1、2本科毕业论文系列开题报告生物技术梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP70表达分析一、选题的背景与意义梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI，在日本，又名妃新贝尼登虫是单殖目、分室科、新贝尼登虫属生物，世界上广为分布，在我国，广泛寄生于南方海水网箱养殖的名贵经济鱼类如大黄鱼、高体鰤、石斑鱼和鲷科鱼类的体表、眼眶或鼻腔等处。温度较高时，此寄生虫快速繁殖生长，易使上述感染对象患上夏秋季综合症，鱼类受感染的数量和程度都很大，受到感染的鱼极为难受，不停游动或擦网，寄生虫会破坏鱼类的表面粘液组织，诱发细菌和寄生纤毛虫感染，从而导致体表导致渔区网箱养殖鱼类大批死亡。特别是近年来频繁出现在我国东南
2、沿海一带的新贝尼登虫病，其带来的影响十分严重，不仅会危及到我国东南沿海水产养殖业的发展，同时，当地大量鱼类的受害会间接导致与之相关的生物圈发生巨大的变化，甚至有可能导致生态失衡。热休克蛋白HEATSHOCKPROTEINS,HSPS又称为应激蛋白，是在细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应激蛋白质。它是生物细胞在受热、生物应激、理化因素等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白。目前已发现在环境胁迫因子如高温、重金属和微生物感染等的刺激下，其表达量显著增加。许多热休克蛋白具有分子伴侣的性质，因此HSP是一些在进化上非常保守的蛋白质家族。依蛋白质
3、分子大小，可以将热休克蛋白分为五类，即HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白SMHSP。HSP70蛋白质家族是其中功能上较广的一种，也是被研究的最为深入的一种HSP蛋白。它不仅能够在热胁迫下表达，而且几乎是所有活体细胞中的重要成分。HSP70家族作为分子伴侣在许多生物学过程中起到了重要作用。因此，研究HSP70家族及其系统的功能结构十分重要。由于HSP在进化过程中的高度保守性，作为一种有效的分子标记，不少学者通过HSP序列分析研究分子流行病和系统进化之间的关系。本课题通过提取梅氏新贝尼登虫的RNA，使用PCR技术获取其HSP70序列，并分析其表达和功能表征，从而研
4、究不同发育阶段梅氏新贝尼登虫的HSP70的表达，为进一步探究HSP70在动物体内的功能和防治此类病虫害的方法提供理论基础，同时构建出来的进化树可以用于2比较分析不同物种的HSP70氨基酸序列特征，以期为这些鱼类的抗逆、应激效应的深入研究提供依据。二、本课题研究的内容与拟解决的主要问题研究的内容本课题主要研究的是1梅氏新贝尼登虫成虫、虫卵和钩毛蚴三个发育阶段样品的获得和保存；2提取各个发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA；3通过随机测序方法得到HSP70的基因序列；4对获得的HSP70序列进行分析，而后进行进化树的构建、分析；5采用荧光定量PCR，检测三个不同发育阶段的梅氏新贝尼登虫的HSP70的表达
5、差异。拟解决的问题1获取不同发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA2获得梅氏新贝尼登虫的HSP70的CDNA序列3梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP70表达分析及进化树分析三、研究的方法与技术路线研究方法1梅氏新贝尼登虫样品的收集本次课题中的实验用虫采自宁波象山黄避岙三个发育阶段的虫体成虫采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，咸淡水浸泡病鱼后，用镊子小心取下体表成虫，暂养于过滤海水中至肠道内含物排空，过滤海水冲洗虫体粘液后置于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。虫卵采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，回流过滤器过夜抽滤，抽滤物经镜检观察分离出虫卵，
