1、本科毕业论文系列开题报告生物技术基于分子印迹固相萃取技术的食品中氯霉素类抗生素检测技术研究一、选题的背景与意义氯霉素类抗生素是一种广谱抗菌药，开始因为其成本低、抗菌效果好而被广泛用于各种动物性疾病的防治。后应发现其对人类的健康存在很大的威胁，有很大的毒副作用，氯霉素能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症。长期微量摄入氯霉素会引起动物机体正常菌群失调，抵抗力下降，易感染各种疾病。所以全球很多国家都已禁止使用。在这压力下还是有一部分商家还在使用该类抗生素。而且其在食品中的含量是属于痕量，这对氯霉素类抗生素的检测技术就有这很大的要求。其检测技术在前处理上有很大的不足。传统的样品前处理如液液萃取、
2、索氏提取、固相萃取，存在使用大量溶剂、处理时间长、操作繁琐等缺点，而且选择性大多不是很高，选择性高的有价格昂贵，不便于大量检测，在整个分析过程中易出现误差。检测仪器都是贵重仪器，所以在整个检测过程中样品的前处理过程成为重点改进对象。而分子印迹固相萃取技术的出现成为了一大突破口，它是将模板分子和有适合官能团的功能单体相互作用，在交联剂和引发剂的作用下形成聚合物，通过溶剂洗脱解除去模板分子，聚合物中就留下了空间，这样的空间便可以与混合物中待分离的分析物进行可逆的特异性结合，从而达到分离、纯化、富集的目的。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1、获得针对氯霉素类抗生素特异的分子印迹聚合
3、物。2、将获得的分子印迹聚合物制备成分子印迹固相萃取小柱。3、氯霉素类分子印迹聚合物在实际样品中的应用（1）固相萃取条件的优化（2）样品处理上样/淋洗/洗脱。（3）建立虾样品中氯霉素类抗生素的基于分子印迹固相萃取技术的检测方法。解决的主要问题1、获得对氯霉素类抗生素特异的分子印迹聚合物；2、获得可高效分离纯化虾样品中氯霉素类抗生素的分子印迹固相萃取条件。三、研究的方法与技术路线研究方法采用本体聚合法合成对氯霉素类抗生素具有特异选择性和亲和性的分子印迹聚合物；并准确称取250MG的分子印迹聚合物，湿法装柱（3ML固相萃取小柱），填料的顶端和底端分别装有20M孔径的聚四氟乙烯筛板，制备成固相萃取小
4、柱；进一步通过对上样、淋洗和洗脱步骤的优化，结合分子印迹固相萃取技术和HPLC等方法，实现对虾样品中氯霉素类抗生素的高选择性、高灵敏性富集和检测方法。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年11月2010年12月1、实验前的准备工作查找资料，写开题报告。2、仪器、药品的准备和各种实验材料的准备。3、进行预试验。2010年12月2011年3月1、分子印迹聚合物的制备。2、分子印迹固相萃取柱的制备。特异性分子印迹聚合物的制备制备分子印迹固相萃取小柱固相萃取条件的优化上样淋洗洗脱洗脱物进行HPLC技术检测获得检测结果3、分子印迹固相萃取条件的优化。4、建立基于分子印迹固相萃取技术的氯霉素类抗生素的
5、检测方法。2010年3月2010年5月1、补充相关数据，整理试验结果。2、撰写论文。3、论文定稿。五、主要参考文献1陈鹏,罗晓琴氯霉素残留状况及检测方法J动物保健,2006,181041422陈眷华,彭羽氯霉素类抗生素药物对人类健康的威胁J贵州畜牧兽医,2006,30417183李秀萍,尉新华,孙艳霞浅谈氯霉素的危害与控制J中国动物检疫,2003,205184宋杰,宋燕青,王勇鑫,等微生物法在检测牛奶中氯霉素残留的应用J河北师范大学学报,2005,29185915戴华,王美玲,李拥军,等饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的HPLC测定方法J光谱实验室,2006,236120912126PI
6、LARV,NURIABDETERMINATIONOFCHLORAMPHENICOLRESIDUESINANIMALFEEDSBYLIQUIDCHLORAMPHENICOLINMILKJJASSOCOFFANALCHEM,1980,635104410487JACOBSONWC,ALLENEH,WISEMENHGDETERMINATIONOFCHLORAMPHENICOLINLIVER,KIDNEY,MUSCLE,ANDWHOLEBLOODJPRESENTEDAT88THANNUALMEETINGOFAOAC,1974,201014178彭莉,程江,高岚,等牛奶中氯霉素残留的气相色谱测定法研究J中
