1、1本科毕业论文系列开题报告水产养殖三疣梭子蟹LGBP基因的克隆与组织表达一、选题的背景与意义三疣梭子蟹是我国大型海养蟹类，具有十分重要的经济价值和营养价值，也是我国沿海水产养殖重要的经济种。三疣梭子蟹（PORTUNUSTRIUBERBUCULATUS）属于甲壳纲（CRUSTACEA）、十足目（DECAPODA）、梭子蟹科（PORTUNUIDAE）、梭子蟹属（PORTUNUS），地方名有梭子蟹、枪蟹、海螃蟹、水蟹等。随着水产养殖业的全面发展，三疣梭子蟹的养殖也在沿海蓬勃兴起，养殖规模日趋增大，其病害也随之多起来，目前三疣梭子蟹的病害对其养殖产量造成了不可忽视的损失，因此，对于三疣梭子蟹的病害防治
2、和研究十分必要。目前，对三疣梭子蟹的研究在分子生物学方面已经展开，为我们了解三疣梭子蟹提供了很大的帮助，但有关梭子蟹病害防控方面的研究资料还很少，主要集中在对病原的分离鉴定（许文军2005；王国良2006）、疾病的诊断及防治技术研究（赵青松2005；金珊2006）等，而有关免疫学方面的研究几乎没有。三疣梭子蟹由于无特异性免疫，因此其先天免疫的“非己”识别更为重要，这种“非己”识别是因为存在某些特异性的模式识别受体PRRS，它能够识别并结合微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相关分子模式PAMPS，如脂多糖（LPS）、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖、病毒DSRNA、细菌DNA等GU，2001。
3、由于这些大分子对微生物的存活是必需的，因此微生物不能通过改变PAMPS来避免被先天免疫系统识别DU，2007。目前，对先天免疫识别的研究主要集中在哺乳动物（MEDZHITOV1997；LEVASHINA2001；LIU2002）、昆虫（WERNER2000；GOTTAR2002；KANOST2004、线虫LEVASHINA2001等，而水产动物模式识别受体的研究相对较少，主要针对淡水螯虾、凡纳对虾、南美白对虾、中国明对虾等虾类LEE2000；SU2004；王金星2004；CHENG2005；梁虹2006；CHIU2007和扇贝（苏建国2004，胥炜2005）、中华绒螯蟹（ZHAO2009）等。
4、LGBP（LIPOPOLYSACCHARIDEANDBETA1，3GLUCANBLINDINGPROTEIN），即脂多糖1，3葡聚糖结合蛋白，它能够识别G细菌和真菌的细胞壁多糖成分脂多糖和1，3葡聚糖。在异物侵入机体时，LGBP不仅能够促进血淋巴细胞的吞噬、黑化、包囊、凝集等作用，而且还可以激活蛋白酶级联反应，引起抗菌肽的合成YUETAL，22002），因此，它在无脊椎动物的免疫系统中占有重要地位。本项目对三疣梭子蟹LGBP基因进行克隆与表达研究，不仅对深入了解三疣梭子蟹先天性免疫功能和调节机制、丰富和发展无脊椎动物免疫学的内容具有重要的理论意义，而且对三疣梭子蟹免疫增强剂的研发及水产动物疾病
5、的防治都具有重要的指导价二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究基本内容1、三疣梭子蟹LGBP基因的克隆和序列分析；2、LGBP在三疣梭子蟹血细胞、鳃、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺等主要组织中的表达差异。拟解决的主要问题1、三疣梭子蟹LGBP基因的序列及氨基酸序列结构特征；2、LGBP在三疣梭子蟹各主要组织中的表达调控规律。三、研究的方法与技术路线研究的方法1试验材料三疣梭子蟹，溶藻弧菌，酵母菌2试剂与药品MRNA纯化试剂盒，RACE反应试剂盒，TAQDNA聚合酶，05MLPCR反应管等。3主要仪器微量移液器，台式高速冷冻离心机，台式摇床，磁力搅拌器，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，紫外凝胶成
6、像系统，恒温水浴等。4细菌刺激实验溶藻弧菌和酵母菌于实验前一天活化，两种菌高温高压灭活后分别配成107CELLML1备用，使用前等比例混合两种菌液。用混合菌悬液刺激健康三疣梭子蟹，定时取健康蟹和刺激蟹的血细胞等组织用于总RNA的提取和其它实验。5三疣梭子蟹总RNA的提取采用上海博星UNIZOL试剂提取三疣梭子蟹总RNA，具体方法参照说明书。提取的总RNA经紫外分光光度计检测并确定其完整性后，在80保存备用。6LGBP基因片段克隆查询GENBANK数据库，结合其他动物同源LGBP基因的保守序列设计简并引物，以三疣梭子蟹血细胞CDNA为模板进行PCR扩增，扩增到的DNA片段连接到T载体，转化感受态