6、过滤海水浸洗后置于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。钩毛蚴将上述方法收集的虫卵放入盛有新鲜过滤海水的培养皿中，置于25人工智能2气候箱中培养，每天镜检观察虫卵发育情况并更换新鲜过滤海水，约46天钩毛蚴逸出后收集于EPPENDOFF管中，液氮速冻，70C冰箱保存备用。2）RNA抽提并纯化从已采集的样本中提取各发育阶段的RNA利用RNAISO试剂提取上述样本中提取RNA1将100MG70保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1MLRNAISO组织以下为加入1MLTRIZOL试剂标准。2研磨后转入15MLEPPENDORF管中，剧烈振荡混匀，室温放置5MIN。4，12000RPM
7、离心5MIN。3取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15S，充分混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。4底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新的离心管注意不要吸入蛋白层，加入05ML氯仿于上清，振荡混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。5将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10MIN。412000RPM离心10MIN，去上清。6加入DEPC水配制的体积分数75乙醇1ML，振摇，洗涤沉淀。412000RPM离心5MIN。重复步骤6一次，以彻底将盐份除净。7去上清，真空干
8、燥，用DEPC水溶解。注意所有待用的非TRIS的试剂用01DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用01DEPC水处理过夜后121高压灭菌20MIN。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以免RNA降解。8RNA样品OD值检测。取1LRNA溶液加入到69LDEPC处理水中，用紫外分光光度计测定230NM、260NM和280NM的OD值。RNA浓度OD260核酸稀释倍数40/1000G/L去除蛋白指标OD260/OD28018去除盐分指标OD260/OD230209RNA电泳检测。取5LRNA样品加4LDEPC处理水和1L10BUFFER凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳。10MRNA纯
9、化采用OLIGOTEXDT30进行纯化。3基因克隆与随机测序在提取梅氏新贝尼登虫RNA后，用OLIGOTEXDT30纯化MRNA，以其为模板，采2用CDNALIBRARYCONSTRUCTIONKIT构建梅氏新贝尼登虫CDNA文库，具体方法参照厂家说明。随机挑选一些克隆，部分测序并经BLASTP（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/）分析，测通与已知物种HSP70基因序列相似的插入片段克隆。4荧光定量PCR采用实时荧光定量PCRREALTIMEFLUORESCENTQUANTITATIVEPCR，QRTPCR来检测梅氏新贝尼登虫HSP70的表达差异。1利用已提取的RNA序列
10、，进行第一链CDNA合成。25LPCR的反应体系包括SYBRPREMIXEXTAQ2缓冲液125L，引物各1L，模板05L。扩增反应在STRATAGENEMX3000P荧光定量PCR仪上进行，程序为94180S1个循环2进入扩增阶段，共40个循环，每一循环包括9430S，5830S，7230S。PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，以确保特异性扩增，条件是9430S，7260S，9530S1个循环。为保证PCR结果的准确性，每一个样品重复分析3次，包括目标基因HEPCIDIN和看家基因ACTIN。3荧光定量的结果采用仪器自带程序MXPRO32读取。4根据LIVAKSCHMITTGEN2001