7、国兽药杂志,2006,40914179宫向红,徐英江,张秀珍水产品中氯霉素残留量气相色谱检测方法的探讨J食品科学,2006,27722222410钟惠英,杨家锋,徐开达气相色谱法定量分析水产品中的氯霉素CAP残留量J中国卫生检验杂志,2006,16218318511洪振涛,张卫锋,聂建荣,等气相色谱法测定动物组织中氯霉素的残留量J中国兽药杂志,2006,402141612周金慧,张素霞,沈建忠,等鸡组织中氯霉素残留的气相色谱微电子捕获检测方法研究J中国兽药杂志,2006,401161913李鹏,邱月明,蔡慧霞,等气相色谱质谱联用法测定动物组织中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素的残留量J色谱,200
8、6,241141814陈小霞,岳振峰,吉彩霓,等高效液相色谱电喷雾电离三级四极杆质谱测定鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的残留量J色谱,2005,231929515MASAHIKOT,SHIGEKID,TAKETOSHINDETERMINATIONOFCHLORAMPHENICOLRESIDUESINFISHMEATSBYLIQUIDCHROMATOGRAPHYATMOSPHERICPRESSUREPHOTOIONIZATIONMASSSPECTROMETRYJJOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,2003,101112677516郝俊虎,王仙琴,闰永利,等酶联免疫吸附法检测鸡肝
9、肾中氯霉素残留的分析J中国家禽学报,2004,81626417沈美芳,赵文亚,费志良,等用酶联免疫法测定水产品中氯霉素的残留量J南京师范大学学报工程技术版,2003,32L418倪梅林,章再婷,李佐卿虾仁中氯霉素残留量的放射免疫测定J中国卫生检验杂志,2006,16101266128019黄晓蓉,郑晶,杨方,等放射性受体免疫法分析方法快速筛选检烤鳗中氯霉素残J水产养殖2003,244L61820徐美奕,孟庆勇养殖对虾中氯霉素残留的放射免疫分析J水利渔业,2003,236L41521李余动,张少恩,吴志刚,等胶体金免疫层析法快速检测氯霉素残留J中国食品卫生杂志,2005,17541641922白
10、艳玲,陈剑刚,张彩虹,等水产品中氯霉素残留量测定方法的研究J中国卫生检验杂志,2005,15667267423潘莹宇,许茜,康学军,等高效液相色谱荧光检测法测定牛奶中氯霉素的残留量J色谱,2005,23657758024陈天豹,邓文汉,卢菀华,等毛细管电泳法检测蜜蜂中残留的抗生素J2001,191919325谢孟峡,刘媛,邱月明,等固相萃取气相色谱质谱测定动物组织中氯霉素的残留量J分析化学,2005,3311426CHRISTINASCHIRMER,HANSMEISELSYNTHESISOFAMOLECULARLYIMPRINTEDPOLYMERFORTHESELECTIVESOLIDPHAS
11、EEXTRACTIONOFCHLORAMPHENICOLFROMHONEYJJCHROMATOGRA,2006,11321325328毕业论文文献综述生物技术食品中氯霉素类抗生素的检测技术的研究摘要本文就分子印迹固相萃取技术、氯霉素类抗生素检测方法，包括微生物学法、高效液相色谱法、气相色谱法、色谱质谱连用法、放射免疫分析法、酶免疫分析法等做一概述。关键词氯霉素；检测；分子印迹固相萃取技术氯霉素最初是从委内瑞拉链丝菌的培养液中提取的，是一种有效的广谱抗生素。曾因其对多种病原菌的较强的抑菌作用而被广泛用于养殖业。后来人们逐渐发现其对人类有很大的毒、副作用，能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症
12、以及新生儿、早产儿灰色综合症等。长期微量摄入氯霉素会引起动物机体正常菌群失调，抵抗力下降，易感染各种疾病,许多国家已经相继禁止或严格限制使用氯霉素13，但由于氯霉素抑菌效果好，价格低廉，目前违法使用的现象还有发生，因此，建立高灵敏度、特异性强、简便易行而又经济的氯霉素残留的分析方法已经成为一项迫切的任务。1氯霉素类抗生素检测方法氯霉素分析检测方法的研究始于二十世纪七八十年代,到目前为止,国内外用于氯霉素检测的方法已近十几种,其中主要有微生物法、仪器分析法和免疫分析法等。下面进行对这些检测方法进行了综述。11微生物学法微生物学法的原理是利用特定菌株与药物的作用来检测样品中CAP的种类和含量。常用
