1、本科毕业设计（20_届）萝卜豆芽汁培养乳酸菌条件的优化所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录引言11材料和方法211实验材料2111菌种2112萝卜与豆芽汁的制备2113培养基2114溶液和试剂2115仪器312乳酸菌生长的条件优化3121萝卜与豆芽汁比例对乳酸菌培养的影响3122温度对培养乳酸菌的影响3123培养基初始PH培养乳酸菌的影响3124最适培养条件正交试验32结果与分析421乳酸菌培养的条件4211萝卜与豆芽汁比例对乳酸菌培养的影响4212温度对乳酸菌生长的影响4213培养基初始PH乳酸菌生长的影响5214正交试验优化培养条件结果63讨论7致谢错误未定义书
2、签。摘要目的本文对萝卜豆芽汁培养乳酸菌条件优化，以期得出乳酸菌的最佳培养条件。方法利用单因素法和正交试验法对培养条件进行了优化，并用可见分光光度计对培养液测量。结果在培养条件优化中，单因素法确定了乳酸菌最适培养条件为温度35，PH70，萝卜豆芽汁为15；正交设计法确定了乳酸菌最适培养条件为度35，PH70，萝卜豆芽汁为15。关键词乳酸菌；条件优化；萝卜；豆芽ABSTRACTOBJECTIVEOPTIMIZATIONOFCULTURECONDITIONSOFLACTICACIDBACTERIAWITHRADISHBEANSPROUTSJUICEWERESTUDIED,INORDERTOGETTH
3、EBESTOPTIMIZATIONOFCULTURECONDITIONSOFLACTICACIDBACTERIAMETHODSTHROUGHSINGLEFACTORANDORTHOGONALTEST,OPTIMIZATIONOFCULTURECONDITIONSOFLACTICACIDBACTERIAWERESTUDIEDANDNUTRIENTSOLUTIONWASMEASUREDBYUSINGSPECTROPHOTOMETERRESULTSINOPTIMIZATIONOFCULTURECONDITIONS,SINGLEFACTORDETERMINEDTHEOPTIMALCONDITIONSF
4、ORLACTICACIDBACTERIATEMPERATURE35,PH70,CARROTJUICEBEANSPROUTSJUICE15,WHILEORTHOGONALTESTDETERMINEDTHEOPTIMALCONDITIONSFORLACTICACIDBACTERIATEMPERATURE35,PH70,CARROTJUICEBEANSPROUTSJUICE15KEYWORDSLACTOBACILLUSCONDITIONSOPTIMIZATIONTURNIPBEANSPROUTS1引言凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌都统称为乳酸菌。这是一群十分庞杂的细菌，目前至少可分为
5、18个属，共有200多种。除了极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的而且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。乳酸菌大体上可以分为两大类。一类是动物源乳酸菌，一类是植物源乳酸菌1。因为动物源取自于动物，因菌种常处于相对不稳定的状态，其生物功效也不是很稳定，且在大量食用的同时，很容易导致人体动物蛋白过敏，即排斥反应。而植物源乳酸菌，因为取自植物易被人体认可，不论摄取多大的量，人体不会产生异体蛋白排斥反应，且植物源乳酸菌比动物源者更具有活力，能比动物源多8倍的数量到达人体小肠内定植，从而发挥其强大而稳定的生物功效。乳酸菌均归类于乳酸菌科2。这些细菌形态上差异颇大，既有长杆状或短杆状
6、的，又有圆形的；所有种类都是革兰氏阳性菌，不形成芽孢，也不会运动（有例外）。它们从碳水化合物得到能量，分泌乳酸。是专性发酵菌。乳酸菌能够在空气或氧气下生长，它们是厌氧菌，但是耐氧的。一方面乳酸菌的生长需要辅助因子，他们大多需要某些维生素（核黄素、硫胺素、泛酸、烟酸、叶酸、生物素）、氨基酸、嘌呤和嘧啶3。另一方面乳酸菌具有大部分微生物所没有的利用乳糖的能力。乳酸细菌在自然界的分布与他们的特殊营养要求和能量产生类型（完全通过发酵）有关。土壤和水中几乎从未发现过它们。乳酸菌按其发酵葡萄糖仅仅产生乳酸还是有附加产物而分为同型发酵菌和异型发酵菌两种类型。同型乳酸发酵同型发酵乳酸菌通过糖酵解途径产生纯的或
