1、本科毕业设计（20_届）菊酯类农药分子印迹固相萃取柱的制备及条件优化所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录中英文摘要1引言12实验部分221试剂与仪器2211实验试剂2212实验仪器222实验方法2221分子印迹聚合物的制备2222分子印迹固相萃取柱的制备223吸附容量的测定224分子印迹固相萃取条件225气相色谱条件23结果与讨论331分子印迹聚合物的吸附容量及选择性332固相萃取条件的优化54小结65展望6致谢7参考文献82摘要菊酯类农药的广泛使用，导致食品中该类农药残留，对人类健康造成巨大威胁。本论文首先对分别以氯氰菊酯和溴氰菊酯为模板分子制备获得的分子印迹聚
2、合物进行吸附特性研究，结果表明以氯氰菊酯为模板分子获得的分子印迹聚合物（CMIPS）的SCATCHARD曲线和以溴氰菊酯为模板分子获得的分子印迹聚合物（XMIPS）的SCATCHARD曲线都为两条斜率不同的直线，并且具有较好的线性相关性，表明获得的分子印迹聚合物具有两类不同的结合位点；进一步将获得的分子印迹聚合物作为固相萃取的填料，结果表明，以CMIPS作为填料，并用浓度为20的乙腈溶液淋洗进行固相萃取时菊酯类农药具有最高的回收率。关键词分子印迹聚合物；结合位点；气相色谱；固相萃取ABSTRACTPYRETHROIDPESTICIDESHAVEBEENWIDELYUSEDATPRESENT,W
3、HILEONTHEOTHERHAND,ITSRESIDUEHASALSOATTRACTEDMUCHATTENTIONTHEMAINPURPOSEOFTHISSTUDYISTOPREPARETHEMOLECULARLYIMPRINTEDPOLYMERFORPYRETHROIDINSECTICIDESANDEVALUATETHECHARACTERISTICSOFTHEOBTAINEDMIPSTHERESULTSSHOWTHATMIPSHAVEHIGHERADSORPTIONCAPACITYTHANTHOSDOFNIPSTHEFUNCTIONALGROUPSANDSPATIALSTRUCTUREAR
4、EOBVIOUSDIFFERENCESINMIPSANDNIPSTHESCATCHARDCURVEOFCMIPSANDXMIPSISTWOSTRAIGHTLINEOFDIFFERENTSLOPEWITHAGOODLINEARRELATIONSHIP,WHICHINDICATESTHATTHEREARETWOTYPESOFBINDINGSITESFURTHERMORE,THEPYRETHROIDPESTICIDESHAVETHEHIGHESTRECOVERIESWHENCMIPSWEREUSEDASTHESORBENTSOFTHESOLIDPHASEEXTRACTIONUNDERTHE20ACE
5、TONITRILEINWATERASTHEWASHINGSOLUTIONKEYWORDSMOLECULARIMPRINTEDPOLYMERBINDINGSITESGASCHROMATOGRAPHYSOLIDPHASEEXTRACTION11引言菊酯类农药是继有机氯、有机磷和氨基甲酸酯之后具有生物活性优异、环境相容性较好的一类广谱性杀虫剂，包括甲氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、联苯菊酯等。菊酯类农药具有性质稳定、使用浓度低、用药量少、使用浓度低、毒性较低、药效快等优点，因此被广泛使用。但是菊酯类农药广泛使用的同时也带来了环境污染和食品安全等方面的问题12。特别是近年来，随着人们生活水平越来
6、越高，对食品安全问题也越来越重视，故对农药最高残留限量的要求也越来越严格。联合国食品法典委员会（FAO/WHO）对食品中的农药残留量作了十分严格的规定。因此，我们有必要建立一套准确、高效、快速的测定菊酯类农药残留的方法。传统的农药残留前处理技术如提取、净化等，有索氏提取、液液分配、薄层层析、柱层析等方法，但这些方法存在样品需要量大、萃取时间长、有机或有毒溶剂消耗量大等缺点3。目前国内外对菊酯类农药的残留分析方法有色谱法46、免疫分析法7、萃取法等。但是气相色谱检测和液相色谱检测，都存在仪器比较昂贵等缺点，而且还不能进行现场在线检测或跟踪监测；免疫分析法有特异性强、准确度和灵敏度高等优点，但是它