11、提出的相对标准曲线法2CT对相对定量的结果进行分析，获得梅氏新贝尼登虫HSP70基因MRNA的相对表达量。HSP70基因表达的差异用SPSS软件130中的单因素方差分析法ONEWAYANOVA进行分析，以P进行纯化。122基因克隆与随机测序4在提取梅氏新贝尼登虫RNA后，用OLIGOTEXDT30纯化MRNA，以其为模板，采用CDNALIBRARYCONSTRUCTIONKIT构建梅氏新贝尼登虫CDNA文库，具体方法参照厂家说明。随机挑选一些克隆，部分测序并经BLASTP（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/）分析，测通与已知物种HSP70基因序列相似的插入片段克隆。利用已
12、提取的RNA序列，进行第一链CDNA合成。（部分参考文献1820）本文中的梅氏新贝尼登虫CDNA扩增主要采用TAKARA公司的LATAQTMPCRSYSTEM，25L反应体系成分如下试剂用量10LATAQTMBUFFER25LDNTPMIXTURE各25MMOL/L2L引物1L引物1LCDNA05LH2O1775LLATAQTMDNAPOLYMERASE025LPCR反应总体积25L检测采用TAKARA公司的RTAQTMDNA聚合酶体系，反应体系如下试剂用量10RTAQTMBUFFER25LDNTPMIXTURE各25MMOL/L2L引物1L引物1LCDNA05LH2O1775LRTAQTMD
13、NAPOLYMERASE025L反应总体积25LPCR流程如下94C变性2MIN后，作30个循环的扩增，每一循环包括94C变性2MIN、94C变性30S、退火根据计算的TM和实际操作调整30S和72C合成052MIN根据期望产物长度计算，一般认为合成1KB需要1MIN。循环结束后72延伸反应10MIN以保证获得全长产物。PCR扩增产物经1W/V琼脂糖凝胶电泳分离。ADNA片段切胶纯化将25LPCR产物与10LAODINGBUFFER混合，并在1W/V琼脂糖凝胶中电泳120V，EB染色后漂洗，紫外灯下观察。切下预期大小的目的片段，用EZNATMGELEXTRACTIONKITOMEGA纯化，具体
14、方法如下将目的胶条置EPPENDORF管，加300LBINDINGBUFFER后置5560水浴10MIN，每23MIN颠倒混匀一次；5将混合液混匀后转入蓝管，10000G离心1MIN；加300LBINDINGBUFFER，10000G离心1MIN；弃滤液，加700LWASHBUFFER于蓝管中，10000G离心1MIN；弃滤液，另加700LWASHBUFFER于蓝管中，10000G离心1MIN；弃滤液，13000G离心2MIN以彻底去除蓝管中的WASHBUFFER残留；加入30LELUTIONBUFFER于蓝管，室温静置1MIN，13000G离心1MIN，收集产物30保存。BTA连接由于LAT
15、AQTMDNA，RTAQTMDNA及聚合酶进行PCR时，会在产物DNA的3末端形成一个游离的A，PMD19TSIMPLEVECTOR载体5端具有与之配对的单个T，可与PCR产物直接连接。连接体系及反应如下，连接产物可直接用于转化。试剂用量2快速连接缓冲液5LPCR产物切胶纯化3LPMD19TSIMPLEVECTOR1LT4DNA连接酶1L反应总体积10L16连接05H后4过夜C感受态细胞制备CACL2法接种80长期保存的大肠杆菌菌株到5MLLB每升含10GTRYPTONE，5GYEASTEXTRACT，10GNACL，PH70液体培养基中，37摇床，200RPM，培养过夜12H左右；按1100
16、稀释到新鲜的LB液体培养基中，继续37摇床，200RPM，培养2H；取出菌液置冰上冷却10MIN，将冰冷的菌液1ML每管分装到15ML的EPPENDORF管，8000G离心1MIN，弃上清；沉淀用200L预冷的01MOL/LCACL2悬浮，冰浴30MIN后，8000G离心1MIN，弃上清；沉淀再用100L01MOL/LCACL2重悬浮，冰浴放置524H备用。D转化和筛选将10L连接产物加到100L感受态细胞中，冰浴放置30MIN；在42水浴热激90S，立即转移到冰上冷却数分钟；加入冰预冷的LB培养液890L后，37摇床低速170180RPM培养1H；在预先涂布XGAL和IPTG的LB平板上液体