7、差不多（90）纯的乳酸。C6H12O62CH3CHOHCOOH异型乳酸发酵异型乳酸发酵菌缺乏果糖二磷酸途径的关键酶醛缩酶和丙糖磷酸异构酶。因此葡萄糖的起始降解完全是通过戊糖磷酸途径，根据产物不同，又分为2种类型（1）明串珠菌按下式发酵葡萄糖C6H12O6CH3CHOHCOOHCH3CH2OHCO2（2）双歧杆菌按下式发酵葡萄糖2C6H12O62CH3CHOHCOOH3CH3COOH乳酸菌的应用历史非常悠久,但真正科学地研究和利用始于19世纪中叶。食品级乳酸菌的优良特性已引起食品微生物界的注意,在对其生理作用进行深入研究的同时,它在食品方面的应用亦越来越广泛。目前,乳酸菌已广泛应用于乳制品、肉制
8、品、蔬菜制品、软饮料等食品中49,随着浓缩、冷冻干燥等相应技术的发展,乳酸菌与人们的生活的关系将越来越密切。乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且，近年来乳酸菌的特殊生理活性和营养功能，正日益引起人们的重视。大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用1011。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动
9、息息相关。可以说，如果乳酸菌停止生长，人和动物就很难健康生存。也正因为如此，乳酸菌被广泛用于轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业上1215。乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。益生菌能够帮助消化，有助人体肠脏的健康，因此常被视为健康食品，添加在酸奶之内。在人体肠道内栖息着数百种的细菌，其数量超过百万亿个。其中对人体健康有益的叫益生菌，以乳酸菌、双歧杆菌等为代表，对人体健康有害的叫有害菌，以大肠杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌等为代表。益生菌是一个庞大的菌群，有害菌也是一个不小的菌群，当益生菌占优势时（占总数的80以上），人体则保持健康状态，否则处于亚健2
10、康或非健康状态。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它们数量的多和少，直接影响到人的健康与否，直接影响到人的寿命长短，科学家长期研究的结果证明，乳酸菌对人的健康与长寿非常重要。而人体肠道内乳酸菌拥有的数量，随着人的年龄增长会逐渐减少，当人到老年或生病时，乳酸菌数量可能下降100至1000倍，直到老年人临终完全消失。在平时，健康人比病人多50倍，长寿老人比普通老人多60倍。因此，人体内乳酸菌数量的实际状况，已经成为检验人们是否健康长寿的重要指标。现在，由于广谱和强力的抗菌素的广泛应用，使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏，抵抗力逐步下
11、降，导致疾病越治越多，健康受到极大的威胁。所以，有意增加人体肠道内乳酸菌的数量就显得非常重要。目前国际上公认的乳酸菌，被认为是最安全的菌种，也是最具代表性的肠内益生菌，人体肠道内以乳酸菌为代表的益生菌数量越多越好。也完全符合诺贝尔得奖者生物学家梅契尼柯夫“长寿学说”里所得出的结论，乳酸菌益生菌长寿菌。人类面对抗生素的日渐无能为力的现状，正在不断寻求新的更加有效的生物抗菌产品，世界发达国家首先认识并开创了以使用乳酸菌为代表的免疫疗法革命。瑞典科学家研究发布的结果是，治疗胃和大肠炎症时直接喝乳酸菌比用抗生素更好，危险性几乎为零。而在日本，乳酸菌制品已占日本乳制品市场的85以上，二十年来日本青年平均
12、身高增加15厘米，人口平均寿命达85岁，居世界第一位。这都是乳酸菌制品所带来的直接健康功效。其实普通的乳酸菌，活力极弱，它们只能在相对受限制的环境中存活，一但脱离这些环境，其自身也会遭到灭亡。只有经过特殊工艺处理的乳酸菌才能到达肠道。进入肠内的乳酸菌，必须具备数量多、活力强，才能发挥其生物功效。如何研制出高浓度且活力强的乳酸菌，成为了当今微生学家们追求的梦想。本试验从温度、PH值、萝卜豆芽汁比例这三个方面探讨乳酸菌的培养条件1623，以期得到乳酸菌的最适培养条件。1材料和方法11实验材料111菌种MRS培养基蛋白胨10G，酵母提取物5G，葡萄糖20G，柠檬酸二铵2G，硫酸镁058G，牛肉膏10