7、所需的仪器价格同样比较昂贵，而且只能用于对单一化合物或者结构相似的化合物进行检测8。萃取技术主要有超声波萃取（USE）、加速溶剂萃取（ASE）、液相微萃取（LPME）等技术，具有速度快、溶剂用量少、回收率高等优点，而且容易实现自动化。净化技术有凝胶渗透色谱（GPC）、固相微萃取（SPME）、固相萃取（SPE）等，它们具有效率高、速度快、对环境友好等特点。固相微萃取由PAWLISZYN等推出，该方法简单，提取和富集过程比较快，是一种被广泛接受和应用的技术9。尤其是固相萃取具有有机溶剂用量少、回收率和富集倍数高、对环境友好、操作简单方便、易于收集、能够处理小体积样品和容易实现自动化等诸多优点，目前
8、已成为最常用的样品前处理方法之一10。固相萃取（SOLIDPHASEEXTRACTION，简称SPE）是从20世纪70年代初发展起来发展起来一种用途广泛而且越来越受欢迎的样品前处理技术。固相萃取技术是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来。固相萃取一般包括五个步骤，包括选择吸附柱、活化吸附柱、进样、淋洗、洗脱。按照操作方式的不同，固相萃取可分为离线萃取和在线萃取；按照所选吸附剂的不同，固相萃取可分为正相、反相和离子交换固相萃取11。目前，SPE主要用来处理液体样品，萃取、浓缩和净化其中的半挥发性和不挥发性化合物，有时也可用于固体样品，但是必须把
9、固体样品先处理成液体。1962年，ANTONAH等人首次对该技术进行了研究，用吸附剂氧化铝净化样品11。吸附剂是固相萃取中的关键环节，所选吸附剂的好坏直接关系到是否能够实现萃取以及萃取率的高低，现在对新型吸附剂的研制非常热门。分子印迹技术（MOLECULARIMPRINTINGTECHNIQUE，MIT）是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子（模板分子）完全匹配的聚合物的实验制备技术12。“分子印迹”的概念最早可以追溯到PAULING提出的以抗原为模板合成抗体的设想，现代意义上的分子印迹概念则出现在20世纪70年代，其标志是WULF和MOSBACH等分别在共价和非共价型分子印迹聚合物研究方
10、面开创性研究13。自20世纪70年代以来，分子印迹技术发展非常迅猛，特别是1993年MOSBACH等14在NATURE上发表了有关茶碱分子印迹聚合物的报道后，分子印迹技术开始蓬勃发展，成为国内外研究的热点15。分子印迹聚合物（MIPS）是人工合成的聚合物，具有易于制备、成本低、稳定性好、选择性好、使用寿命长和应用范围广等优点，因此，以分子印迹聚合物作为固相萃取的吸附剂可以提高萃取的选择性和SPE用于痕量分析的准确性、降低检测限。自从SELLERGREN于1994年将MIPS用于戊脒的固相萃取16以后，基于MIPS的固相萃取（MISPE）技术已广泛应用于色谱分离、膜分离、临床药物分析和固液萃取等
11、领域，在分析传感技术方面也有较大的发展。MIPS制备的基本原理是，在适当的溶剂中，经交联剂作用，模板分子与一种或几种功能单体形成含有模板分子的聚合物母体，然后通过物理或化学方法除去母体中的模板分子，最终得到分子印迹聚合物。总的来说，分子印迹技术可视为是模板分子与功能单体相互作用聚合的过程17。根据模板分子与单体结合方式的不同，分子印迹技术可以分为非共价法、共价法和半共价法18。目前，MIPS制备方法的研究主要聚集在这两方面，一是改善聚合物材料性能，这是进行大规模生产和应用所必须的；二是在水溶液体系中2进行分子印迹，以这样可以使水溶性分子尤其是生物大分子也可以进行分子印迹，扩大分子印迹技术的应用
