫可以在微生物入侵时立即发生作用,有效地清除、降解病原微生物和其他有害物质,而此时抗体尚未产生,因而是鱼类抵抗感染的第一道防线。目前，关于鱼类非特异性免疫方面的研究主要集中在饲料添加剂对鱼类非特异免疫功能的影响、药物（如免疫增强剂）对鱼类非特异性免疫功能的影响。如刘华忠（2004）证明了添加10和15的复方中草药的配合饲料均能显著提高鱼体的非特异性免疫能力；刘云等（2004）报道了免疫增强剂可以提高鲫鱼血液中白细胞数量和吞噬细胞的吞噬能力,增强鲫鱼血清中酚氧化酶的活力,对鲫鱼的生长无明显影响。本实验通过对乌鳢人工感染诺卡氏菌，研究其非特异性免疫指标的变化，为乌鳢诺卡氏菌病的防治提供理论参考。二
6、、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究基本内容1诺卡氏菌对乌鳢的人工感染实验。2健康和感染乌鳢血细胞密度、数量、脆性、血清免疫酶类、溶菌酶活力等主要非特异性免疫指标的测定与分析。拟解决的主要问题1样品的采集与处理。2非特异性免疫指标测定方法的建立。三、研究的方法与技术路线研究的方法1试验用鱼乌鳢2实验用菌鰤鱼诺卡氏菌3试剂与药品白细胞稀释液（冰醋酸15ML、1龙胆紫1ML、蒸馏水975ML）、溶壁微球菌MICROCROCOCCUSLYSODEIKTICUS、红细胞稀释液（NACL05G、硫酸钠25G、氯化汞025G、蒸馏水加至100ML）、溶壁微球菌营养琼脂培养基（牛肉浸膏15G,蛋白胨25G
7、,NACL40G,琼脂75G,蒸馏水500ML,PH74）、肝素钠抗凝剂（抗凝剂葡萄糖20G/L，柠檬酸钠8G/L，EDTA336G/L，土温80100L/L）、丙酮、乙醚。4主要仪器离心机，显微镜，冷冻机，全自动生化分析仪等。5实验方法51诺卡氏菌悬液的制备菌株在TSA斜面上28培养7D后,用无菌生理盐水洗下菌苔,稀释成所需浓度的菌悬液平板倾注法计算菌悬液浓度。52溶壁微球菌粉末的制备将溶壁微球菌涂布于营养琼脂上,28下培养过夜,用无菌重蒸水将溶壁微球菌菌落从营养琼脂平板上洗下来,2500R/MIN离心15MIN,去上清,用4ML丙酮洗涤后,2500R/MIN离心3MIN,去上清,重复2次,
8、再用4ML乙醚洗涤,2500R/MIN离心3MIN,重复1次,把溶壁微球菌从离心管中取出,放到研钵中,于28下干燥3H,把结块的细菌磨成粉末分装到小离心管中,4下保存备用。53人工感染试验试验分对照组和感染组，每组50尾鱼，以腹腔注射的方式使乌鳢感染诺卡氏菌。对照组每尾鱼注射03ML无菌生理盐水，实验组每尾鱼注射03ML菌悬液。注射后分别于24H、48H、72H、96H、120H、144H、168H时尾静脉取血液样本，每时间点每组取5尾鱼，实验重复2次。54血清、血细胞及白细胞的收集将乌鳢尾静脉采血后,一部分直接加至离心管中4静置过夜,吸出血清后3000R/MIN离心,用于溶菌酶和血清免疫酶类
9、的测定。另一部分用无菌肝素钠抗凝,用于白细胞数量以及血细胞脆性的测定。55主要非特异性免疫指标的测定肝素抗凝后的血液用于测定血细胞密度、数量、脆性等生理指标，不抗凝血置离心管中4静置过夜，吸出血清后3000R/MIN离心，用于溶菌酶等生化指标和血清免疫酶类的测定。551血细胞密度、数量的测定按NEUBUER氏改良方法进行。552血细胞脆性的测定采用氯化钠浓度梯度法（杨秀平2004）测定。553溶菌酶活力的测定根据简纪常（简纪常2002）的方法进行。用0067MOL/LPBSPH64将溶壁微球菌配成02MG/ML的菌悬液,每个样品取3ML菌悬液,吸取40L血清加入到3ML菌悬液中,混匀后立刻在5
10、40NM下测定A0值。然后在28水浴中温浴30MIN,取出后置于4冰浴中以终止反应,再测定A值,按公式计算溶菌酶的活力UA0A/A。554血清酶类的测定碱性磷酸酶AKP、酸性磷酸酶ACP、过氧化物酶POD的测定在生化自动分析仪上完成，具体方法根据说明书进行。6数据处理与分析利用统计软件SPSS130对试验结果进行分析。每个样品进行3次平行测试取平均值，所有数据分析均采用单因素方差分析ONEFACTORANALYSISOFVARIANCE和DUNCAN检验法。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年1月2010年4月1实验前的准备工作查找资料，写开题报告和论文综述；2仪器、药品的准备和各种实验