13、G，磷酸氢二钾2G，碳酸钙20G，硫酸锰025G，乙酸钠5G，吐温801ML，蒸馏水1000ML，PH6264，121灭菌15MIN。固体培养基需加入琼脂粉15G将挑选的菌种接种到MRS斜面并在30恒温培养，待菌落丰满时，4保藏备用。112萝卜与豆芽汁的制备将豆打浆后，先用4层纱布过滤；滤液煮沸20MIN，再次过滤后，即制得澄清透明的豆芽汁；新鲜青萝卜洗净、去皮、切块、打浆，4层纱布过滤，3000R/MIN离心5MIN取上清液，置于4冰箱中保存。113培养基将萝卜与豆芽汁按试验所需的比例混合，调配成不同的PH，121灭菌20MIN。114溶液和试剂调PH用的酸碱溶液1）1MOL/L的氢氧化钠溶
14、液称取氢氧化钠400G，用蒸馏水溶解并定容至1000ML即可。2）01MOL/L的氢氧化钠溶液31MOL/L的氢氧化钠溶液10ML蒸馏水90ML3）1MOL/L的盐酸溶液吸取36的浓盐酸862ML，用蒸馏水溶解并定容至1000ML，得到1MOL/L的盐酸溶液。4）01MOL/L的盐酸溶液1MOL/L的盐酸溶液10ML蒸馏水90ML5）PH40的标准溶液（实验室）115仪器新型电热恒温鼓风干燥箱宁波江南仪器厂SL502电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司ACCULABALC2103电子天平ACSULAB公司PHS25型显数PH计上海民桥精密科学仪器有限公司LRH190S微电脑控制恒温恒湿培养箱广
15、东省医疗器械厂DNP9162型新型电热恒温培养箱宁波江南仪器厂SPX型智能生化培养箱宁波江南仪器厂T6新悦型可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司LDZX40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂TDL5台式低数大容量离心机江苏金坛市医疗仪器厂JX2168金熊食品加工机福州金熊电器有限公司移液枪（10L、100L、200L、1000L）其他仪器超净工作台，电冰箱，培养皿等12乳酸菌生长的条件优化121萝卜与豆芽汁比例对乳酸菌培养的影响萝卜与豆汁分别以15、110、115的比例混合，调PH为70，121灭菌20MIN，冷却后接种，在35下培养，培养14H后，稀释5倍，以各自的空白
16、培养基调零，测波长620NM处的OD值来确定最佳比例。122温度对培养乳酸菌的影响以上面确定的萝卜与豆芽汁比例配制，调PH为70，121灭菌20MIN，冷却后接种，分别在30、35、40下培养，培养14H后，稀释5倍，以各自的空白培养基调零，测波长620NM的OD值来确定最佳温度。123培养基初始PH培养乳酸菌的影响以上面确定的萝卜与豆芽汁比例配制，分别调PH为65、70、75，121灭菌20MIN，冷却后接种，在上面确定的温度下培养，培养14H后，稀释5倍，以各自的空白培养基调零，测波长620NM的OD值来确定最佳PH。124最适培养条件正交试验对萝卜与豆芽汁比例、温度、PH进行正交试验，由
17、于不考虑交互作用，选用正交表L934安排实验，用可见分光光度计测波长620NM的OD值来选择最佳培养条件。4表1正交试验因素水平表TAB1ORTHOGONALTESTFACTORLEVELTABLE编号A萝卜汁豆芽汁VVB培养温度/C初始PH值111513016521235270313403754211012522362317311513832193322结果与分析21乳酸菌培养的条件211萝卜与豆芽汁比例对乳酸菌培养的影响碳源对微生物生长代谢的作用主要为提供细胞的碳架，提供细胞生命活动所需的能量，提供合成产物的碳架。在制作微生物培养基或细胞培养基时有重要的作用，为微生物或细胞的正常生长，分裂
18、提供物质基础。微生物生长和产物合成需要氮源。氮源主要用于菌体细胞物质氨基酸、蛋白质、核酸等和含氮代谢物的合成。培养基中使用的氮源可分为两大类有机氮源和无机氮源。常用的无机氮源包括各种铵盐、硝酸盐和氨水等。常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、蛋白胨、麸皮、废菌丝体等。由于青萝卜富含淀粉，豆芽富含蛋白质，两者混合后可为菌体生长提供相对充足的碳源和氮源。通过培养基中萝卜与豆芽汁比例的不同，我们可以得出最适乳酸菌生长的碳源和氮源的比例。由表2可知，当只考虑萝卜与豆芽汁比例对乳酸菌生长的影响时，萝卜与豆芽汁比例为15时，乳酸菌生长最好。但从表2中，我们也可以看出萝