13、于动物性食品兽药残留的初筛。有人用试纸法、棉签法、发酵法等微生物法来检测牛奶中氯霉素的残留,其中试纸法的灵敏度可达3G/L4。但是可以看出灵敏度不够高。还有人用用藤黄八叠球菌菌株作为对氯霉素的敏感菌对鱼肉组织中残留的氯霉素进行检测时的结果是检测限为025G/G，平均回收率为675。它的优点是操作简单、样品用量少、预处理简单、快速、费用低，适合大规模的定性筛选工作。缺点为灵敏度低、易漏检、结果一出现假阳性、检出限高。12高效液相色谱法HPLC高效液相色谱法检测氯霉素是一种灵敏度较高、可靠性较强的方法，此法重复性好、假阳性少，可以进行定量鉴定。其中灵敏的差异与其所连检测器的不同而不同。戴华等就曾用
14、HPLC法测定饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量5。而PILAR等在检测动物性食品中氯霉素残留实验时发现其检测限为07G/KG6。如果采用荧光检测器时，灵敏度就有所提升，邹月利在用该法测定奶中氯霉素残留量的实验中的方法检测限可达01G/L，回收率在9671027。它的优点是精确可靠、重复性好、灵敏度高、假阳性少。其缺点是处理过程复杂、耗时长、成本高、分析速度慢、回收率偏低，不适合用于大规模的样品检测。13气相色谱法GC氯霉素气相色谱检测法最早是在1974年AOAC会上由JACOBSON等人提出的7。目前气相色谱法分析氯霉素检测限一般在01G/KG左右812。在样品提取后衍生化在用氮吹干、定
15、容的方法进行气相色谱检测这方面存在着一定的争议，惠英等在其实验中发现衍生后不用氮吹干，而加大定容剂量，这样检测的结果更好10。它的优点是分离效能高、选择性高、灵敏度高和检测迅速。其缺点是繁琐的衍生步骤，仪器化程度高且价格贵，不适在基层推广使用。14色谱质谱联用法141液相色谱质谱联用GCMS已成熟的运用于分析食品中氯霉素类抗生素残留的检测，这类方法一般都用硅烷化试剂对残留物衍生，然后用不同的离子源使衍生物破碎成相应的离子进行定性和定量分析。实例李鹏等在用GCMS法检测动物组织中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素的残留量时其中氯霉素的检测限达到了003G/KG,回收率为80111513。此方法有一不足
16、就在于必须进行衍生反应。142液相色谱质谱联用LCMS是目前美国FDA推荐的氯霉素检测方法。它有着取代GCMS法的趋势。实例陈小霞等在用此方法测定鸡肉中氯霉素残留量时，检出限为10NG/KG14。MASAHIKO等也用此法检测了黄尾鱼和比目鱼鱼肉组织中的氯霉素含量15。15免疫分析方法免疫分析法是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合为基础,对新型动物性食品中氯霉素和甲砜霉素残留进行定量及半确证方法。151酶联免疫吸附测定ELISA其最低检测可达到002G/KG左右16,17,它的优点是简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强。其缺点是因抗体的批次不同检测结果存在细微的差异。152放射免疫测定R
17、IA它是使用以放射性同位素作标记的抗原或抗体，用Y射线探测仪或液体闪烁计数器测定。Y射线或B射线的放射性强度，来测定抗体或抗原量的技术。它的优点是检出限为1G/KG以上的氯霉素残留量能进行准确的定量1820。它的缺点是检测费用较昂贵、标记物易衰变性和一定的放射性污染。153金标试纸条法它是一种新型的速测技术，是单克隆技术和胶体金免疫层析技术交叉产物。实例徐余动等用此法对虾肉等组织中的氯霉素残留量进行了检测,灵敏度最低值可达到1NG/ML,只需510MIN,与类似物无交叉反应21。它的优点是简便易行、快速、试剂安全，特异性强、可单份测定、不需要特殊仪器和设备、更便于长期保存。多用于先现场检控22
18、。16其他分析方法161荧光分析法FIA实例潘莹宇等用FIA来测定牛奶中氯霉素的残留，其加标回收率为8187，相对标准偏差为398423。162超临界流体色谱SFC它弥补GC和HPLC的不足，但不可能取代二者。SFC优点是可以方便地连接各种灵敏的检测器MS，ECD等。163毛细管区域电泳CZE实例陈天豹等用CZE法检测蜂蜜中残留的抗生素实验中氯霉素时的检测极限为10G/L24。它的优点是简化样品前处理、多残留分析以及使分析自动化。其缺点是样品量太少，限制了检测的灵敏度。2分子印迹固相萃取技术在检测样品前处理的应用21介绍分子印迹和固相萃取食品检测中被检测的物质大多是痕量，易受干扰。所以样品前处