7、细胞后进行测序。7LGBP基因全长CDNA克隆用RACE方法克隆目的基因。比对以上实验得到的LGBP部分序列与其他无脊椎动物LGBP基因的同源性，根据此测得序列设计正向和反向特异性引3物，用于5RACE和3RACE方法克隆LGBP基因的5末端和3末端序列，最后拼接获得LGBP基因的全长CDNA。8LGBP基因序列分析采用生物信息学方法对LGBP基因序列进行同源性比较、全长序列ORF分析；对CDNA推导的氨基酸序列及LGBP的结构进行分析，预测LGBP的功能域。用BLAST软件（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST）对该基因的氨基酸和核苷酸的同源性进行分析，用CLUSTALW程
8、序（HTTP/WWWEBIACUK/CLUSTALW）进行多序列比对。9LGBP基因组织表达分析取0、6、12、24、48、72H刺激组及生理盐水对照组的不同三疣梭子蟹组织（血细胞、鳃、肝胰腺、心脏、肌肉、性腺），采用RTPCR方法，以ACTIN基因作为内标，来检测不同三疣梭子蟹组织中LGBPMRNA的表达情况及动态变化。技术路线4四、研究的总体安排与进度2010年1月2010年4月1、实验前的准备工作查找资料，写开题报告和论文综述；2、仪器、药品的准备和各种实验材料的准备。2010年5月2010年12月细菌刺激三疣梭子蟹总RNA提取三疣梭子蟹LGBP基因核心序列的克隆LGBP全长基因的获得进
9、行目的基因的序列分析查找资料，写开题报告和综述仪器、药品和各种实验材料的准备购得健康三疣梭子蟹成蟹，暂养SMARTCDNA的合成取0、6、12、24、48、72小时以及生理盐水对照组的不同三疣梭子蟹组织（血细胞、鳃、肝胰腺、心脏、肌肉）用RTPCR方法，以ACTIN基因作为内标，来检测不同组织中LGBPMRNA的表达情况及动态变化。组织表达分析撰写论文论文答辩51、三疣梭子蟹LGBP基因的克隆及序列分析。2、LGBP基因的组织表达研究3、翻译外文文献。2011年1月2011年4月1、补充相关数据，整理试验结果；2、撰写论文初稿。3、论文定稿，论文答辩。五、主要参考文献1ROXANABH,GIA
10、NEMDEVELOPMENTOFAPCRPROTOCOLFORTHEDETECTIONOFAEROMONASSALMONICIDAINFISHBYAMPLIFICATIONOFTHEFSTA（FERRICSIDEROPHORERECEPTOR）GENEJVETERNITYMICROBIOLOGY,2008,1283963942MINESA,GALLACHERAAELIABLERTPCRELISAMETHODFORTHEDETECTIONOFINFECTIOUSPANCREATICNECROSISVIRUS（IPNV）INFARMEDRAINBOWTROUTJJOUYURNALOFVIROLOG
11、ICALMETHODS,2006,13292963YONGCL,BASKARALINGAMV,JIANNCCIDENTIFICATIONANDPHYLOGENETICANALYSISONLIPOPOLYSACCHARIDEAND1,3GLUCANBINDINGPROTEINLGBPOFKURUMASHRIMPMARSUPENAEUSJAPONICUSJDEVELOPMENTALANDCOMPARATIVEIMMUNOLOGY,2008,32126012694XINJD,XIAOFZ,JINXWMOLECULARCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFALIPOPOLYSACCH
12、ARIDEAND1,3GLUCANBINDINGPROTEINFROMFLESHYPRAWNFENNEROPENAWUSCHINENSISJMOLECULARIMMUNOLOGY,2007,446108510945高保全,刘萍,李健,等三疣梭子蟹野生群体同工酶的遗传多态性分析J水产学报,2007,301166高排山,施陆三疣梭子蟹与脊尾白虾混养初探J科学养鱼,2004726277郭天慧,孔晓喻,陈四清,等三疣梭子蟹线粒体DNA、16SRRNA和COI基因片段序列的比较研究J中国海洋大学学报,2004,34122288胡雪峰,石存斌,潘厚军,等海水养殖斜带石斑鱼溃疡病病原菌溶藻弧菌的初步研究J中
