1、本科毕业设计（20_届）纳米ZNO对斑马鱼肝和鳃组织结构的影响所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月I目录摘要（ABSTRACT）1引言311概述312纳米氧化锌简介313研究现状314研究目的42材料和方法321试验材料4211试验动物4211试剂和仪器422慢性毒性试验错误未定义书签。221染毒条件错误未定义书签。222样品制备错误未定义书签。3结果531行为观察532对照组鱼的鳃结构533处理组鱼的鳃结构变化434肝结构变化54讨论641纳米氧化锌斑马鱼鳃结构的影响642纳米氧化锌斑马鱼肝结构的影响843纳米氧化锌对斑马鱼的毒性机理75总结9致谢9参考文献10附录1
2、12摘要采用浓度为0、100、560、1120MGL1的纳米ZNO悬浮液对斑马鱼BRACHYDANIORERIO进行30D的暴露实验，研究了纳米ZNO对斑马鱼鳃、肝结构的影响。HE染色显示在100MGL1的纳米ZNO悬浮液暴露下，受试鱼未发现有受到毒性作用；在560MGL1的纳米ZNO悬浮液暴露下，受试鱼的鳃受到损伤，受试鱼还发生鳃丝上皮增厚、鳃小片上皮隆起现象，在1120MGL1鳃小片明显的出现水肿，此外，较高浓度的纳米ZNO悬浮液暴露会造成斑马鱼的肝组织损伤，560MGL1的纳米ZNO悬浮液暴露下，受试鱼的肝细胞发生肿大，胞质产生空泡，肝细胞变得不规则，细胞核萎缩变形和偏离细胞中心，112
3、0MGL1的纳米ZNO悬浮液暴露下部分肝细胞空泡化程度加重，发生核溶解或细胞溶解，造成局部肝组织坏死。表明水环境中纳米ZNO悬浮液浓度达到100MGL1未发现对斑马鱼的鳃、肝产生毒性作用；而纳米ZNO悬浮液浓度达到560和1120MGL1时，受试鱼的鳃、肝将受到较严重的损伤；伴随纳米ZNO悬浮液浓度的升高，鱼的鳃、肝损伤加重。关键词纳米氧化锌；斑马鱼；肝；鳃；生物毒性ABSTRACTINTHISSTUDY,BRACHYDANIORERIOWASEXPOSEDTOTHREECONCENTRATIONSOFNZNO0,10AND560MGL1FOR30DAYS,ANDTHEHISTOPATHOLO
4、GICALEFFECTSOFNZNOONBRERIOGILLANDLIVERWEREEXAMINEDUNDERLIGHTMICROSCOPETHERESULTSSHOWEDTHATAT10MGL1OFNZNO,THEREHAVENOTFOUNDANYEFFECTONBRERIOBUTAT56MGL1OFNZNO,THEMOSTCOMMONCHANGESOFBRERIOGILLWEREEPITHELIALHYPERTROPHY,BESIDEAT1120MGL1OFNZNOGILLLAMELLAEOBVIOUSEDEMATHETHICKENINGOFFILAMENTEPITHELIUMANDTHE
5、LIFTINGOFLAMELLAREPITHELIUMWERETHEOTHERHISTOPATHOLOGICALEFFECTSOF56MGL1NZNOINADDITION,THEHIGHERCONCENTRATIONOFNANOZNOSUSPENSIONSEXPOSURECANCAUSELIVERDAMAGEINZEBRAFISHAFTEREXPOSURETO56MGL1NANOZNOFOR30DAYS,THESHAPEOFHEPATOCYTESWASIRREGULAR,SOMENUCLEIWEREATROPHYANDDEFORMATIONORINALATERALPOSITIONCLOSETO