19、理是食品检测中的关键。211传统的方法它包括液液萃取、索式提取、固相萃取等25。这里就主要介绍固相萃取。固相萃取SPE是由液固萃取与柱液相色谱技术相结合的产物。它很好的将分离和浓缩合为一体，通过使用不同选择性溶剂与洗脱顺序来洗脱出杂质与目标物质，达到分离目的。根据填料不同可分为以正相吸附、反相吸附和离子交换吸附。传统的SPE的目标物与吸附剂之间的作用力是非特异性的，通常需对萃取和洗脱条件进行仔细选择，而且对不同基质的分离与分析物需要选择不同的柱填料。222分子印迹固相萃取技术它是分子印迹和固相萃取相结合的产物。它充分利用MIPS独特的选择性和亲和力。通过让模板分子和适合官能团的功能单体结合成分
20、子印迹聚合物，在通过合适的洗脱剂出去模板分子，聚合物中就留下了空穴。这个空穴就只有混合物中待测分离物进行可逆性特异性结合。实例CHRISTINA等检测蜂产品中的氯霉素时，用氯霉素为模板分子，甲基丙烯酸作功能单体，用乙二醇二甲基丙烯酸酯作交联剂、用偶氮二异丁腈为引发剂和氯仿为溶剂，于60度热引发24小时制得分子印迹聚合物，用该聚合物装填固相萃取柱对蜂产品中氯霉素进行富集，用RPHPLC定量检测，该方法对氯霉素的检测限能达01G/ML26。3展望就MISPE的应用在氯霉素类抗生素检测展望主要可以在功能单体与关联剂、聚合方法与印迹方法进行探索找出最优条件。找出适合氯霉素类抗生素检测的分子印迹聚合物。
21、寻找合适的上样溶剂、淋洗溶剂和洗脱溶剂。参考文献1陈鹏,罗晓琴氯霉素残留状况及检测方法J动物保健,2006,181041422陈眷华,彭羽氯霉素类抗生素药物对人类健康的威胁J贵州畜牧兽医,2006,30417183李秀萍,尉新华,孙艳霞浅谈氯霉素的危害与控制J中国动物检疫,2003,205184宋杰,宋燕青,王勇鑫,等微生物法在检测牛奶中氯霉素残留的应用J河北师范大学学报,2005,29185915戴华,王美玲,李拥军,等饲料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的HPLC测定方法J光谱实验室,2006,236120912126PILARV,NURIABDETERMINATIONOFCHLORAM
22、PHENICOLRESIDUESINANIMALFEEDSBYLIQUIDCHLORAMPHENICOLINMILKJJASSOCOFFANALCHEM,1980,635104410487JACOBSONWC,ALLENEH,WISEMENHGDETERMINATIONOFCHLORAMPHENICOLINLIVER,KIDNEY,MUSCLE,ANDWHOLEBLOODJPRESENTEDAT88THANNUALMEETINGOFAOAC,1974,201014178彭莉,程江,高岚,等牛奶中氯霉素残留的气相色谱测定法研究J中国兽药杂志,2006,40914179宫向红,徐英江,张秀珍水产品
23、中氯霉素残留量气相色谱检测方法的探讨J食品科学,2006,27722222410钟惠英,杨家锋,徐开达气相色谱法定量分析水产品中的氯霉素CAP残留量J中国卫生检验杂志,2006,16218318511洪振涛,张卫锋,聂建荣,等气相色谱法测定动物组织中氯霉素的残留量J中国兽药杂志,2006,402141612周金慧,张素霞,沈建忠,等鸡组织中氯霉素残留的气相色谱微电子捕获检测方法研究J中国兽药杂志,2006,401161913李鹏,邱月明,蔡慧霞,等气相色谱质谱联用法测定动物组织中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素的残留量J色谱,2006,241141814陈小霞,岳振峰,吉彩霓,等高效液相色谱电喷雾
24、电离三级四极杆质谱测定鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的残留量J色谱,2005,231929515MASAHIKOT,SHIGEKID,TAKETOSHINDETERMINATIONOFCHLORAMPHENICOLRESIDUESINFISHMEATSBYLIQUIDCHROMATOGRAPHYATMOSPHERICPRESSUREPHOTOIONIZATIONMASSSPECTROMETRYJJOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,2003,101112677516郝俊虎,王仙琴,闰永利,等酶联免疫吸附法检测鸡肝肾中氯霉素残留的分析J中国家禽学报,2004,81626417沈美