12、范围。分子印迹聚合物使用较多的制备方法是传统方法，其次是悬浮聚合法、多步溶胀法、表面印迹法和原位聚合法等19。分子印迹聚合物的合成过程中，关键是要考虑选择与印迹分子（模板分子）尽可能有特异结合的单体，然后选择适当的交联剂和溶剂20。本实验对以溴氰菊酯或氯氰菊酯为模板分子制备获得的MIPS为填料制成分子印迹固相萃取柱，并与以NIPS为填料制成的高效萃取柱进行比较，探讨它们的吸附特征，测定它们的吸附容量。同时，通过在不同的填料和不同的淋洗条件下进行固相萃取实验，对它们的回收率进行比较后优化固相萃取条件。2实验部分21试剂与仪器211实验试剂溴氰菊酯，氯氰菊酯，氟氯氰菊酯，氰戊菊酯，苯醚菊酯和联苯菊
13、酯；甲基丙烯酸（MAA，德国SIGMAALDRICH公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，美国FLUKA公司）；2，2偶氮（2异丁腈）（引发剂，上海中国医药集团总公司）；乙腈和甲醇（色谱纯，美国FISHERSCIENTIFIC公司）。所有其他试剂均为分析纯。212实验仪器超声波清洗仪（SK5200H），涡旋混合器（XW80A）；HHS型水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；氮气吹干仪（HGC12A，上海）；DDHZ300恒温振荡器（江苏太仓市试验设备厂）；电子天平（SHIMADZU，日本）；GC2010型气相色谱仪（日本岛津）。22实验方法221分子印迹聚合物的制备MIPS通过本体聚合法合成
14、，溴氰菊酯或氯氰菊酯（1MMOL）和功能单体（MAA，4MMOL）溶解在乙腈（100ML）中，然后加入交联剂单体（EGDMA，20MMOL）和引发剂（AIBN,900MG）。超声混匀，充入氮气10MIN，然后置于60水浴中24H，聚合后，用研钵将聚合物研碎，过50M筛。进一步用丙酮沉降，除去过细的悬浮粉末，模板分子用甲醇/甲酸（91，V/V）洗至GCECD检测不到模板分子。然后用甲醇去除残留甲酸。空白聚合物的制备除了没有模板分子外，其余操作同上。222分子印迹固相萃取柱的制备准确称取300MG的MIPS和NIPS，加入20ML甲醇，湿法装入30ML固相萃取小柱，填料的顶端和底端分别装有20M孔
15、径的聚四氟乙烯筛板，然后用50ML甲醇预处理。23吸附容量的测定分子印迹聚合物和非分子印迹聚合物的吸附容量通过多次实验测得。在结合分析时，准确称取150MG聚合物颗粒加入到含有15ML乙腈溶液的小瓶中，在菊酯类农药为025到1000MGL1不同浓度下，温度为25，温育24H。然后通过过滤法除去聚合物，在氮吹下蒸干，再用05ML异辛烷/丙酮（91，V/V）重新溶解，用GCECD法进行分析。在每个浓度下重复进行三次，取平均值用于SCATCHARD分析。SCATCHARD方程为B/RESBMAXB/KD，KD为结合位点的解离常数，BMAX为最大表观结合量，RES为平衡浓度。以B/RES对B作图，根据
16、斜率和截距计算得到KD和BMAX。24分子印迹固相萃取条件分子印迹固相萃取柱的制备时取300MGMIPS和NIPS，装填入30ML的固相萃取小柱（SUPELCO，美国）。首先，在上样前，固相萃取柱先后用100ML乙腈和20ML20的乙腈溶液进行预处理。然后，用30ML乙腈/甲酸（91，V/V）进行洗脱。最后，洗脱组分用氮气吹干，并用10ML异辛烷/丙酮（91，V/V）重新溶解，通过022M尼龙过滤器过滤后供以后用GCECD法分析。25气相色谱条件样品用GCECD法进行分析，本实验用GC2010型气相色谱仪（日本岛津），SPB5石英弹性毛细管柱（30M025MM025M）；氮气分别作为载气和尾吹
17、气，流速为10MLMIN1；标准溶液和样品提取液进3样体积为1L；进样口温度为240；柱温为240，维持3MIN，然后以5MIN1升至290，保持5MIN；检测器温度为320。3结果与讨论31分子印迹聚合物的吸附容量及选择性分子印迹聚合物是人工合成的含有分子识别位点的聚合物，在适当的溶剂下能特异性的识别结合模板分子和相关结构的化合物。我们可以选择合适的模板合成分子印迹聚合物，并用其来识别与模板分子有类似核心结构的分析物。菊酯类农药都有一个共同的化学结构环丙烷羧酸，不同点在大小和侧链的形状，如图1所示，为6种菊酯类农药的化学结构。在这个实验中，用氯氰菊酯和溴氰菊酯进行试验来选择合适的模板合成分子