6、THECELLMEMBRANE,ANDAT1120MGL1OFNZNO,HEPATOCYTESWEREHIGHLYVACUOLATED,ANDFOCALNECROSISOCCURREDAFTERCYTOLYSISANDKARYOLYSIS10MGL1OFNZNOHASNOTFOUNDTOXICEFFECTONBRERIOGILLANDLIVERBUTTHEDAMAGEWASFOUNDWHENEXPOSEDTO560AND1120MGL1OFNZNOTHEIMPAIRMENTOFBRERIOGILLANDLIVERWASINCREASEDWITHINCREASINGPHENANTHRENECON
7、CENTRATIONKEYWORDSNZNOBRACHYDANIORERIOGILLLIVERTOXICEFECT31引言11概述纳米材料是指粒子尺度为纳米级水平且具有特殊性能的材料。当物质尺度为1100NM109107M时，由于量子效应、巨大的表面与界面效应等效应，使物质的一些性质、性能发生了质变，产生了宏观物质所不具备的特殊性。因为其特殊性，纳米粒子在化学、材料、生物、医学等领域有着广泛的应用，引发了一场“新的工业革命”1。随着纳米材料的广泛运用潜在的负面影响也已引起人们的广泛关注。20032004年，SCIENCE等先后发表文章讨论纳米材料与生物环境相互作用可能产生的生物效应问题2。美国
8、化学会以及欧洲许多学术杂志也纷纷对纳米生物环境效应问题进行调研。该报告建议英国政府成立专门研究纳米生物环境效应与安全性的研究中心3。2004年，欧共体在布鲁塞尔公布了“欧洲纳米战略”，把研究纳米生物环境健康效应问题列在欧洲纳米发展战略的第三位。同时，欧洲宣布启动“NANOSAFETINTEGRAIRNGPROJECTS”计划，全面开展纳米生物效应与安全性的研究2。2001年，中国科学院高能物理研究所提出“开展纳米生物效应、毒性与安全性研究”，2004年对原有的纳米生物、稀土金属与重金属毒理和有机卤素的生物效应与毒理学研究组进行整合，成立了“纳米生物效应实验室”，与国内外有关研究组织合作，系统开
9、展纳米物质生物效应的研究，已获得了一批研究成果3。目前，国内研究重点是纳米物质整体生物学效应以及对生理功能的影响、纳米物质的细胞生物学效应及其机制以及大气纳米颗粒对人体作用和影响等领域的研究。12纳米氧化锌纳米氧化锌是一种粒径大小约在1100纳米的多功能新型无机材料。由于粒子纳米化，纳米氧化锌粒子的表面电子结构和晶体结构发生变化，产生了表面效应、体积效应、量子尺寸效应和宏观隧道效应等效应，以及高透明度、高分散性等宏观物体所不具备的特点。近年来发现它在催化、光学、磁学、力学等方面展现出许多特殊功能，使其在陶瓷、化工、电子、光学、生物、医药等许多领域有重要的应用价值45，其特殊性和用途是普通氧化锌
10、所无法比较的。在纺织领域中，纳米氧化锌可作为紫外光遮蔽材料、抗菌剂、荧光材料、光催化材料等。由于纳米氧化锌的特性和广泛的应用前景，因此许多科技人员将纳米氧化锌的研发设为焦点。目前纳米氧化锌的制备技术已经取得了一些突破，在国内形成了几家产业化生产厂家。13研究现状随着纳米氧化锌用途越来越广泛和用量越来越大，不可避免的会通过各种途径流入水体进入环境6，但目前极少关于纳米粒子在环境浓度的数据，但有很多知识已经存在证明纳米氧化锌粒子对生物系统的的影响。据估计，一旦纳米粒子进入水体，他们将最有可能聚集成沉积物和悬浮微粒物。悬浮粒子对鱼类影响较大，聚集粒子一般不移动，并可以互相影响滤食性和泥沙居生物。聚集
11、程度受PH值，离子强度，以及电解质的性质等影响。目前在金属氧化物纳米颗粒大部分研究都集中在其抗菌和抑菌的应用程序或人类健康的影响，很少有研究探讨其潜在生态毒性7。ADAMS8用细菌革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性芽孢杆菌作为两个模型比较了纳米TIO2，ZNO和SIO2的悬浮纳米的生态毒性。这项研究表明，ZNO纳米材料对枯草芽孢杆菌毒性最强，斑马鱼胚胎实验表明了类似的结果纳米4氧化锌超过二氧化钛或纳米氧化铝颗粒毒性9。很多知识已经存在证明氧化锌纳米粒子对生物系统的的影响。纳米氧化锌的光诱导，氧化还原活性，从而在其表面具有潜在活性氧簇（ROS）。纳米氧化锌已被证明产生的紫外光照射下生成活性氧或在无紫