13、国海洋大学学报,2005,3522322369金珊,赵青松,王春琳,等,梭子蟹科六种海产蟹的RAPD标记J动物学研究,2004,25217217610姜志聃,唐日峰,陈广凤利用虾池养殖三疣梭子蟹的技术措施J中国水产,20007363711孔晓瑜,刘亚军,喻子牛,等栉孔扇贝和海湾栉孔扇贝线粒体16SRRNA基因片段的比较研究C贝类学论文集第IX辑,北京海洋出版社,2002596212刘永,许强华,陈新军,等浙江近海三疣梭子蟹群体遗传结构的初步分析J上海海洋大学学报,2008,1802137141613梁虹,王安利,王维娜无脊椎动物模式识别蛋白研究进展J生理科学进展,2006,3721561591
14、4柳峰松中国明对虾（FENNEROPENAEUSCHINENSIS）抗菌因子及模式识别蛋白的研究D中国科学院研究生院（海洋研究所）,200515孟庆显,余开康鱼虾蟹贝疾病诊治和防治M北京中国农业出版社,1996,25528116孙红英,周开亚,陆健健,等中国大陆绒螯蟹线粒体16SRDNA变异与分子标记鉴定J自然科学进展,2002,12548549017陶保华,石和荣黄俊文,等假单胞菌引起罗氏沼虾黄鳃、黑鳃病的研究J中山大学学报自然科学版,2000,39S125525918王国良,金珊,陈寅儿,等三疣梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病性研究J海洋科学进展,2006,24452653119王建波ISS
15、R分子标记及其在植物遗传学研究中的应用J遗传,2002,25561361620王建平,余晓巍,沈庞幼,等三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）微卫星位点的分离和序列分析J海洋与湖沼,2009，4001848721王虹玲从三疣梭子蟹中检出白斑杆状病毒的实验报告J中国卫生检验杂志,2005,15111822王广成,王权,李欣,等三疣梭子蟹高产高效养成技术J水产科技情报,2005,32311011223许文军,徐汉祥,金海卫,等梭子蟹“乳化病“病原的研究J浙江海洋学院学报自然科学版,2003,22320921324许文军,徐汉祥,金海卫梭子蟹“乳化病“病原的研究J浙江海洋学院学
16、报,2003,22320921325徐敬明蟹类线粒体DNA的研究与应用J中国海洋大学学报,200636687988426薛俊增,堵南山,赖伟中国三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULAMSMIERS的研究J东海海洋,1997,154606427余红卫,朱冬发,韩宝芹三疣梭子蟹不同组织同工酶的分析J动物学杂志,2005,401848728袁列伟,郑志光三疣梭子蟹二茬池塘养殖试验J浙江海洋学院学报,2004,23435135329张继泉中国明对虾免疫等相关基因的克隆、重组表达与功能分析D中国科学院研究生院（海洋研究所）,20057毕业论文文献综述水产养殖三疣梭子蟹的主要疾病及分子生物学方
17、法在水产动物研究中的应用概况摘要三疣梭子蟹是我国重要的经济蟹类，随着近年来其养殖规模的不断扩大，梭子蟹的疾病也越来越多，本文主要介绍了三疣梭子蟹在养殖过程中一些常见疾病的病因、症状、流行情况、防治方法及几种分子生物学方法在水产动物研究中的应用，如同工酶谱分析、RAPD分子标记技术等，以期为三疣梭子蟹的疾病防控提供理论参考。关键词三疣梭子蟹主要疾病分子生物学方法三疣梭子蟹是我国大型海养蟹类，具有十分重要的经济价值和营养价值，也是我国沿海水产养殖重要的经济种。三疣梭子蟹（PORTUNUSTRIUBERBUCULATUS）属于甲壳纲（CRUSTACEA）、十足目（DECAPODA）、梭子蟹科（POR
18、TUNUIDAE）、梭子蟹属（PORTUNUS），俗称枪蟹、白蟹、膏蟹1，2。梭子蟹养殖在北方有较长的历史，但产量不高，多为粗放式经营。近年来，随着沿海水产养殖产业的全面发展，梭子蟹的养殖也在沿海蓬勃兴起。目前梭子蟹主要以混养为主，也有一些半精养的形式。但是随着养殖规模的增大，梭子蟹的病害也越来越多，其中包括细菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病3、寄生虫类疾病以及由环境因素引起的病害，导致梭子蟹养殖的减产。因此，对于三疣梭子蟹的疾病防控研究迫在眉睫。本文概述了目前梭子蟹养殖过程中的主要病害、防治及几种分子生物学方法在水产动物研究中的应用研究概况，以期为三疣梭子蟹的疾病防控提供理论参考。1三疣梭子