17、LB培养基中添加15琼脂粉，取100L转化后的培养菌液，涂布于含氨卞青霉素50100G/ML，37培养箱过夜培养1014H；筛选白色菌落置5ML含氨卞青霉素50100MG/ML的LB培养液，在37摇床，200RPM，培养812H。6E质粒提取根据不同目的，本文采用两种方法提取质粒，其中粗提采用碱裂法小量制备质粒，用于检测。采用EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒OMEGA，用于双酶切。EZNAPLASMIDMINIKITI试剂盒OMEGA法取3050ML的菌液，于室温下5000G，离心10MIN，沉淀菌种；倒出或吸掉培养基，往沉淀中加入25ML的SOLUTION/RNASEA混和液，漩
18、涡振荡使细胞完全重新悬浮；转移细胞悬溶液到3050ML的离心管中，往重悬混和液中加入25MLSOLUTION，盖上盖子，轻轻的但要彻底混匀，颠倒1015次以获得澄清裂解物。如有必要，可把裂解液置于室温静置2MIN；往上述混和液中加入35MLSOLUTION，盖好盖子，并温和地上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮狀沉淀，于室温最好4下12000G，离心10MIN；小心吸取37ML上清液到中量结合柱，结合柱套上15ML的收集管，确保转至柱內的上清中没有细胞杂质沉淀。于室温下5000G离心35MIN，使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中滤液并把柱子重新装在15ML收集管中。重复这一步，直至将全部样品通过
19、柱子，弃去流出液（收集管重复使用）。加入3MLBUFFERHB到中量柱子中，室温下5000G离心35MIN，弃去收集管中的滤液，在下一步中重复使用收集试管；加入35MLDNAWASHBUFFER用无水乙醇稀释的洗涤柱子，室温下5000G离心35MIN，弃去洗涤液；重复上一步骤步骤，再用35ML的DNAWASHBUFFER洗涤柱子一次；室温下5000G离心空柱1015MIN以甩干柱子基质。进一步干燥柱子，在65烘箱中处理10MIN，移走柱子；把柱子置于一干净的15ML小离心管上，直接加入051MLELUTIONBUFFER到柱子基质上，室温下静置2MIN，5000G离心5MIN，洗脱出DNA，纯
20、化的质粒于30保存。F重组质粒的鉴定将碱裂法抽提的质粒与10上样缓冲液混匀后，1琼脂糖凝胶电泳，选择大小合适的重组质粒进行PCR检测，PCR检测体系如前212。PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳分离。鉴定为目的重组质粒后，将目的菌株的菌液加10甘油混匀后置于80保存。G构建CDNA文库H序列测定采用ABIPRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序，由上海华大公司测定，通过对CDNA文库进行测序获得CDNA序列。I序列分析与进化树构建21同源比对使用BLAST软件来自于NCBI官网上的BLAST分析系统；信号肽序列预测使用SIGNALP30系统源于HTTP/WWWCBSDTUDK/SERVICES
21、/SIGNALP/；7多重序列比对使用CLUSTALW程序；系统进化树构建采用MEGA40TAMURAETAL,2007。123荧光定量PCR2224采用实时荧光定量PCRREALTIMEFLUORESCENTQUANTITATIVEPCR，QRTPCR来检测梅氏新贝尼登虫HSP70的表达差异。A利用已提取的RNA，进行第一链CDNA合成。25LPCR的反应体系包括SYBRPREMIXEXTAQ2缓冲液125L，引物各1L，模板05L。扩增反应在STRATAGENEMX3000P荧光定量PCR仪上进行，程序为94180S1个循环B进入扩增阶段，共40个循环，每一循环包括9430S，5830S，