12、外线下消失10。对纳米氧化锌等金属纳米粒子毒性的确切机制在很大程度上是未知的，但最近的研究表明，纳米颗粒的毒性，与一般颗粒大小，形状和表面特性性能有关。有一篇最新报道关于纳米氧化锌生态毒性11，用水生生物，藻类，淡水无脊椎动物和鱼类等作为实验对象。在藻类，无脊椎动物和鱼类的测试中，淡水无脊椎动物，是目前存在研究数据最多的种类，其次是藻类，最后是淡水鱼。其他纳米颗粒生物群体之间的观察分布数据也大致相似。14研究目的虽然越来越多的关于纳米毒性信息相继变得可用，因为研究已经进行数量有限，且在水生物种类少，就环境毒理学方面有关的所有粒子来说，一个重要的知识差距依然存在令人满意的风险评估无法执行。鱼类等
13、水生生物对水体环境的变化反应十分灵敏，而且水体中的有毒物质能通过食物链在生物体内积累并随着生物等级的提高而积累，而且由于体内蓄积得毒物会影响鱼类正常的生理机能。近年来，随着工农业的快速发展，大量的废物及污染物在环境中通过降尘、地表径流、降雨等途径进入水体，而且现在纳米材料因为对其生态毒性研究的不足并未受到监管的重视，其潜在危害日益严重，已经成为生态环境中待解决的前沿课题。斑马鱼BRACHYDANIORERIO或DANIORERIO，是一种小型热带鱼。由于产卵量大、易收集、饲养简单等特点，是国际标准化组织ISO推荐使用的鱼类毒性试验动物国家环保局，1990。现已成为一些生态毒理标准如OECD和I
14、SO标准的推荐测试物种。此外，斑马鱼也是研究发育生物学、分子遗传学等的理想模型，用途十分广泛。由于其在生态毒理学上的广泛应用，选择以斑马鱼作为本课题的受试生物具有一定的代表性和可参考性。为了填补信息差距，我们以斑马鱼作为模式生物研究纳米氧化锌对斑马鱼的毒性研究。本文的目的是确定纳米悬浮液对斑马鱼的潜在毒性，为纳米材料生态毒性的评估提供资料。2材料和方法21试验材料211试验动物斑马鱼（BRACHYDANIORERIO）购自水族馆，每日定时喂食，水温恒定在25的条件，在驯养1周后，用于试验。211试剂和仪器纳米氧化锌购于杭州大洋公司，纯度为999，用超声波震荡制成10、560和1120MG/L的
15、纳米氧化锌颗粒悬浮液。KD1508轮转式切片机，浙江金华科迪仪器有限公司。KDT电脑生物组织摊烤片机。试验用水使用前均需进行除氯，本试验采用将自来水注入驯养鱼缸后曝气三天的方法。载玻片，盖玻片若干。5所有玻璃容器在使用前均用04高锰酸钾浸泡24H，并用去离子水冲洗干净，待用。22实验方法设立梯度浓度为0MGL1（对照组）、1MGL1、56MGL1和112MGL1的四组纳米氧化锌悬液，每组各加入斑马鱼15条，饲养条件同驯养期。由于定期吸出粪便及水分蒸发，使鱼缸内水量持续减少，因此每周更换一次新的纳米氧化锌悬液。饲养期间对斑马鱼行为观察和记录。暴露30天后分别对各缸斑马鱼进行活体取样，每组取五条鱼
16、，取其鳃组织和肝组织，用BOUINS液固定。固定后样品经梯度酒精（50、70、80、90、95、100）脱水，由二甲苯透明，石蜡包埋。切片厚度5UM，常规HE染色，使用倒置显微镜观察拍照。3结果31斑马鱼行为观察在染毒实验期间，对照组和处理组的受试鱼发生死亡。与对照组相比，暴露在浓度为10MGL1受试鱼未发生明显的行为异常，在浓度为560和1120MGL1观察暴露1小时后鱼呼吸和摆动频率逐渐升高和行为变化，而且平均体质量低与对照组并且尾部畸形。32对照组斑马鱼鳃结构斑马鱼鳃的主要功能部位为鳃丝，鳃丝向两边伸出扁平囊状的鳃小片，鳃小片平行排列与鳃丝纵轴垂直。鳃丝主干包括鳃丝软骨CARTILAGE