19、蟹的主要疾病11纤毛虫病病因由固着类纤毛虫附着在蟹的鳃、体表、附肢等部位引起疾病。症状蟹体表可看到大量绒毛状物质，并具有滑感，患病蟹的反应明显迟钝。危害及流行情况该病主要发生在67月份养殖三疣梭子蟹小苗期以及暂养中后期4，水温1820度，盐度在13左右时，纤毛虫的繁殖能力最强，会在蟹身体上大量生长，严重时可使幼体呈白絮状漂浮于水面，此病不仅会影响幼体生长发育，严重时还会导致幼体死亡，产生重大经济损失。主要防治方法用蟹安或纤虫净，按05G/M，严重时结合硫酸铜02G/M，全池泼洒85。可以在饵料中加入脱壳素，促进蟹的脱壳，从而除去纤毛虫。12肌肉乳化病病因以酵母菌为病原体感染蟹体，并可以溶藻弧菌
20、为原发性感染，葡萄球菌为继发性感染。池底污染严重有机物含量高者容易引起此病。症状蟹的行动迟缓，爬上岸，鳃内浑浊物质增多，严重者外壳颜色发黄、肌肉糜化，血淋巴变为白色，肌肉全部液化，也称“牛奶病”6。危害及流行情况每年发病高峰期集中在911月的育肥时期，该病主要发生在养殖后期，当水温在20度以下，池底受污染，池水中有机物含量高易发此病。影响三有梭子蟹的脱壳，应激反应后造成免疫能力降低，抵御病原菌的能力变差，使病原菌趁虚而入。在少数蟹发病后，由于梭子蟹之间的残伤，可使病害迅速蔓延扩散。还没较好的防治方法，减小放养密度、改善养殖环境以及各种应激反应，也许会得到不错的效果，同时内服“力菌沙”，效果较好
21、。13脱壳不遂症病因三疣梭子蟹由于水体缺氧，缺乏钙质，甲壳素、脱壳素等脱壳所必须的物质，或因蟹体质差等种种原因导致其不能正常脱去旧壳，从而导致蟹死亡。症状蟹的头胸甲后缘与腹部交界处出现裂口，没能脱壳。危害及流行情况主要表现出在养殖的后期，脱壳后长时间甲壳难以钙化，变为软壳蟹，不能蜕去旧壳而导致死亡。防治方法增加饵料中的脱壳素等物质，增加营养，补充水体溶氧，调节盐度温度使之适合蟹体生长，并多投喂钙质饵料，使蟹能顺利蜕壳。14黑鳃、烂鳃病病因由于水体恶化，有机质超标，温度过高导致病原体大量繁殖，病原体主要为丝状真菌。症状患病蟹鳃丝腐烂并有较多粘液，重者鳃丝呈黑色，行动迟缓。危害及流行情况此病一般发
22、生高温季节，严重时会导致蟹体死亡。主要防治方法全池泼洒菌毒清进行杀菌消毒，内服菌毒杀星和蟹病康，并在饵料中添加蟹用多维7。15黄斑病病因在养殖过程中由于蟹的甲壳皮表受伤，分解几丁质的病菌侵入。症状足部基部和背甲上出现黄色斑点，甲壳上的斑点易破。9危害及流行情况该病蔓延性强，死亡率也较高，病蟹食欲减退进而失去活力，不久即死亡。防治方法死蟹应及时捞出，投喂新鲜饵料，同时添加蟹用多维，增加营养的同时全池消毒，改善底质和水质。16弧菌病病因病原体为鳗弧菌，副溶血弧菌和溶藻弧菌。大多数弧菌为条件致病菌，当环境污染，水体恶化，弧菌大量繁殖到一定数量时，体质弱或受伤的蟹易发生弧菌病。症状蟹体对饵料的捕捉能力
23、下降，甚至消失，趋光性减弱8，幼体活动不正常，严重时胸部及附肢发红。危害及流行情况当换水量不够或换水不及时，最容易发生此病，养成主要发病期在高温季节。防治方法在人工育苗期间可适当加大换水量，投喂鲜活饵料每隔10天左右对水体进行消毒，用以预防，可用聚维酮碘1015MG/L全池泼洒，一小时后换水，连续三天进行治疗。养成期间可用12MG/L大蒜素全池泼洒2天。2分子生物学方法在水产动物研究中的应用概况21同工酶谱分析同工酶谱分析是一种把生化的酶蛋白分析技术与组织化学的染色法结合起来的生化遗传学研究方法9。同工酶是基因表达的直接或间接产物，它能直接影响生物体对环境的应变能力和适应能力，因此，同工酶的多
24、样性直接表现出生物群体对环境的适应能力10。王春琳等11对三疣梭子蟹个体发育早期的同工酶谱分析研究发现，同工酶谱的变化可能与幼体发育过程的食性有关，为三疣梭子蟹发育生物学、遗传学、及幼体发育过程中的营养生理学研究提供了很大的帮助12。李纯厚等13对斑节对虾幼体发育阶段的同工酶研究结果显示出明显的发育特异性。MORGAN等14对哈氏扇蟹发育过程中的EST、MDH、LDH、PGI、ALP和ACP等同工酶系统的研究表明，六种同工酶的数量及其表达均显示出明显的发育差异性，同时，同工酶的变化可能与短尾类对实物的需求有关。22RAPD技术RAPD技术是建立在PCR基础上，用一系列不同的随机排列碱基序列的寡
25、核苷酸单链（一般为10个BP）作为引物，对所研究的基因组DNA进行扩增15，16。此技术在三疣梭子蟹等海产蟹类的资源鉴定、亲缘关系和系统生长发育等方面具有一定的可行性。金珊等17运用RAPD分子标记检测梭子蟹科六种海产蟹基因组DNA的多态性，10结果显示，三疣梭子蟹和红星梭子蟹聚在一起，再和锯缘青蟹聚在一起，证明了梭子蟹属与青蟹属的关系比鲟属的关系更近。高志千等18对中华绒螯蟹遗传变异的RAPD研究表明长江种群的遗传变异在三个种群中最低（D0013）。GARCIA等19尝试在斑节对虾中利用RAPD分析不同地理群体间的遗传多样性，并就其在虾类选育中的应用作了初步探讨。23AFLP技术AFLP技术