22、7230S。PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，以确保特异性扩增，条件是9430S，7260S，9530S1个循环。为保证PCR结果的准确性，每一个样品重复分析3次，包括目标基因HSP70和看家基因28S。C荧光定量的结果采用仪器自带程序MXPRO32读取。D根据LIVAKSCHMITTGEN2001提出的相对标准曲线法2CT对相对定量的结果进行分析，获得梅氏新贝尼登虫HSP70基因MRNA的相对表达量。HSP70基因表达的差异用SPSS软件130中的单因素方差分析法ONEWAYANOVA进行分析，以P005为显著性差异。名称位置序列长度HSP70HSP70GAGATCGAGCGCATGG
23、T95BPHSP70TAGCTCTCCAAGGCGTTCT名称登录号位置序列长度28SFJ97200528SAAGCCACCATGCGTTTGTA149BP28STCATGCCAGAATACCAACCTAB1RTPCR中使用的引物82结果与分析21梅氏新贝尼登虫的CDNA序列及氨基酸序列9FIG1通过DNAMAN软件获得的氨基酸序列由FIG2可见，梅氏新贝尼登虫的HSP70CDNA序列由2144BP编码区、103BP的5UTR区和94BP的3UTR区组成，并且含有加尾信号ATTAAA和POLYA尾巴。22对获得的CDNA进行的结构域构建通过EXPASY网站，将上述获得的CDNA进行一定的分析后
24、，我们获得了相关的结构域信息。一级结构NUMBEROFAMINOACIDS64910MOLECULARWEIGHT706658THEORETICALPI520二级结构11PARAMETERSWINDOWWIDTH17SIMILARITYTHRESHOLD8NUMBEROFSTATES4三级结构可能存在3个3级结构模型1MODELLEDRESIDUERANGE385TO543模型2MODELLEDRESIDUERANGE1TO55412模型3MODELLEDRESIDUERANGE542TO621FIG2通过EXPASY获得的梅氏新贝尼登虫HSP70的结构域信息通过对梅氏新贝尼登虫HSP70的氨
25、基酸序列进行了结构域分析，可以得知一级结构参数该序列含有649个氨基酸，分子量为70666，理论上的PI值为52。二级结构参数窗宽为17，相似阈值为8，区域数为4；含有277个螺旋，120个延展臂，39个转角，213个无规则卷曲。23不同物种之间的序列比对通过使用NCBI库中的BLAST软件，对梅氏新贝尼登虫的序列进行了比对。结果如下FIG4通过BLAST做出的编码蛋白的同源性比对NCBI编号物种名称MAXIDENTE值匹配值ACB474831PHASCOLOSOMAESCULENTA可口革囊星虫8701023ADR665141PERINEREISAIBUHITENSIS（双齿围沙蚕）8701
26、019BAG828491SERIOLAQUINQUERADIATA（鰤鱼）8601018ABB170401FUNDULUSHETEROCLITUSMACROLEPIDOTUS（底鳉）8501017ADK889041LUTJANUSSANGUINEUS（红笛鲷）8501015ACJ035951HYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIX（白鲢）850101513ACC939932MEGALOBRAMAAMBLYCEPHALA（团头鲂）8501015ACY699951RANALESSONAE（莱桑池蛙）8501013TAB3通过BLAST的比对对编码蛋白的同源性进行比对通过BLAST比对，
27、可以看出，与梅氏新贝尼登虫HSP70基因同源性比较高的物种或转基因基本上多属于扁形动物门、软体动物门等。24梅氏新贝尼登虫HSP70基因的进化树构建通过使用CLUSTALW和MEGA40软件，并从NCBI库中获得了大量相关HSP70基因的序列，然后构建相关的FASTA数据库，最终制作出相应的进化树图谱。FIG5通过MEGA40程序对HSP70氨基酸全长序列进行的进化树（邻接的）分析。分叉的长短表示这个群组的分支在分化后的发生的半分比（1000次复制；只显示了当量的60）。比例尺表示每段所代表的数量。通过进化树的构建，我们可以看出梅氏新贝尼登虫该基因与其他物种的相关基因之间的同源性和分化差异。梅