17、、中央静脉窦CENTRALVENOUSSINUS、鳃丝上皮FILAMENTEPITHELIUM。鳃丝上皮由一至两层上皮细胞组成。鳃小片由扁平细胞、柱细胞PILLARCELLS、泌氯细胞等组成。对照组受试鱼的鳃小片上皮细胞结构完整，无损伤（图1A）。33处理组斑马鱼鳃结构变化在纳米氧化锌悬浮液浓度为1MG/L时，斑马鱼肝未发现鳃组织损伤。当纳米氧化锌悬浮液浓度56MG/L时，观察到斑马鱼的鳃组织均受明显的损伤，主要为鳃小片上皮细胞发生肥大和水肿。经56MGL1处理的斑马鱼，还发生鳃丝上皮细胞增厚、部分鳃组织细胞核消失图1C，在112MGL1时这种显现越发明显（图1D）。可见，伴随纳米氧化锌浓度的
18、升高，鱼的鳃组织受到的损伤加重。6ABCD图1纳米氧化锌暴露30D后斑马鱼的鳃组织结构变化（HE；400）A对照组的鳃组织，鳃丝和鳃小片正常；B纳米氧化锌浓度为10MGL1处理的鳃组织，未发现病变等现象C纳米氧化锌浓度为560MGL1处理的鳃组织，示鳃小片鳃丝病变（箭头）和细胞核缺失（星号）；D纳米氧化锌浓度为1120MGL1处理的鳃组织，示鳃丝明显病变（箭头）。34斑马鱼肝结构变化对照组斑马鱼的肝细胞质均匀，细胞核呈规则圆形，位于细胞中央图2E，肝细胞索相互交错。实验组受试鱼在1MG/L时肝细胞正常并未发现的病变（图2F）。当纳米氧化锌悬浮液浓度56MG/L时，如图2G所示肝细胞肿大，其细胞
19、形状变得不规则，细胞核发生偏离细胞中心。在悬浮液浓度高达1120MG/L时，如图2H所示细胞质中空泡化程度加重，部分肝细胞出现细胞核消失引起肝组织局部坏死。7EFGH图2纳米氧化锌暴露30D后斑马鱼肝组织结构变化（HE；400）E对照组斑马鱼肝组织，胞质均匀，肝细胞呈圆形，细胞核呈圆形位于细胞中央；F纳米氧化锌浓度为10MGL1处理的肝组织，未发现病变等现象；G纳米氧化锌浓度为560MGL1处理的肝组织，示细胞核偏移（箭头）和细胞空泡化（星号）；H纳米氧化锌浓度为1120MGL1处理的肝组织，示细胞核偏移（箭头）和细胞空泡化（星号），组织坏死（三角形）。4讨论41纳米氧化锌斑马鱼鳃结构的影响鳃
20、是鱼类的重要呼吸器官，鱼体与外环境的气体交换主要由鳃来完成。鳃发生病变鱼类呼吸不畅，必然影响鱼类的正常代谢和生长。也是重要的排泄器官，鳃组织的病变将造成氨8氮的排泄受阻，血液中氨氮含量升高，将影响到鱼体内渗透压调节机能。因为鱼类的鳃与水直接接触，并且对水体的污染物敏感，容易受到水体中污染物的作用而损伤，进而影响其正常的生理功能，危及鱼体健康。而且鱼的鳃是污染物作用的主要靶器官，鳃的生理和结构变化可以作为水体受污染的程度的指标，同样也能直接反应污染物对鱼毒害的程度12。水环境中有毒物质作用于鱼类的鳃组织，其损伤可划分为两类一是防御损伤，主要表现为鳃丝上皮细胞肥大和增生、鳃小片的呼吸上皮水肿等；二
21、是直接损伤，主要表现鳃上皮细胞坏死和脱落等。本实验中，纳米氧化锌作为唯一的变量，观察纳米氧化锌对斑马鱼鳃组织的作用，当浓度为1MG/L时斑马鱼的鳃组织并未发现变化，当其暴露在56MG/L的纳米氧化锌悬液30天，其主要变化鳃上皮细胞肥大，并伴有细胞核缺失，并且随着浓度的增高受试鱼鳃上皮细胞增生越严重。吴玲玲13等在10UGL1的林丹水溶液中暴露36D后,与对照组相比,斑马鱼的鳃组织表现出异常上皮细胞残损、脱落、鳃小片上皮细胞水肿以及柱细胞变形当林丹水溶液浓度提高到1000UGL1时,曝露36D后,斑马鱼的鳃小片上皮细胞水肿、柱细胞变形,鳃小片之间有融合现象,反映了林丹对斑马鱼鳃的毒性。JEANM