25、芳,赵文亚,费志良,等用酶联免疫法测定水产品中氯霉素的残留量J南京师范大学学报工程技术版,2003,32L418倪梅林,章再婷,李佐卿虾仁中氯霉素残留量的放射免疫测定J中国卫生检验杂志2006,16101266128019黄晓蓉,郑晶,杨方,等放射性受体免疫法分析方法快速筛选检烤鳗中氯霉素残J水产养殖,2003,244L61820徐美奕,孟庆勇养殖对虾中氯霉素残留的放射免疫分析J水利渔业,2003,236L41521李余动,张少恩,吴志刚,等胶体金免疫层析法快速检测氯霉素残留J中国食品卫生杂志,2005,17541641922白艳玲,陈剑刚,张彩虹,等水产品中氯霉素残留量测定方法的研究J中国卫
26、生检验杂志,2005,15667267423潘莹宇,许茜,康学军,等高效液相色谱荧光检测法测定牛奶中氯霉素的残留量J色谱,2005,23657758024陈天豹,邓文汉,卢菀华,等毛细管电泳法检测蜜蜂中残留的抗生素J2001,191919325谢孟峡,刘媛,邱月明,等固相萃取气相色谱质谱测定动物组织中氯霉素的残留量J分析化学,2005,3311426CHRISTINASEHIRMER,HANSMEISELSYNTHESISOFAMOLECULARLYIMPRINTEDPOLYMERFORTHESELECTIVESOLIDPHASEEXTRACTIONOFCHLORAMPHENICOLFROMH
27、ONEYJJOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,2006,11321325328本科毕业设计（20_届）基于分子印迹固相萃取技术的食品中氯霉素类抗生素检测技术研究目录中英文摘要1前言1311食品中氯霉素类抗生素的危害1312样品的前处理技术1313分子印迹聚合物的合成方式1314检测技术142材料和方法1421试剂1422分子印迹聚合物的制备1423分子印迹聚合物的色谱评价1524分子印迹固相萃取1525样品制备1626方法验证1627液相色谱法和质谱法163结果与讨论1731分子印迹聚合物的制备与评价1732分子印迹固相萃取条件的优化17321不同水分含量对色谱保留行为的影响17
28、322不同PH值对色谱保留行为的影响1833实际样品194结论22致谢错误未定义书签。参考文献23附录错误未定义书签。【摘要】以TAP为模板分子、DEAEM为功能单体、EGDMA为交联剂、AIBN为引发剂，用本体聚合法制备分子印迹聚合物，用色谱法对分子印迹聚合物的性能进行了评价，并对固相萃取的条件进行了优化，结果表明，基于该分子印迹聚合物建立的分子印迹固相萃取技术，结合LCMS/MS,，对虾样中氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素胺的回收率最高达988、984、987和978，极大的提高了氯霉素类抗生素的分离纯化速度和检测灵敏度。【关键词】分子印迹聚合物；固相萃取；LCMS/MS【ABST
29、RACT】THEMOLECULARLYIMPRINTEDPOLYMERSMIPSWEREPREPAREDUSINGTAPASTHEMIMICTEMPLATEMOLECULE,DEAEMASTHEFUNCTIONALMONOMER,EGDMAASTHECROSSLINKERANDAIBNASANDTHEINITIATORBYBULKPOLYMERIZATIONTHECHARACTERISTICSOFTHEMIPSWEREEVALUATEDBYLIQUIDCHROMATOGRAPHICANALYSISFURTHER,THECONDITIONSOFMOLECULARLYIMPRINTEDSOLIDP
30、HSEEXTRACTIONMISPEBASEDONTHEMIPSWEREOPTIMIZEDTHEMISPEWASSHOWNTOBEAPPLICABLEFORCLEANUPANDENRICHMENTOFCAP,FF,TAPANDFFAINSHRIMPSAMPLESWITHHIGHRECOVERIESOF988、984、987AND978,RESPECTIVELYTHERESULTSSHOWEDTHATTHEMATRIXINTERFERENCESCOULDBEALMOSTREMOVEDANDTHEEFFICIENCYANDSENSITIVITYOFTHEDEVELOPEDMETHODWEREHIG
31、HLYIMPROVED【KEYWORDS】MIPS；SOLIDPHASEEXTRACTION；LCMS/MS1前言11食品中氯霉素类抗生素的危害氯霉素类抗生素的成员有氯霉素（CHLORAMPHENICOL）、甲砜霉素（THIAMPHENICOL）和氟甲砜霉素（FLORFENICOL）。氯霉素（CAP）是一种由委内瑞拉链霉菌STREPTOMYCESVENEZUELA中分离提取的广谱抗生素。它能较强的抑制多种病原菌，所以氯霉素曾被广泛的应用在养殖业中，但经过大量的研究与临床应用人们发现氯霉素对人体和动物体的肝细胞、骨髓细胞有一定的毒副作用，它可以引起可逆性的骨髓抑制、不可逆的再生障碍性贫血和严重的