28、氏新贝尼登虫的HSP70基因与扁形动物的相应基因在同源性上是相当高的，尤其与东洋涡虫的同源性很高，与低等动物间的同源性较近，与高等动物相比同源性较远，特别是与脊索动物的同源性上相对而言很疏远。25梅氏新贝尼登虫HSP70MRNA的相对表达量项目发育阶段14A卵B钩毛蚴C成虫HSP70000407200004620000482000342400003200000531000278100003180000622000361900004160000640平均值000347400003790000569SD000053600000720000075TAB2实验获得的表达量值及平均值和标准差FIG3通过
29、上述数据获得的HSP70MRNA相对表达量的柱状图分析（柱表示平均值，柱子上的T表示标准误）通过数据及图表，我们可以看到梅氏新贝尼登虫在卵阶段的HSP70表达量相对于其他发育阶段而言是非常高的，这说明在这一阶段的HSP70与梅氏新贝尼登虫的发育旺盛有关，而钩毛蚴和成虫阶段，其表达量则相对较低且比较稳定。HSP70MRNA相对表达量柱状图000005000100015000200025000300035000400045A卵B钩毛蚴C成虫HSP70MRNA相对表达量平均值153讨论热休克蛋白HEATSHOCKPROTEINSHSPS，是一类在细菌到哺乳动物中广泛存在的热应激蛋白质。当有机体于高温
30、时，就会因热激发而合成这类蛋白质以保护自己。许多热休克蛋白均有着分子伴侣的性质和功能，因此HSP是些在进化上十分保守的蛋白质家族。依蛋白质分子大小，可以将热休克蛋白分为五类，即HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白SMHSP。25HSP70蛋白质家族是其中功能上较为广泛的一种，也是被研究的最为深入的HSP蛋白。它不仅能在热胁迫条件下下表达，而且是几乎所有活体细胞中的重要成分。HSP70家族作为分子伴侣在许多生物学过程中起到了重要作用。26在应激条件促使下，哺乳动物的胚胎中的其他HSP蛋白合成会暂时减弱或者终止，而HSP70则会大量合成。27,28由于HSP70在细
31、胞生命活动的不同功能中发挥着显著作用，大量合成的HSP70蛋白质能够维持细胞体蛋白质的正确构象，并参与细胞的耐热性的形成，起到抑制细胞凋亡的作用，从而得以保护胚胎，使其抵抗力更强，使细胞能在更严重的应激损伤中得以存活。2931在本论文中，我们主要研究了梅氏新贝尼登虫各个发育阶段的HSP70表达。通过对不同阶段的虫体的MRNA的提取、分化、分析等，我们获得了有关的MRNA相对表达量，从而能够确定不同阶段HSP70的表达情况，并与相对应的生理生活阶段共同分析，以得到一些相关性。根据实验结果，我们发现，梅氏新贝尼登虫在卵阶段的HSP70表达与另两个阶段相比，合成得比较旺盛，根据这一阶段该虫的生活史的
32、情况，我们觉得这可能与提高虫卵幼年期的保护能力，并促进生长发育有一定的关系。对于钩毛蚴和成虫时期，梅氏新贝尼登虫的HSP70表达程度相近，且比卵期的表达量显得的低了许多，而这两个阶段中，梅氏新贝尼登虫主要是完成体器官、性器官的发育成熟和寄生、染病、生殖等生理过程，较低的HSP70表达量说明了这些活动与HSP70的关系可能较少，并且这两个阶段HSP70有着较强的抗逆性。通过对梅氏新贝尼登虫不同发育阶段的HSP70表达量进行分析，我们觉得，梅氏新贝尼登虫在卵时期的保护能力较弱，并且其生长发育有赖于HSP70蛋白的保护，如果能够阻断或减少其HSP70的合成、分泌，这样不仅可以使梅氏新贝尼登虫的保护能
33、力减弱，使其更容易在卵阶段受到外界的损害，对于其发育阶段的影响，也可能会使虫体在钩毛蚴和成虫期的感染能力和繁殖能力有所减弱，使得梅氏新贝尼登虫对于鱼类的威胁减少，最终为经济鱼类的养殖作业起到一定的保护作用。尽管本文对于梅氏新贝尼登虫不同发育阶段的HSP70表达进行了量化分析，内容上比较客观，但仍存在一定的局限性。本文虽然对HSP70表达量进行了采集和分析，但是实验中我们只采用了一种收集数据的方法（荧光定量PCR），如果有其他方法的加入，我想应该可以使实验结果更充实更有说服力。另外，本文中对于HSP70对梅氏新贝尼登虫的影响的分析，仅仅是针对HSP70一种蛋白质，而HSP家族中的其他成员并没有涉