18、印迹聚合物，并且通过进一步的实验对分子印迹聚合物的吸附特性进行研究。图16种菊酯类农药的化学结构4图2拟除虫菊酯类农药分子印迹聚合物的吸附等温线及SCATCHARD曲线分析A以氯氰菊酯为模板合成的分子印迹聚合物的吸附等温线（CMIPS）；B以溴氰菊酯为模板合成的分子印迹聚合物的吸附等温线（XMIPS）；CCMIPS的SCATCHARD曲线；DXMIPS的SCATCHARD曲线如图2所示溴氰菊酯或氯氰菊酯为模板合成的MIPS对不同浓度的溴氰菊酯或氯氰菊酯的吸附容量呈非线性关系，而且吸附容量随着体系中其浓度的的增大而增大，并且在高浓度下吸附容量逐渐趋于饱和，这表明MIPS对溴氰菊酯或氯氰菊酯的结合
19、位点是不等价的。在浓度相同的条件下，与NIPS相比，MIPS具有更大的吸附容量，表明MIPS和NIPS的功能基团排列与空间结构有着比较大差异，MIPS具有与模板分子互补的功能基团和空间结构，因此对模板分子有着更大的吸附能力；而对于NIPS而言其内部可能没有选择性的结合位点，主要依靠聚合物表面的非特异性吸附作用，无法对模板分子进行有效的识别，因此吸附量较小。CMIPS的SCATCHARD曲线和XMIPS的SCATCHARD曲线都是为两条斜率不同的直线，并且具有较好的线性相关性，这表明在所研究的浓度范围内MIPS存在着两种不同类型的特异性结合位点。表1分子印迹聚合物的SCATCHARD方程分析结果
20、5高亲和性位点低亲和性位点KDMOLL1BMAXMOLG1KDMOLL1BMAXMOLG1CMIPS3389730666663266XMIPS1555319416661795从表1可知，CMIPS在高亲和性位点的解离常数为3389MOLL1，最大表观结合量为730MOLG1；在低亲和性位点的解离常数为66666MOLL1，最大表观结合量为3266MOLG1。XMIPS在高亲和性位点的解离常数为1555MOLL1，最大表观结合量为319MOLG1；在低亲和性位点的解离常数为41666MOLL1，最大表观结合量为1795MOLG1。32固相萃取条件的优化固相萃取过程一般包括上样、淋洗、洗脱等过程。
21、由于样品基质复杂，在萃取过程中有许多干扰物质与分离物质一起被吸附，这样就会对测定结果的准确度产生较大影响。所以必须使用适当的溶剂对固相萃取过程进行淋洗，除去干扰物质，但不能洗脱分离物质。6图3不同淋洗条件下MISPE和NISPE柱的菊酯类农药的回收率A以正己烷作为淋洗溶液时6种菊酯类农药的回收率；BXMIPS为填料，在不同浓度的乙腈水溶液作为淋洗溶液时6种菊酯类农药的回收率；CCMIPS为填料，在不同浓度的乙腈溶液作为淋洗溶液时6种菊酯类农药的回收率；D对照组如图3所示，在不同的淋洗条件下，固相萃取菊酯类农药的回收率。图3A为用正己烷作为淋洗溶液，以CMIPS为填料时的菊酯类农药回收率最高；以
22、XMIPS为填料时的菊酯类农药回收率次之；以NIPS为填料时的菊酯类农药回收率最低。图3B所示，以XMIPS为填料进行固相萃取时，当用40的乙腈溶液作为淋洗溶液时，菊酯类农药的回收率最高。图3C所示，以CMIPS为填料进行固相萃取时，当用20的乙腈溶液作为淋洗溶液时，菊酯类农药的回收率最高。图3D所示，以NIPS为填料进行固相萃取时，当用10的乙腈溶液作为淋洗溶液时，菊酯类农药的回收率最高。可知，乙腈溶液作为淋洗溶液的效果比正己烷好，以CMIPS作为填料时回收率最高。4小结本实验对采用本体聚合方式获得的分子印迹聚合物作为填料制成分子印迹固相萃取柱进行萃取，并与NIPS为填料的固相萃取进行比较研