26、是一项新的分子标记技术，是基因组DNA经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，将特定的双链接头连接在这些DNA片段的两端，形成一个带接头的特异片段，通过接头序列和PCR引物3末端的选择性碱基的识别，扩增那些两端序列能与选择性碱基配对的限制性酶切片段20，21。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。王继伟等22利用AFLP分子标记技术来构建中国明对虾遗传连锁图谱。韩志强等23对黄姑鱼遗传多样性的AFLP分析显示黄姑鱼的遗传变异主要存在于群体内个体间，群体间无明显的遗传分化，说明群体间存在明显的基因交流。CONGIUL等24用AFLP鉴
27、定了纳氏鲟和美洲鲟杂交种。24PCR技术聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成扩增特异DNA片段的一种方法，典型的反应体系包括模板，引物，聚合酶和脱氧核苷三磷酸以及合适的缓冲液25，26。目前，国内外已有用PCR技术检测病原菌的方法，如ROXANA等27通过扩增FSTA基因来检测鲑鱼中的气单胞菌；谢数涛等28利用套式PCR的方法检测斑节对虾白斑症病毒（WSSV）。25ELISA技术酶联免疫吸附技术（ELISA）是将抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原反应在固相载体表面进行的一种检测技术29。MILNE等30利用RTPCRELISA联合的方法在虹鳟鱼体内检测传染性胰腺坏死病毒（IPNV）。樊景凤
28、等31利用间接ELISA法检测凡纳滨对虾红体病病原菌，并取得不错的效果。3展望随着分子生物学研究方法在水产动物疾病上的应用，更多技术将被应用到研究三疣梭子蟹上，我们对三疣梭子蟹的了解也将会更加完整和完善。尽管目前在基因组序列分析研究方面，有关三疣梭子蟹基因组的测序研究尚未展开，但这些技术也将会被应用到研究三疣梭子11蟹上，这些都将对三疣梭子蟹的养殖产业产生更多积极的影响。参考文献1励迪平,王春琳,吴丹华三疣梭子蟹抗乳化病相关基因的初步研究J水生态杂志,2008,111251282龚泉福青蟹河蟹梭子蟹M上海上海科学技术出版社,19973王光宇三疣梭子蟹的健康养殖和白斑病毒病的防治J水产科技情报，
29、2005,3252212224王建平,余晓巍,周志强，刘长军宁波市三疣梭子蟹主要病害流行特征及应对措施J河北渔业,2008,949535王金顺三疣梭子蟹养成期的主要疾病及防治技术J天津水产,2003,236376许文军,徐汉祥,金海卫等梭子蟹“乳化病”病原的研究J浙江海洋学院学报,2003,2232092137李卢三疣梭子蟹常见病与防治J齐鲁渔业,2006,23242438陈寅儿,金珊,赵青松梭子蟹养殖中的发病原因与防治对策J水利渔业,2005,25178799迟大利,阎斌伦,高焕等三疣梭子蟹分子生物学研究进展J水产养殖,2008,4111510朱东发,余红卫,王春琳三疣梭子蟹个体发育早起的同
30、工酶谱变化J水产学报2005,29675175611宋微微,王春琳,母昌考三疣梭子蟹个体发育早期的同工酶初步研究J湛江海洋大学学报,2006,261747612高保全,刘萍,李健等三疣梭子蟹野生群体同工酶的遗传多态性分析J水产学报,2007,3111613李纯厚,钟振如,陈敏斑节对虾个体发育早期的同工酶变化J水产学报,1994,181626414MORGANRPBIOCHEMICALCHANGESDURINGLARVALDEVELOPMENTOFTHEXANTHIDCRABRHITHROPANOCPEUSHARRISII,ISOZYMECHANGESDURINGONTOGENYJMARINEB
31、IOLOGY,1978,48322322615周孟姣,刘臻RAPD技术及其在虾、蟹类研究中的应用J水产科技情报，2003,303252816杨东,余来宁RAPD和AFLP在分析尼罗罗非鱼遗传多样性研究中的应用比较J江西农学报,2006,1821417金珊,赵青松,王春琳等梭子蟹科六种海产蟹的RAPD标记J动物学研究,2004,25217217618高志千,周开亚中华绒螯蟹遗传变异的RAPD分析J生物多样性,1998,6318619019GARCIADK，BENZIEAHRAPDMARKERSOFPOTENTIALUSEINPENAEIDPRAWN（PENAEUSMONODON）BREEDING