32、胃肠道反应、外周神经炎、二重感染、灰婴综合症，而且在对肉鸡和小白鼠的临床研究中发现他会引起其免疫抑制反应和遗传毒性13。氯霉素的残留问题引起了国家的高度重视。我国农业部规定在可食用动物的可食部分不得检出氯霉素，且氯霉素也了动物性食品日常检测的必检项目之一。2002年3月15日，被我国农业部关于发布食品动物禁用的兽药及其化合物清单列为禁止使用的抗生素。因为氯霉素巨大的毒副作用，人们开发了两种氯霉素的代替物，即甲砜霉素（TAP）和氟甲砜霉素FF。TAP和FF克服了CAP导致的再生障碍性贫血的缺点4。FF因其成本较高而仅仅应用于虾和鳗鱼等的高等海产品中，而TAP则被广泛用于实际生产中，养殖户的不合理
33、使用和违规滥用加剧了氯霉素类抗生素在动物机体内的残留量，对人类的健康造成了巨大的潜在威胁。12样品的前处理技术在实际样本检测时由于检测样多且复杂，含有多种干扰物质，对检测样的前处理就显得至关重要了。现有的样品的前处理的方法主要有液液萃取和固相萃取。这两种方法的回收率分别主要取决于实验员对液液萃取技术掌握的熟练程度和分析物的官能团和吸附剂之间的相互作用5。所以SPE较LLE有这更高的灵敏度，能更好的对样品进行富集。而SPE的灵敏度高低则与吸附剂的好坏有这密切的关系。分子印迹聚合物因具备与模板分子相配套大的结合位点和空穴而具有对模板分子的专一的识别能力，能进一步的提高固相萃取的对样品的富集效果6。
34、说以本次实验使用的预处理技术是分子印迹固相萃取技术。13分子印迹聚合物的合成方式分子印迹聚合物的合成方法主要是共价印迹方法、非共价印迹法和半共价法7。共价印迹方法也可以叫做预组装合成法。它的流程是这样的先把功能单体和模板分子反应合成模板复合功能单体，再在合适条件下反应生成聚合物，把聚合物研磨至粉末状，用适当的溶剂除去模板分子，最终制得所需的分子印迹聚合物。该方法中模板分子和功能单体间的作用力主要是共价键。其合成聚合物的优点是立体结构稳定，萃取特异性比其他制备法要高。缺点是要制备模板复合功能单体，有些模板分子是找不到合适的方法合成该模板复合功能单体的。目前很少在固相萃取中使用。非共价印迹法也可叫
35、做自组装方法，该流程为按照一定比例混合模板分子、功能单体、交联剂和引发剂，模板分子通过非共价作用力与功能单体和交联剂发生作用合成分子自组装体，后面的流程大致与第一种方法相同。因为该方法是直接将各成分直接混合聚合的，所以该方法适用范围广、模板分子较易除去。因非共价的分子间作用力较弱，在聚合反应时往往都是加过量的功能单体，这就严重影响了萃取时的非特异性吸附，降低了萃取的选择性。该方法有时会出现“模板渗漏”的现象，即用溶剂处理合成的聚合物颗粒时，很难把其中的模板分子完全洗净，当用该分子模板聚合物萃取范围为PGNG/ML的样品时，会造成严重的误差。解决此问题的方法的方法是采用替代模板聚合法，即用分析物
36、的类似物替代分析物做模板制备分子印记聚合物，最后再用色谱法把分析物和它的类似物分开。这样就能避免“模板渗漏”的干扰。半共价法的流程是模板分子共价结合功能单体，再加入交联剂和引发剂进行聚合反应，通过破坏共价键来洗脱待测物分子8。该方法在萃取时，分子印记聚合物和待测物之间仅仅依靠非共价相互作用结合。此方法的优点是；聚合物结构更加完整、结合位点的均一性更好、萃取能力更强和萃取容量更大。能从根本上解决“模板渗漏”的影响。14检测技术近几年，国内外的研究者提出了很多食品中氯霉素类抗生素残留的的检测技术。如微生物学法9、免疫分析法1015、气相色谱法（GC）16、高效液相色谱法（HPLC）17、色谱质谱联
37、用法18等。其中色谱质谱联用法中的LCMS/MS法最好，它有这高的灵敏度，能够满足痕量氯霉素类抗生素的定性和定量分析，但是该方法并易普及，因为该方法的进本品的纯度有很高的要求，即前处理的要求很高，并且仪器价格很昂贵。微生物法的优点为简单经济，缺点为操作耗时、缺乏特异性和灵敏度不高。酶联免疫法的优点在于高灵敏度、高特异性、样品预处理简单、成本低和无需复杂的仪器设备，缺点是假阳性、不能进行定性，一般要用色谱方法来进行确定。放射免疫法的（RIA）的优点在于高灵敏度、强特异性、低检测限量和操作简单等，缺点是发射性物质量较大、耗材贵、同位素半衰期短等。气相色谱法不足之处在于前处理过程复杂、分析慢、仪器化