19、卜与豆芽汁比例对乳酸菌生长的影响不是很大。表2萝卜豆芽汁比例对乳酸菌培养的影响TAB2CARROTJUICEOFBEANSPROUTSTHEINFLUENCEOFPROPORTIONOFLACTICACIDBACTERIACULTIVATION212温度对乳酸菌生长的影响温度对微生物的影响是十分广泛的，改变温度一定会影响微生物体内所进行的许多生物化学反应，从而对微生物的各种生理特性的表达产生影响。一方面，在一定范围内随着温度的上升，酶活性提高，细胞的生物化学反应速度和生长速度加快，一般温度每升高10，生化反应速率增加一倍，同时营养物质和代萝卜豆芽汁比例15110115OD值0077000300
20、72000400700035谢产物的溶解度提高，细胞膜的流动性增大，有利于营养物质的吸收和代谢产物的排出；另一方面，机体的重要组成，如核酸、蛋白质等对温度较敏感，随着温度的升高可遭受不可逆的破坏。每一种微生物都有自己的生物温度区，包括最低生长温度和最高生长温度以及最适生长温度，最适生长温度可以刺激生长，不适的温度可能会改变微生物的形态、代谢、毒力等，严重的会导致死亡。由试验结果发现，温度乳酸菌生长的影响还是很大，温度在3040之间，乳酸菌都可以生长，35为该乳酸菌的最适生长温度。温度在35之前时，该乳酸菌的生长随温度的增长而加快，在35之后时，则随温度的增长而减缓。图1温度对乳酸菌生长的影响F
21、IG1THEINFLUENCEOFTEMPERATUREONTHELACTICACIDBACTERIAGROWTH213培养基初始PH乳酸菌生长的影响PH对微生物的生命活动有很大的影响，主要通过几个方面实现一是使蛋白质、核酸等生物大分子所带电荷发生变化，从而影响其生物活性；二是引起细胞膜电荷变化，导致微生物细胞吸收营养物质能力改变；其三是改变环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性。不同微生物对PH条件的要求各不相同，它们只能在一定的PH范围内生长，这个PH范围有宽、有窄，而其生长最适PH常限于一个较窄的范围，对PH条件的不同要求在一定程度上反映出微生物对环境的适应能力。微生物的正常生长需要最适
22、PH值，当环境中的PH值超过或低于其适于生长的PH值范围时，微生物的生长就会受到抑制。从图2中，我们可以看出不同的培养基初始PH对乳酸菌生长是有影响的，PH在6570时，乳酸菌生长随PH的增长而加快，当PH在7075时，乳酸菌生长随PH的增长反而减缓，PH为70时，乳酸菌生长达到最大。6图2培养基初始PH乳酸菌生长的影响FIG2THEINFLUENCEOFINITIALPHFORLACTICACIDBACTERIAGROWTH214正交试验优化培养条件结果营养丰富而平衡的培养基是微生物良好生长的必备条件。培养基是微生物测定的基础，培养基的质量因而成了保证微生物实验成功的关键。极差R越大，说明该
23、因子的水平变动时，试验结果的变动越大，即该因子对试验结果的影响越大，由表3极差分析结果可知，决定因子的主次顺序为温度蔬菜汁比例初始PH值。根据直观分析图（图3）确定试验的最适组合为A1B2C2，即萝卜汁豆芽汁为15，温度35和初始PH值为70。表3种子培养条件L934正交试验设计及结果分析TAB3DESIGNSANDRESULTSANALYSISOFORTHOGONALTESTL934ONTHESEEDCULTIVATION编号A萝卜汁豆芽汁VVB培养温度/C初始PH值OD620NM11151301650065212352700077313403750058421101200655223006
24、962310051731151300578321006993320049K1006700620062K2006200720063K3005800530061极差R0007001900027图3种子培养条件正交试验L934结果直观分析图FIG3ANALYSISOFTHEORTHOGONALTESTL934ONTHESEEDCULTIVATION3讨论乳酸菌的应用十分广泛，国际市场上乳酸发酵制成的产品，是农业、纺织、化工、医药等行业的重要原料，此外还有乳酸菌饮料、酸奶、酱油等举不胜举。近年来，人们逐渐认识到乳酸菌的生理功能极其对人体健康的作用，使乳酸菌在食品和医药等方面具有广阔的应用前景。因此，大