32、PROGRAMSJAQUACULIURE,1995,13013714420刘爽,薛淑霞,孙金生黄海和东海三疣梭子蟹（PORTUNUSTRIUBERBUCULATUS）的AFLP分析J海洋与湖沼,2008,39215215621姚红伟,袁霞,付鑫等AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用J现代渔业信息,2009,247222422王伟继,孔杰,董世瑞等中国明对虾AFLP分子标记技术遗传连锁图谱的构建J动物学12报,2006,52357558423韩志强,高天翔,王志勇等黄姑鱼群体遗传多样性的AFLP分析J水产学报,2006,30564064624CONGIUL,DUPANLOUPI,PATAR
33、NELLOTIDENTIFICATIONOFINTERSPECIFICHYBRIDSBYAMPLIFIEDFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISMTHECASEOFSTURGEONJMOLECOL,2000,102355235925亓晓艳分子生物学技术在水产动物疾病诊断和预防中的应用J专论综述,2008,9131526孔祥会,边中春分子生物学技术在水产动物疾病诊断上的应用J安徽农业科学,2007,35319939994027ROXANABH,GIANEMDEVELOPMENTOFAPCRPROTOCOLFORTHEDETECTIONOFAEROMONASSALMONICIDAINF
34、ISHBYAMPLIFICATIONOFTHEFSTA（FERRICSIDEROPHORERECEPTOR）GENEJVETERNITYMICROBIOLOGY,2008,12839639428谢数涛,何建国,杨晓明等套式PCR检测斑节对虾白斑症病毒（WSSV）J青岛海洋大学学报,2001,31222022429李玉珍,林亲录,肖怀秋酶联免疫吸附技术及其在食品安全检测中的应用研究进展J中国食品添加剂开发应用,2006,310811230MINESA,GALLACHERAAELIABLERTPCRELISAMETHODFORTHEDETECTIONOFINFECTIOUSPANCREATICNE
35、CROSISVIRUS（IPNV）INFARMEDRAINBOWTROUTJJOUYURNALOFVIROLOGICALMETHODS,2006132929631樊景凤,梁玉波,宋立超等凡纳滨对虾红体病病原菌间接ELISA快速检测方法的研究J水产学报,2006,30111311713本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹LGBP基因的克隆和组织表达14目录1引言22材料和方法321实验材料3211实验用蟹3212主要试剂与药品3213菌株3214引物3215主要仪器422实验方法4221菌株培养4222细菌刺激实验4223血细胞的提取4224总RNA的提取4225SMARTCDNA的合成4226保
36、守序列克隆52261PCR扩增52262PCR产物回收52263感受态细胞制备62264PCR产物的连接和转化62265单克隆培养与检测622663RACE61522675RACE7227序列分析9228LGBP组织表达分析92281实验准备92282总RNA提取92283CDNA的合成92284ACTIN和LGBP基因的RTPCR检测93实验结果1131总RNA的提取1132全长CDNA的克隆1133三疣梭子蟹LGBP基因序列分析11331LGBP基因及其对应氨基酸序列11332LGBP氨基酸序列同源性比较1334LGBP组织表达分析144讨论15致谢17参考文献18摘要采用金黄色葡萄球菌S
37、AUREUS和溶藻弧菌（VIBRIOALGINOLYTICUS）混合刺激三疣梭子蟹（PORTUNUS16TRITUBERCULATUS）后，提取其血细胞总RNA，再通过同源克隆和SMARTRACE技术获得了LGBP基因并对其进行了生物信息学分析，结果表明，该基因序列全长为1378BP，其中包含1095BP的开放阅读框OPENREADINGFRAME，ORF，在基因的5端含有138BP的非编码区UTR，3端含有144BP的UTR，AATAAA为加尾信号具体数据。RTPCR结果显示LGBP基因在被检测的三疣梭子蟹组织，包括血细胞、肝胰腺、心脏、鳃和肌肉中都有表达；并且在肝胰腺和血细胞中的表达明显高