11、材料的准备。2010年5月2010年12月氯化钠浓度梯度法测定血细胞脆性在感染后24H、48H、72H、96H、120H、144H、168H等时间点取样NEUBUER氏改良方法测定血细胞数量、密度根据简纪常的方法测定溶菌酶活力数据处理与分析腹腔注射诺卡氏菌悬液购得健康乌鳢（成体），暂养生化自动分析仪测定血清酶类（ACP、AKP等）活力撰写论文论文答辩查找资料，写开题报告和综述综述仪器、药品的购买和各种实验材料的准备1诺卡氏菌对乌鳢的人工感染实验；2健康和感染乌鳢血细胞密度、数量、脆性、血清免疫酶类、溶菌酶活力等主要非特异性免疫指标的测定与分析；3根据所得的实验数据进行数据处理与分析；4翻译外文
12、文献。2011年1月2011年4月1、补充相关数据；2、撰写论文初稿；3、论文定稿，论文答辩。五、主要参考文献1蔡中华,陈成勋,邢克智,等四种中药对鲤鱼非特异性免疫功能的影响J天津农学院学报,1998,231342常藕琴,石存斌,潘厚军,等乌鳢诺卡氏菌病的组织病理学J水产学报,2008,22092163杜佳垠鱼类诺卡氏菌病危害状况与研究进展J北京水产,2007,527314冯守明,金万昆,李军,等4种养殖鱼类非特异性免疫能力的比较研究J水利渔业,2008,458595简纪常,吴灶和中草药对建鲤非特异性免疫功能的影响J大连水产学院学报,2002,1721141176靳晓敏,吴垠,孙鹏,等两种菊酯
13、类农药对鲤血细胞的影响J河北农业大学学报,2006,284877李进村,刘建国乌鳢腹水病的综合防治J科学养鱼,2005,458598林明敏,李美玉,刘浩民,等石鲽血液学指标的测定和血细胞特点J青岛农业大学学报自然科学版,2008,21091129刘华忠,刘定忠,赵学明复方中草药对彭泽鲫非特异性免疫功能的影响J淡水渔业,2004,3313210刘云,孙峰,王丹免疫增强剂对鲫鱼非特异性免疫功能的影响J海洋科学,2004,9424511龙华水生动物10种非特异性免疫分子的研究进展J长江大学学报自然科学版,2005,11677212聂品鱼类非特异性免疫研究的新进展J水产学报,1997,1697313牛
14、红军乌鳢疾病的诊断与防治上J科学养鱼,2007,55714钱云霞,王国良,邵健忠鱼类的非特异性免疫调节J宁波大学学报理工版,2000,1959915孙峰,张煜,李立德,等感染嗜水气单胞菌对鲫鱼非特异性免疫功能的影响J中国海洋大学学报自然科学版,2005,581581816唐玫,马广智,徐军鱼类免疫学研究进展J免疫学杂志,2002,311211617王国良,徐益军,金珊乌鳢致病诺卡氏菌的鉴定及系统发育分析J水产学报,2008,344945418王国良,徐益军,金珊,等养殖乌鳢诺卡氏菌病及其病原研究J水生生物学报,2009,227728319王国良,袁思平,金珊网箱养殖大黄鱼诺卡氏菌病的初步研究J
15、水产学报,2006,110310720王亚楠,孔晓瑜,史成银鱼类抗病毒非特异性免疫机制研究进展J动物医学进展,2008,59910321王有基,胡梦红,朱焕青,等光合细菌对鲤鱼非特异性免疫功能的影响J水利渔业,2005,6383922徐益军,王国良,金珊养殖乌鳢新病害诺卡氏菌病J中国水产,2007,3626323杨秀平动物生理学实验M北京高等教育出版社,2004,282924殷海成酵母免疫多糖对黄河鲤鱼生长和非特异性免疫力的影响J粮食与饲料工业,2009,6383925袁思平,王国良,金珊养殖鱼类致病诺卡氏菌研究进展J微生物学通报,2006,213714126周国勤,杜宣,吴伟纳豆芽孢杆菌对鱼