38、程度高、谱图中干扰峰多等。单纯的液相色谱已经不能满足现今世界氯霉素低检测限的要求。还有一些新兴的检测技术，如超流体色谱（SFC）、毛细管区域电泳（CZE）19等。SFC的优点在于能方便地连接各种灵敏的检测器。CZE的优点是高速、高分辨率、多残留分析和分析自动化。2材料和方法21试剂模板分子甲砜霉素（TAP）和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）是购自FLNKA公司STEINHEIM,USA。氟甲砜霉素（FF）和氯霉素（CAP）都是从SIGMAALDRICH公司STEINHEIM,GERMANY购买的。功能单体甲基丙烯酸二乙胺基乙酯DEAEM是购自SIGMAALDRICH公司。引发剂2,2偶
39、氮二异丁腈（AIBN）是从中国医药集团总公司（上海，中国）购买的。HPLC级的乙腈和甲醇都是购自美国的飞世尔科技公司。所有其它试剂均为分析纯。双蒸水和超纯水都是由本地的供应商提供的。22分子印迹聚合物的制备聚合物是由相似物模板分子TAP和功能单体DEAEM制备。分子印迹聚合物的制备工作如下简要的说，1MMOL模板TAP和相应数量功能单体DEAEM（表2）溶解于50ML的乙腈中。溶解后再加入25MMOL交联剂EGDMA和引发剂AIBN1W/W,总单体，然后这个混合物用氮气清洗5MIN和超声波震荡10MIN。最后，70水浴中用氮气封管光照24H,制的的聚合物进行研磨和筛选，用丙酮沉降除去残留的细微
40、颗粒，收集直径2550M的颗粒，然后将这些粉末置于索式提取器上，后用甲醇甲酸91,V/V不断提取，直到用HPLCUV分析时没有发现TAP为止，然后将聚合物装进100ML的固相萃取柱中。然后用甲醇去除去残留的甲酸，再在50真空中干燥8H。空白聚合物的合成除不加模板分子外，其余方法同上。23分子印迹聚合物的色谱评价分子印迹聚合物性能的测试方法主要有3种，即电势测定法、高效液相色谱分析和傅氏变换红外光谱法和核磁共振法。电势测定法是运用流动电位的原理，通过记录用印迹分子溶液洗涤过的装有印迹聚合物的流通池的两端的电位变化来评价分子印迹聚合物对其印迹分子的选择性的好坏。傅氏变换红外光谱法和核磁共振法因洗脱
41、印迹分子后印迹聚合物内留有与印迹分子相互作用的结构单元而在实际生产中应用的不多。高效液相色谱分析则是最常用的检测技术。它是通过最后显示的图像来确定MIPS对印迹分子是否具有选择性以及选择性的大小。本次实验用的是高效液相色谱分析。高效液相色谱HPLC系统是由LC6A泵、紫外检测器、20L进样器和色谱柱等组成。色谱评价要看的数据分别是保留因子（K）、印迹因子（IF）、保留指数（RI）和选择性因子（）。保留因子的计算公式为TT0/T0，其中T是分析物在色谱柱上的保留时间，TO是死时间即分析物在空白色谱柱上的保留时间。印迹因子是通过KMIP与KNIP的比来衡量的，其中KMIP是分析物在MIPS色谱柱上
42、的保留因子，KNIP是分析物在NIPS色谱柱上的保留因子；保留指数是通过NIP与MIP的比来衡量的；选择性因子就是K1与K2的比，K1为CAP的保留因子，K2为TAP和FF的保留因子。24分子印迹固相萃取分子印迹固相萃取的第一种操作方式为通过使用MIPS从萃取非极性有机溶剂那里萃取分析物。MIPS的分子识别能力和吸附萃取时的溶剂有很大的关系。只有在固相萃取的上样液与合成聚合物时的溶剂相同时，它的分子识别能力选择性最强。对于水基样品的萃取，人们采用一下的方法萃取先用非极性有机溶剂从水样中萃取分析物，此次萃取过程中主要是因疏水性作用的不同来进行萃取的。所以在这些有机溶剂中还含有许多其他的干扰物，再
43、把这些有机萃取液通过分子印记聚合物柱，这样就能分别洗脱出干扰物和分析物来以便后来的检测。第二种操作方式是直接用分子印迹聚合物萃取水样此时分析物和其它干扰物质都发生了吸附萃取。在该步中，萃取的主要作用力是疏水性作用，因此该步是没有选择性。为了提高选择性，就要在第一步的萃取后，用合适溶剂对分子印迹聚合物柱进行洗脱，洗脱目的是除去由疏水性作用造成的干扰，在洗脱中，目标分析物因与分子印迹聚合物之间的特异性亲合力保留在聚合物柱上，然后再合适溶剂把分析物洗脱下来。该方法比较适合大体积水样的萃取检测第三种操作方式是分子印迹固相萃取脉冲洗脱分析物。用合适的流动相上样过柱，在通过质子极性溶剂产生的快递的脉冲式洗