38、于其他组织。这些结果的得到为我们深入了解三疣梭子蟹LGBP的功能提供了理论依据。关键词三疣梭子蟹；LGBP；基因克隆；组织表达ABSTRACTTHETOTALRNAWASEXTRACTEDFROMVIBRIOALGINOLYTICUSANDSAUREUSCHALLENGEDHAEMOCYTESOFPTRITUBERCULATUSUSEDTHETECENOLOGIESOFSTRATEGYOFHOMOLOGYCLONINGANDSMARTRACE,WEGETTHEGENESEQUENCESOFLGBP,ANDTHEBIOINFORMATICSANALYSISOFLGBPSHOWEDTHATTHES
39、EQUENCELENGTHOF1378BPCONTAININGA1095BPOPENREADINGFRAMEORF,ANDTHE5ENDOFGENECONTAINSA138BPNONCODINGREGIONUTR,ATTHESAMETIME,THE3ENDGETSA144BPNONCODINGREGION,WITHAENDSIGNALOFAATAAATHERTPCRRESULTSSHOWSTHATTHELGBPWASDETECTEDINPORTUNUSTRITUBERCULATUSORGANIZATIONS,INCLUDINGBLOODCELLS,LIVERANDPANCREAS,HEART,
40、GILLANDMUSCLE,ANDEXPRESSIONOFLGBPISHIGHERINBLOODCELLSANDHEPATOPANCREASTHANINOTHERTISSUESTHESERESULTSHAVEPROVIDEDTHOERTICALBASISTOHELPUSHAVEABETTERUNDERSTANDOFLGBPINPORTUNUSTRITUBERCULATUSKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSLGBPCLONETISSUEEXPRESSION171引言1997年MEDZHITOV等提出了病原相关分子模式PATHOGENASSOCIATEDMOLECULA
41、RPATTERNS，PAMPS和模式识别受体PATTERNRECOGNITIONRECEPTORS，PRRS的概念1，阐述了模式识别受体识别“自己”“非己”的能力，初步揭示了先天免疫在机体抗病免疫中的作用。三疣梭子蟹为无脊椎动物，其没有特异性免疫2,3，因此其先天免疫的“非己”识别更为重要，这种“非己”识别是因为其体内存在某些特异性的模式识别受体PATTERNRECOGNITIONRECEPTORS，PRRS，也称为模式识别蛋白PATTERNRECOGNITIONPROTEINS，PRPS，如C型凝集素、肽聚糖识别蛋白、1,3葡聚糖结合蛋白、脂多糖1,3葡聚糖结合蛋白、脂多糖结合蛋白等，它们能
42、够识别并结合微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相关分子模式PAMPS（脂多糖（LPS）、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖、病毒DSRNA、细菌DNA等）。由于这些大分子对微生物的存活是必需的，因此微生物不能通过改变PAMPS来避免被先天免疫系统识别。目前，对先天免疫识别的研究主要集中在哺乳动物4,5、昆虫6,7、线虫5等，而水产动物模式识别受体的研究相对较少，主要针对淡水螯虾、凡纳对虾（LVANNAMEI）、南美白对虾、中国明对虾等虾类1,8,9和栉孔扇贝8,10、中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSIS）等。据报道，LGBP（LIPOPOLYSACCHARIDEANDBETA1，3G
43、LUCANBLINDINGPROTEIN），即脂多糖1，3葡聚糖结合蛋白，它作为一种模式识别受体在甲壳动物的先天免疫中占有重要地位，它能够识别G细菌和真菌的细胞壁多糖成分脂多糖和1，3葡聚糖，在异物侵入机体时，可以促进血淋巴细胞的吞噬、黑化、包囊、凝集及激活蛋白酶级联反应，引起抗菌肽的合成11。三疣梭子蟹（PORTUNUSTRIUBERBUCULATUS）属于甲壳纲（CRUSTACEA）、十足目（DECAPODA）、梭子蟹科（PORTUNUIDAE）、梭子蟹属（PORTUNUS），地方名有梭子蟹、枪蟹、海螃蟹、水蟹等12,13。三疣梭子蟹是我国大型海养蟹类，具有十分重要的经济价值和营养价值，也
44、是我国沿海水产养殖重要的经济种。随着水产养殖业的全面发展，三疣梭子蟹的养殖也在沿海蓬勃兴起，养殖规模日趋增大，其病害也随之增多1417，目前三疣梭子蟹的病害对其养殖产量造成了不可忽视的损失，因此，对于三疣梭子蟹的病害防控研究十分必要。但是，目前在养殖生产中对三疣梭子蟹病害的防治仍是以药物防治为主，这不仅易造成环境污染，同时也危害着人类的健康。而免疫防治是从机体的免疫机制入手，利用机体自身的免疫系统来提高其抗病、抗逆和生存能力，不再继续依靠药物来防治病害，使水产动物更加健康环保，因此，水产动物的免疫防治是今后水产病害防治发展的方向。本文以三疣梭子蟹为研究对象，采用同源克隆和SMARTRACE技术