25、规模的乳酸菌培养，成为了各个研究所的研究目标。而经过了这么多年的研究，乳酸菌的培养方法已经很多了。在田洪涛等人的研究中表明，MRS培养基中添加质量分数为50啤酒液、质量分数为03玉米浆、质量分数为75番茄汁、质量分数为1乳糖，在37下培养24H的嗜热链球菌活菌数较对照提高了40倍。在乳酸菌的培养过程中，通过追加营养物质、排除代谢产物、调节PH值等措施，解除代谢产物乳酸对细胞的抑制作用，延长乳酸菌对数生长期，以获得高浓度的细胞培养物，主要有化学中和法在培养的过程中向培养液加入缓冲盐，使培养液的酸度在一定范围内；膜渗析法向乳酸菌培养液中不断加入营养物质，代谢产物通过膜除去。膜渗析法是目前国内外最先
26、进的方法，但该法对膜材料和操作技术要求很高。在缓冲盐法浓缩培养研究领域中，美国和意大利处于领先水平，但其配方保密。本试验选择了人们常见蔬菜价格较低的萝卜及产量较大的豆芽作为原料，对乳酸菌培养条件优化。在本试验条件下，通过单因素试验，可以得出乳酸菌生长的最适萝卜与豆芽汁比例为15，温度为35，PH为70。而通过正交试验，乳酸菌最适生长条件为萝卜豆芽汁15，温度35，PH70。并且在正交试验中，根据极差的分析，决定因子的主次顺序为温度蔬菜汁比例初始PH值。K1K2K38参考文献1孟祥晨,杜鹏,李艾黎等乳酸菌与乳品发酵剂M科学出版社,2009452施安辉,周波乳酸菌分类、生理特性及在食品酿造工业中的
27、应用J中国调味品,2001,2511383刘屹峰乳酸菌的生理特性和生物学功能J丹东纺专学报,2002,63584罗富英,李再峰等浓缩鲜荔枝果汁乳酸菌饮料的研制J食品工业科技,2006,271245赵玉红,张立钢,庞伟娜乳酸菌和酵母菌共生发酵面包的研究J食品工业科技,2003,24361626林燕文,王茂先等具养颜功效的乳酸菌发酵型泡菜工艺条件研究J食品科技,2006,25225317梁明月活乳酸菌乳饮料的研究J食品科学,2002,3683143168吴祖兴乳酸菌在发酵香肠中的应用研究J食品工业科技,2002,23855579赵玲艳,邓放明,杨抚林乳酸菌的生理功能及其在发酵果蔬中的应用J中国食品
28、添加剂,2004,345565910刘丽莉,董铁有等6种乳酸菌降解胆固醇的体外试验J河南科技大学学报,2005,266858811陆晓娜,杨海燕等新疆马奶酒中降胆固醇乳酸菌的筛选及性状研究J农产品加工,2006,91323912冯金晓,薛长湖,徐莹等响应面法优化PROTEASEM酶解牡蛎工艺的研究J食品科技,2009,34518419513敬思群优质乳酸菌的应用J中国乳业,2002,366182014岳春,初峰,侯振建液态法生产食醋工艺研究J食品工业科技,2005,26311311515吴定,邹耀洪,王云等固定化酶生产低聚异麦芽糖工艺研究J食品科学,2005,26312512716吕加平,于景
29、华等乳酸菌发酵剂优良菌种的选育J中国乳品工业,2002,505495217段宇珩,谈重芳,王雁萍等乳酸菌鉴定方法在食品工业中的应用研究进展J食品工业科技,2007,28424224418汤保贵,欧柱荣,徐中等乳酸菌培养条件的优化J饲料研究,2007,498263119WANMENGMU,CHAOCHEN,XINGFENGLIOPTIMIZATIONOFCULTUREMEDIUMFORTHEPRODUCTIONOFPHENYLLACTICACIDBYLACTOBACILLUSSPSK007BIORESOURCETECHNOLOGY10020091366137020SLLIEW,ABARIFFOP
30、TIMIZATIONOFMEDIUMCOMPOSITIONFORTHEPRODUCTIONOFAPROBIOTICMICROORGANISM,LACTOBACILLUSRHAMNOSUS,USINGRESPONSESURFACEMETHODOLOGYINTERNATIONALJOURNALOFFOODMICROBIOLOGY102200513714221田洪涛,贾英民等嗜热链球菌促生长物质研究及增殖培养基优化筛选J食品科学,2002,105606222洪新,唐克耐酸性淀粉酶产生菌发酵条件的优化J中国畜牧兽医,2009,2501131923金志雄,毛达勇,张珍,王金勇产淀粉酶菌株液体培养条件的探讨J环境科学与技术,2006,9022329