16、类非特异性免疫功能的影响J水利渔业,2006,110110327左瑞华山区小池塘乌鳢的高密度养殖技术J安徽农学通报,2001,65728ROBERTSML,DAVIESSJ,PULSFORDALTHEINFLUENCEOFASCORBICACIDVITAMINCONNONSPECIFICIMMUNITYINTHETURBOTSCOPHTHALMUSMAXIMUSLJFISHTHEACTIVITIESOFLYSOZYME,SERUMTOTALPROTEIN,BLOODUREANITROGENANDALKALINEPHOSPHATASEHAVEDECREASESINASHORTTIME,THENG
17、RADUALLYINCREASED,ANDSIGNIFICANTDIFFERENCESP005；12H时骤然增加,与对照组出现显著差异；随后酶活性逐步下降。此外陆宏达也证实患上皮瘤病异育银鲫的碱性磷酸酶活力有所提高35。47致病菌感染对鱼类尿素氮（BUN）的影响丁立云报道血浆尿素氮浓度可以较准确地反映动物体内蛋白质代谢和氨基酸之间的平衡状况,较低的血浆尿素氮浓度表明氨基酸平衡好,机体蛋白质合成率较高36。鱼类血清中尿素氮浓度的降低,意味着蛋白质分解速度降低,蛋白质合成速度增大37。本实验在乌鳢感染诺卡氏菌3D，6D后无显著性差异，9D，12D骤然升高与对照组存在显著性差异，然后回复正常。尿素氮
18、浓度的升高表明蛋白质合成速度减慢，与图5血清白蛋白的实验结果相符。刘彦等在鳗弧菌感染牙鲆实验中也得到类似的结论38。48致病菌感染对鱼类乳酸脱氢酶（LDH）和乳酸脱氢酶同工酶1（LDH1）的影响乳酸脱氢酶是机体能量代谢中参与糖酵解的一种重要酶39,当机体组织器官发生病变时,组织器官本身的乳酸脱氢酶会发生变化,同时也可引起血液中乳酸脱氢酶改变,若血液中乳酸脱氢酶发生改变则预示着肝脏、肾脏和肌肉等组织细胞结构发生改变,受到损伤,这些指标在评价鱼类健康方面具有重大意义40。徐晓津等证实大黄鱼在感染哈维氏弧菌引起鱼肌纤维发生损伤、坏死，鱼体的肌肉组织发生代谢障碍，产生病变进而使乳酸脱氢酶活力显著增加2
19、0。参考文献1靳晓敏,葛慕湘,孔凡里,等乌鳢血液指标的研究J河北渔业,2006,221242王国良,徐益军,金珊,等养殖乌鳢诺卡氏菌病及其病原研究J水生生物学报,2009,3322772833VALDEZIE,CONROYDATHESTUDYOFATUBERCULOSISLIKECONDITIONINNEONTETRASHYPHESSOBRYCONINNESSICHARACTERISTICSOFTHEBACTERIUMISOLATEDJMICROBIOLOGIAESPANOLA,1963,162492534FRIEDMANCSNOCARDIACRASSOSTREAESPNOV,THECAUSA
20、LAGENTOFNOCARDIOSISINPACIFICOYSTERSJINTJSYSTBACTERIOL,1998,4812372465BRANSDENMP,CARSONJ,MUNDAYBL,ETALNOCARDIOSISINTANKREAREDATLANTICSALMON,SALMOSALARLJJOURNALOFFISHDISEASES,2000,23183856SNIESZKOSF,BULLOCKGL,DUNBARCE,ETALNOCARDIALINFECTIONINHATCHERYREAREDFINGERLINGRAINBOWTROUTSALMOGAIRDNERIJNOTES,196
21、4,8861801817王国良,袁思平,金珊网箱养殖大黄鱼诺卡氏菌病的初步研究J水产学报,2006,3011031078徐益军,王国良,金珊养殖乌鳢新病害诺卡氏菌病J中国水产,2007,362639聂品鱼类非特异性免疫研究的新进展J水产学报,1997,211697310钱云霞,王国良,邵健忠鱼类的非特异性免疫调节J宁波大学学报理工版,2000,131959911ROBERTSML,DAVIESSJ,PULSFORDALTHEINFLUENCEOFASCORBICACIDVITAMINCONNONSPECIFICIMMUNITYINTHETURBOTSCOPHTHALMUSMAXIMUSLJFI