45、，对三疣梭子蟹的LGBP进行了基因克隆，并通过RTPCR方法检测了LGBP基因在三疣梭子蟹组织中的分布，研究结果不仅为三疣梭子蟹LGBP功能研究和其他后续研究打下了深厚的基础，同时也对探讨三疣梭子蟹的免疫防御机理以及促进三疣梭子蟹养殖业的健康发展具有重要的意义。182材料和方法21实验材料211实验用蟹实验所用三疣梭子蟹购自宁波市场，蟹体健康、活泼，肢体完好，体重13030G，购回后暂养于实验室水簇箱中。212主要试剂与药品EXTAQ，LATAQ，SMARTTMRACECDNAAMPLIFICATIONKIT，PRIMESCRIPTTM1STSTRANDCDNASYNTHSEISKIT，PMD
46、18T，UNIZOL试剂，UNLQ10柱式DNA胶回收试剂盒，MARKER2000，电泳琼脂糖，DEPC水，HEPES，无水乙醇、氯仿、异丙醇、EDTANA2、NACL、KCL、CACL2等。213菌株金黄色葡萄球菌SAUREUS、溶藻弧菌VALGINOLYTICUS、大肠杆菌DH5均取自于本校生命科学与生物工程学院水产动植物病害研究室。214引物本实验采用PRIMERPREMIER50软件设计LGBP基因克隆所需引物，以及根据其他生物ACTIN的保守区序列设计ACTIN的RTPCR引物，针对已获得的三疣梭子蟹LGBP基因CDNA序列设计特异性引物，具体引物及其序列如表1。表1LGBP基因克隆
47、所用引物及序列TAB1PRIMERSUSEDINTHECLONINGOFLGBPGENE引物PRIMER序列SEQUENCELGF1LGR1GSP31GSP32GSP51GSP52ADAPTOR5CCCGTGCATGATCTTCGA35ACTTCTGGTCGAAGGGCG35CCACCTTGTTCATAAAGCCGC35TACCTGGCGTGTAGACTGGACC35CGGTCGCATCCATAGTTCTGGTTGG35CGTGGCATCTTGGCCCGAACCTC35GGCCACGCGTCGACTAGTACT17319APM1347M13RVACTINFACTINRLRT1LRT25GGCC
48、ACGCGTCGACTAGTAC35CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC35GAGCGGATAACAATTTCACACAGG35CCTGACTGCCTACCTCACCAA35ATGCCGACAGATTCCATACCC35TTCGGAGACCCAGTCAACATC35TTTCAGCGATGCCGTCAGG3215主要仪器PCR仪，电泳仪，水平电泳槽，凝胶图像处理系统，超微量核酸蛋白测定仪，超高速分散机，高速冷冻离心机，微型离心机，三孔电热恒温水槽，电热恒温培养箱，全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅，电子天平等。22实验方法221菌株培养取溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5菌株接种于L
49、B培养基，37恒温培养24H备用。222细菌刺激实验选取健康三疣梭子蟹成蟹10只进行细菌刺激实验，实验用LB培养基活化的溶藻弧菌和金黄色葡萄球菌混合菌悬液，浓度均为107CELLSML1，注射量为20L，刺激6H后抽取蟹的血淋巴。223血细胞提取细菌刺激6H后，用无菌注射器（5ML）在梭子蟹的第三步足基关节处抽取蟹的血淋巴，将抽取到的血淋巴液与抗凝剂（EDTANA210MM，NACL450MM，KCL10MM，HEPES10MM）按11的比例混合均匀，并使用离心机，在4000R/MIN，4的条件下离心10MIN，得到血细胞的沉淀，保存在70冰箱中，用于总RNA的提取。224总RNA提取总RNA的提取采用上海博星公司的UNIZOL试剂盒，具体步骤按照说明书如下（1）每50100MG血细胞中加入1MLUNIZOL，用分散机彻底匀浆。（2）将匀浆液转移至10ML离心管中，12000RPM4C离心10MIN，以除去不溶性物质。（3）转移上清至另一离心管中，1530C放置5MIN以充分裂解核蛋白复合体。（4）每1MLUNIZOL中加入02ML氯仿，剧烈振荡15S后，在1530C放置3MIN，然后12000RPM4C离心15MIN。（5）转移上层水