34、及或考虑，在实验中，这些HSP没有放在检验的范围内，只是对单一变量进行了一定的检测和分析，在梅16氏新贝尼登虫的发育过程中，其他HSP蛋白也可能会对其产生深远的影响，或者说起到了比HSP70更为重要的影响，这些元素的缺失也使得结果说法略显单一。本文对于梅氏新贝尼登虫的发育过程中HSP70这一关键蛋白的表达进行较为具体的量化分析，获得比较详实的结果，做出了一定的分析和探讨，在我国南海经济鱼类网箱养殖作业的寄生虫病保护中具有一定的可推广性。其中的分析与梅氏新贝尼登虫的发育阶段的表象有一定的联系，对于当地的此类寄生虫病危害（新贝尼登虫属，因为其HSP70基因上有很高的同源性）能起到一定的帮助和启示作
35、用。4结语本课题通过提取梅氏新贝尼登虫的RNA，使用PCR技术获取其HSP70序列，并分析其表达和功能表征，从而研究不同发育阶段梅氏新贝尼登虫的HSP70的表达，为进一步探究HSP70在动物体内的功能和防治此类病虫害的方法提供理论基础，同时构建出来的进化树可以用于比较分析不同物种的HSP70氨基酸序列特征，以期为这些鱼类的抗逆、应激效应的深入研究提供依据。参考文献1杨文川,李立伟,石磊等妃新本尼登虫单殖目多室科的发育J动物学报,2002,48175792杨丽华大黄鱼的病害防治J渔业致富指南,2002,4543杨文川,李立伟,石磊等福建海水养殖鱼类寄生贝尼登虫病原学研究J台湾海峡,2001,20
36、22052094OGAWAK,BONDADREANTASOMG,FUKUDOMEM,ETALNEOBENEDENIAGIRELLAEHARGIS,1955YAMAGUTI,1963MONOGENEACAPSALIDAEFROMCULTUREDMARINEFISHESOFJAPANJJPARASITOL,1995,8122232275NORITAKAH,RYOKOT,HIROKOH,ETALTHEINFLUENCEOFDIFFERENTWATERTEMPERATURESONNEOBENEDENIAGIRELLAEMONOGENEAINFECTION,PARASITEGROWTH,EGGPRODU
37、CTIONANDEMERGINGSECONDGENERATIONONAMBERJACKSERIOLADUMERILICARANGIDAEANDTHEHISTOPATHOLOGICALEFFECTOFTHISPARASITEONFISHSKINJAQUACULTURE,2010,2992276DYERWG,WILLIAMSEH,JR,ETALNEOBENEDENIAPARGUERAENSISNSPMONOGENEACAPSALIDAEFROMTHEREDHIND,EPINEPHELUSGUTTATUS,ANDCOMMENTSABOUTNEOBENEDENIAMELLENIJJPARASITOL,
38、1992,7833994017XUPJ,XIAOJH,LIUL,ETALMOLECULARCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFFOURHEATSHOCKPROTEINGENESFROMMACROCENTRUSCINGULUMHYMENOPTERABRACONIDAEJMOLBIOLREP,2010,3722652272178凌明圣,徐明波,姚志坚分子伴侣HSP70研究进展J国外医学分子生物学分册,1993,1552272309HESJ,YANGLL,LVZY,ETALMOLECULARANDFUNCTIONALCHARACTERIZATIONOFAMORTALINLIKEP
39、ROTEINFROMSCHISTOSOMAJAPONICUMSJMLP/HSP70ASAMEMBEROFTHEHSP70FAMILYJPARASITOLRES,2010,10795596610NAKAMURAK,ROKNTANK,MARUIN,ETALINDUCTIONOFHEATSHOCKPROTEINSANDTHEIRIMPLICATIONINPROTECTIONAGAINSTETHANOLINDUCEDDAMAGEINCULTUREDGUINEAPIGGASTRICMUCOSALCELLSJGASTROENTEROLOGY,1991,101716116611EBERTMP,SCHAFER