23、究；进一步对固相萃取条件进行了优化。结果表明在相同浓度下，MIPS比NIPS有更大的吸附容量，MIPS更适合作为填料进行固相萃取。在MIPS中，又以CMIPS作为固相萃取填料，并用浓度为20的乙腈溶液淋洗进行固相萃取时菊酯类农药的回收率最高，可与GCECD仪器相结合，对复杂生物样品中的菊酯类农药进行检测。5展望分子印迹聚合物极大地提高了固相萃取的选择性，使样品的前处理更加简便。不过该技术也存在诸多7的不足，如上样溶剂对吸附能力的影响较大，在水溶液中的选择性比较差，分子印迹萃取剂的种类有限等。对于分子印迹固相萃取技术的发展前景，它的趋势应在以下几个方面（1）研制新型的分子印迹固相萃取剂。（2）开
24、发出更多更好的功能单体和交联剂，采用不同的方法拓宽分子印迹固相萃取的应用领域。3将分子印迹固相萃取与其他分离检测方法如毛细管电泳、免疫分析、生物传感器等结合起来。（4）加强与其它样品前处理技术如气相色谱等相互融合。参考文献1王丹红,蔡春平,陈祥明,等分光光度法检测茶叶中含氰根菊酯类的农药残留J福建分析测试,2010,19173752王英健气相色谱法测定土壤中菊酯类农药残留J环境监测管理与技术,2010,22255573孙成玲,汪付星,颜冬云,等拟除虫菊酯类农药残留检测前处理技术研究进展J农药,2010,49111154汤峰,岳永德,花日茂,等板兰根中三种拟除虫菊酯杀虫剂的残留分析J农药学学报,
25、2001,3169725孔祥虹,仇农学,李建华,等毛细管气相色谱法测定中药材中多种拟除虫菊醋农药残留量J分析实验室,2005,25489926高天兵,张曙明,田金改三七、白芍及西洋参中氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的残留量测定J药物分析杂志,1999,1953133167刘曙照九十年代农药残留分析新技术J农药,1998,37611138王朝瑾,李彦磊,王文豪,等菊酯类农药残留的快速测定J湖南农业科学,2010,22171739GIZELLECRISTINABEDENDO,EDUARDOCARASEKSIMULTANEOUSLIQUIDLIQUIDMICROEXTRACTIONANDPOLYPRO
26、PYLENEMICROPOROUSMEMBRANESOLIDPHASEEXTRACTIONOFORGANOCHLORINEPESTICIDESINWATER,TOMATOANDSTRAWBERRYSAMPLESJJOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,2010,1217171310蔡亚岐,牟世芬分子印迹固相萃取及其应用J分析测试学报,2005,24511612111赵利剑,杨亚玲,夏静固相萃取技术的研究J四川化工,2005,83212512马玉哲,李红霞分子印迹技术的应用进展J化工技术与开发,2009,384202213蔡亚岐,牟世芬分子印迹固相萃取及其应用J分析测试学报,2005,
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28、BELTRAN,PAGCORMACK,FBORRULL,ETALSYNTHETICAPPROACHESTOPARABENSMOLECULARLYIMPRINTEDPOLYMERSANDTHEIRAPPLICATIONSTOTHESOLIDPHASEEXTRACTIONOFRIVERWATERSAMPLESJANALYTICACHIMICAACTA,2010,6771727818CAROE,MARCERM,BORRULLF,ETA1APPLICATIONOFMOLECULARLYIMPRINTEDPOLYMERSTOSOLIDPHASEEXTRACTIONOFCOMPOUNDSFROMENVIRONMENTALANDBIOLOGICALSAMPLESJTRENDSINANALYTICALCHEMISTRY,2006,25214315419孟范平,刘娇分子印迹聚合物及其在固相萃取中的应用J中国海洋大学报,2008,38223724320马挺军,贾昌喜分子印迹技术在农药残留检测应用的研究进展J农产品加工,2009,892932