22、SHANDSHELLFISHIMMUNOLOGY,1995,51273812周立斌,王安利,张伟,等饲料维生素E含量对美国红鱼生长和非特异性免疫的影响J渔业科学进展,2009,301485313JIANJC,WUZHINFLUENCESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEONNONSPECIFICIMMUNITYOFJIANCARPCYPRINUSCARPIOVARJIANJFISHANDSHELLFISHIMMUNOLOGY,2004,1618519114孙峰,张煜,李立德,等感染嗜水气单胞菌对鲫鱼非特异性免疫功能的影响J中国海洋大学学报自然科学版,2005,355815
23、81815陈寅儿,金珊,王国良鲈鱼溶藻弧菌病的血液生理生化指标研究J台湾海峡,2005,24110410816桂远明水产动物机能学实验M北京中国农业出版社,200412817117杨秀平动物生理学实验M北京高等教育出版社,2004,282918简纪常,吴灶和中草药对建鲤非特异性免疫功能的影响J大连水产学院学报,2002,17211411919魏东,董少杰,孙向军,等洞病地图鱼与正常地图鱼血液生理指标比较研究J安徽农业科学,2010,3894618462020徐晓津,徐斌,王军,等大黄鱼感染哈维氏弧菌后血液生化指标的变化及组织病理学观察J水产学报,2010,34461862521金珊,王国良,赵
24、青松,等鲈细菌性类结节病的病原及血液病理研究J水产学报,2004,28670370822苏时萍,李延璐假单胞菌对鳜鱼血液指标的影响J生物学杂志,2007,243363823葛慕湘,杨培培,张文香,等嗜水气单胞菌对鲤鱼血液指标的影响J河北渔业,2006,1081024马骞,洪婧妮,蒋秋芬等哈维氏弧菌对条纹斑竹鲨4种酶活性的影响J台湾海峡,2010,29219620425孙虎山,李光友大肠杆菌感染后栉孔扇贝血淋巴中8种酶活力的变化J海洋科学,1999,5404426王文博,李爱华环境胁迫对鱼类免疫系统影响的研究概况J水产学报,2002,26436837327郭松林,关瑞章,冯建军嗜水气单胞菌感染对
25、美洲鳗鲡血液和生化指标的影响J集美大学学报自然科学版,2010,152939728金珊,王国良,赵青松加州鲈白云病的病原及血液病理的初步研究J水生生物学报,2005,29218418829王忠民,李治勋,王先科鲤鱼健康鱼与暴发性疫病病鱼血清分析J科学养鱼,2010,114330乔伟亮,魏东,齐红莉,等真鲷血液生理生化指标的研究乔J畜牧与饲料科学,2010,315626431黄林,金丽,张耀光患肌肉溃烂病中华倒刺鲃血清生化指标变化J淡水渔业,2009,395677032REGOSTC，ARZELJ，KAUSHIKSJPARTIALORTOTALREPLACEMENTOFFISHMEALBYCOR
26、NGLUTENMEALINDIETFORTURBOT（PSETTAMAXIMA）JAQUACULTURE,1999,18019911733刘颖,乔伟亮,魏东黑鲷血清生化指标研究J现代农业科技,2010,1630731234宋欣,张丽岩,高玮玮,等鳗弧菌VIBRIOANGUILLARUM侵染对青蛤CYCLINASINENSIS磷酸酶活性的影响J海洋与湖沼,2010,41211411935陆宏达,张连义,王建国,等患上皮瘤病异育银鲫几种免疫相关酶活性的变化J大连海洋大学报,2010,250434334736丁立云,孙丽慧,帅继祥,等饲料蛋白水平对星斑川鲽幼鱼生长、体组成及血浆生化指标的影响J中国水产科学,2010,1761285129237吴莉芳,王洪鹤,秦贵信,等大豆蛋白对草鱼肠道组织及血液主要生化指标的影响J西北农林科技大学学报自然科学版,2010,382253038刘彦,李健,王群,等鳗弧菌感染牙鲆药物代谢动力学模型的初步建立J海洋水产研究,2007,282768339成嘉,符贵红,刘芳,等重金属铅对鲫鱼乳酸脱氢酶和过氧化氢酶活性的影响J生命科学研究,2006,10437237640毛瑞鑫,刘福军,张晓峰,等鲤鱼乳酸脱氢酶活性的QTL检测J遗传,2009,314407411