40、C,CHENJ,ETALPROTECTIVEROLEOFHEATSHOCKPROTEIN27INGASTRICMUCOSALINJURYJJPATHOL,2005,207217718412WADAI,OTAKAM,JINM,ETALEXPRESSIONOFHSP72INTHEGASTRICMUCOSAINREGULATEDBYGASTRICACIDINRATCORRELATIONOFHSP72EXPRESSIONWITHMUCOSALPROTECTIONJBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2006,349261161813TAKAOS,TETSUOK,KATSUMASAG,ETA
41、LPOSSIBLEROLEOFCALCINEURININHEATINGRELATEDINCREASEOFRATMUSCLEMASSJBIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMUNICATIONS,2005,33141301130914PELLECCHIAM,SZYPERSKITNMRSTRUCTUREOFTHEJDOMAINANDTHEGLY/PHERICHREGIONOFTHEESCHERICHIACOLIDNAJCHAPERONEJJMOLBIOL,1996,260223625015QIANYQ,PATELD,HARTLFU,ETALNUCLEARMAGNE
42、TICRESONANCESOLUTIONSTRUCTUREOFTHEHUMANHSP40HDJ1JDOMAINJJMOLBIOL,1997,7312913316SONGJY,LIL,AHNJB,ETALACUTELIVERTOXICITYBYCARBONTETRACHLORIDEINHSP70KNOCKOUTMICEJEXPERIMENTALANDTOXICOLOGICPATHOLOGY,200759293417KIMURAY,YAHARAILINDQUISTSROLEOFTHEPROTEINCHAPERONEYDJ1INESTABLISHINGHSP90MEDIATEDSIGNALTRANS
43、DUCTIONPATHWAYSJSCIENCE,1995,26852151362136518王瑞,黄艳华,陈明,梁万文,黄钧罗非鱼感染链球菌后HSP70基因表达研究J广西农业科学,2010,41437137419高宇,袁改玲,李大鹏,陈昌福杂交鲟和匙吻鲟HSP70CDNA克隆与序列分析J华中农业大学学报,2010,291858920明建华,谢俊,刘波等团头鲂HSP70CDNA的克隆、序列分析以及热应激对其MRNA表达的影响J中国水产科学,2009,16563564821袁金钱,路义鑫,韩彩霞,宋铭忻本地毛形线虫HSP70基因的克隆与序列分析J中国兽医科学,2007,37121062106422
44、袁继红实时荧光定量PCR技术的实验研究J现代农业技术,2010,13202223尹兵实时荧光定量PCR的原理及应用研究进展J科技信息,2010,1730,5924苏洁,蔡宏,朱玉贤结核分枝杆菌热休克蛋白HSP70在原核表达载体中的克隆表达与鉴定J中国人兽共患病学报,2006,22871271525李传明,石佑恩寄生虫热休克蛋白及其在血吸虫方面的研究进展J国外医学寄生虫病分册,181996,23519319726齐晶,闵连秋低氧预处理对缺血脑组织HSP70蛋白表达的影响J中国民康医学,2008,20991393527张文利,曹宁,杨靖,高雪芹HSP60HSP70HSP90在结直肠癌癌旁组织的表达及与病理分级的关系J济宁医学院学报,2009,326390392,39528赵桢,王晓涛,陈兰英等人食管癌及宫颈癌组织中HSP70基因的表达J中国生物制品学杂志,2005,18210929薛淑慧HSP70蛋白在胃溃疡组织中表达的临床意义J海南医学,2009,201054,7030李玉琴,黄民,王英凯等热休克蛋白70在消化性溃疡及急性糜烂出血性胃炎组织中的表达及意义J吉林大学学报医学版,2008,34584684931赵紫婷,王建平,苏士文,王佩佩大鼠磨牙牙髓组织在程度不同的机械性损伤刺激后HSP70的表达及意义的研究J口腔医学,2010,306339342