44、涤洗脱分析物。在线微分脉冲洗脱方式是这样进行的先采用非质子性极性溶剂以脉冲方式洗脱干净非选择性吸附的干扰物质，再用质子性极性溶剂以脉冲方式洗脱分析物以用于检测。将悬浮在乙腈中的25MG的MIPS和NIPS分别加入到10ML的固相萃取柱中。再萃取前，萃取柱先后用10ML甲醇甲酸91,V/V，5ML甲醇洗涤和用5ML的上样溶剂预处理。含有XG/MLCAP,FF和TAP的10ML的水加入到萃取柱中。在色谱分析评估的基础上对淋洗和洗脱步骤的条件进行优化。淋洗液是13ML含10乙腈的PBS缓冲液PH4,浓度，洗脱步骤用3ML的甲醇甲酸91,V/V在低于05ML/MIN流速下洗脱，洗脱液要在40C下用氮气
45、吹干，其残留物要再溶于10ML的色谱分析的流动相中。25样品制备虾样是从当地市场购买的并用LCESIMS/MS法确认不含有可检测出的CAP、FF、TAP和FFA。称50G的搅碎的虾样于50ML的离心管中，加内标准溶液CAPD5到浓度10G/KG。样品在涡旋振荡器上振荡30S，再静止2H，再向虾样中加入20ML乙腈，涡旋振荡2MIN，超声波振荡15MIN，再在离心力为50103G离心10MIN。上清液转移到100ML的梨形瓶中，沉淀物再用10ML乙腈重复一次，上清液吸取合并在20C冰冻保存2H，在离心力50103G下离心10MIN。上清液用旋转蒸发仪在50真空下蒸干，残留物在悬浮于5ML的10甲
46、醇水中。对分子印记固相萃取柱相继用10ML甲醇甲酸液（90/10，V/V）和5ML甲醇活化，再用2ML水、3ML乙腈水（1090，V/V）淋洗分子印记固相萃取小柱，真空处理10MIN以去除残留溶剂，再用1ML己烷淋洗小柱，同样真空处理10MIN以去除残留溶剂，纯化的萃取物用3ML甲醇洗脱出来，洗脱物在40下用氮气蒸干以便LCMS/MS分析。26方法验证该方法通过以下参数验证线性关系和线性范围、精确度、特异性、灵敏性、日内检测精度和日间检测精度、检出限（LOD）和定量限（LOQ）20。CAP的校准曲线是用CAP浓度（015、03、045、10、20G/KG）与相应浓度的分析物内标峰面积的比构建的
47、。TAP、FF和FFA的校准曲线是分别用TAP、FF和FFA浓度（15、30、45、10、20G/KG）与相应浓度的分析物内标峰面积的比构建的，该方法的日内检测精度和日间检测精度用同天内的五个重复和连续五天的重复来计算。这方法的准确度和精确度是分别通过在三份分析中三个标准水平015、03、045G/KGCAP，15、30、45G/KGTAP、FF和FFA下的回收率和相对标准偏差来决定的。检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别是由信噪比3和10决定的。27液相色谱法和质谱法超高性能的LCMS/MS系统由配备XEVO四级杆质谱仪的高效液相色谱系统构成。进样体积是5L而且色谱分析分别是用MIPS色谱
48、圆柱和NIPS色谱圆柱100MM21MM内直径,17M颗粒大小在40下进行。质谱仪是分别是在毛细管电压35KV和33KV下的阳性和阴性喷雾模式下进行。离子源和脱溶剂化的温度分别是125C和450C。脱溶剂的气体是氮气，碰撞诱导解离气体是氩气。气体的脱溶和雾化是分别在流速为800和50L/H的氮气下进行的。在碰撞室，氩气在30103MBAR压力下被用做碰撞气体。信号的捕捉是用多离子反应监测来进行的。每个样品要加入两次分别在阳性和阴性离子化下进行分析。其它的参数如表1所示。表1目标化合物UPLCMS/MS的参数ESIMODETIMEMINA2B2FLOWRATEL/MIN9550359010005
49、014595065145955035169550402025955020流动相A2乙腈水595,V/V含03V/V氨气，B2乙腈含03V/V氨气3结果与讨论31分子印迹聚合物的制备与评价图1CAP、FF和TAP的化学结构式表2合成分子印迹聚合物的性能评估（印迹因子IF）AMOUNTMMOLIFTEMPLATEDEAEMEDMACAPTAPFFMIPS1325146159156NIPSNONE325TAP持有两个相同的游离羟基，这些羟基和化学结构对分子与分子印迹聚合物中的结合腔的特异性相互作用是至关重要的。TAP和FF的结构类似于CAP，唯一的不同在于TAP的SO2CH3取替了NO2，FF的F取替了OH，而且SO2CH3有这比NO2更大的空间结构。所以，本实验为了克服这些不足是用TAP作为模板用本体聚合的方法合成分子印迹聚合物的。对制备的分子印迹聚合物的初步评估是以乙腈为流动相的色谱分析来进行研究的。查阅文献得知功能单体与模板TAP的最佳比为13时，印迹聚合物对TAP、FF和CAP的最高的印迹效应，其印迹因子正如表2所示，从表看出本实验制的的聚合物对TAP和FF有这相似的印迹效果和识别选择性。这就说明了TAP和FF在结构上还是很相似的，而CAP的IF值和TAP有这一定的距离