22、ARIE14等对斑马鱼腹腔注射70NGG的TCDD2,3,7,8TETRACHLORODIBENZOPDIOXIN，5天后，发现斑马鱼鳃小片上皮肥大、明显隆起。而UPATHAM15等将尼罗罗非鱼OREOCHROMISNITIUS暴露在不同浓度的草甘膦除草剂GLYPHOSATEHERBICIDE，C3H8NO5P3个月，结果发现不论5还是15MGL1的草甘膦除草剂中，鳃丝的上皮细胞均有增生并导致鳃小片间发生不同程度粘联，而荡草甘膦浓度为15MGL1时，发现罗非鱼鳃小片的顶端膨大呈杵状。可见，鱼鳃组织细胞会因水环境中含有的毒物种类、作用时间和浓度，以及鱼的种类不同而出现损伤的现象有所差异。所以，斑
23、马鱼鳃组织的病理学变化表示纳米氧化锌污染的程度。此外，本实验中观察到纳米氧化锌对斑马鱼鳃的作用主要表现为防御反应，主要是鳃丝上皮增厚、鳃小片上皮细胞肥大和水肿。鳃组织的防御作用可以阻碍毒物摄入，增加毒物扩散到血液的距离，从而延缓和减轻毒性作用，但是，防御反应降低了鳃的气体和物质交换效率，即鱼的呼吸效率，影响了鱼的循环系统，从而破坏鱼体的生理功能，影响了其新陈代谢，危及其机体健康甚至造成死亡。本研究中，在浓度560MG/L的纳米氧化锌悬液中暴露后的斑马鱼，发现暴露在纳米氧化锌组斑马鱼的质量低于对照组，即说明鳃正常功能受阻，加之肝脏损害，影响了机体的新陈代谢，并且纳米氧化锌对斑马鱼鳃的毒性有明显的
24、剂量效应关系，在112MG/L时，其鳃组织结构的变化明显比56MG/L的鱼鳃组织结构更为严重。42纳米氧化锌斑马鱼肝结构的影响肝脏是斑马鱼和大多数脊椎动物的解毒器官，侵犯机体的有毒异物多在肝脏中集中，所以肝脏也是毒害物质的主要靶器官之一。当有毒物质浓度过高会造成肝细胞损伤，使肝细胞结构表现异常和病变。鱼类暴露在受污染水环境中其肝组织会发生结构和生理变化16。生态毒理学研究中可以运用鱼的肝组织结构变化作为水环境中有毒物质污染作用的生物标记物。通常情况下鱼类受到有毒物质作用后，通常会发生肝细胞肿大、细胞核偏移、空泡化和坏死。本实验中，纳米氧化锌是主要变化因子，在560和1120MGL1纳米氧化锌悬
25、液中暴露30D，斑马鱼的肝组织结构已经出现明显的损伤，主要表现为肝细胞肿大、细胞核偏离细胞9中心，甚至消失，而且在浓度为1120MGL1时观察到肝细胞细胞核消失和组织坏死。然而鱼类在中毒严重时，才表现为肝细胞的细胞核固缩、细胞破裂和溶解，细胞功能发生衰退，终致组织坏死。这说明纳米氧化锌对斑马鱼表现出强烈的毒性。43纳米氧化锌对斑马鱼的毒性机理目前,纳米材料的毒性机制尚未清楚，可能粒子的粒径为纳米级，与细胞膜孔径、核膜孔径和离子通道等处于相同尺度，容易进入细胞，而且由于尺寸效应，其表面活性、电子稳定性、溶解性和光学性质等效应的共同作用造成细胞膜完整性破坏、氧化胁迫、线粒体等重要细胞器损伤、蛋白质
26、氧化和变性并丧失功能、基因毒性、毒性物质的释放等。这些致毒机制主要由纳米材料的自身性质决定18。同样纳米颗粒对生物系统的影响是全方位的，已有学者综述了纳米颗粒进入人体的途径、作用器官以及可能引发的健康问题，也证实了纳米粒子可能进入机体中枢神经系统和心脏等重要组织20。在国内外，已有许多研究都表明纳米材料的生物效应与纳米颗粒的尺寸有相关性21。锌颗粒5816NM和108025NM对小鼠的急性毒性研究表明纳米锌小鼠的肝、肾、心功能有损伤，并有胃肠道反应，而微米锌在同剂量下出现异常应症状少；1周内纳米锌组小鼠死亡率为10，微米锌组无死亡22。有学者根据目前的研究运用细胞及分子学机制，提出纳米材料导致
27、肺组织炎症的假设23为因为纳米级颗粒具有氧化胁迫作用，能在细胞内产生作用从而导致肺组织细胞脂质过氧化产物如氧化型谷胱甘肽的产生和4HYDMXYNONENAL的生成。破坏细胞内的氧化还原平衡，从而导致炎症。而且，细胞与颗粒的相互作用和颗粒的氧化胁迫都能刺激细胞质内CA2浓度的上升，这也会引起抗氧化产物含量上升从而引发炎症。另外，纳米材料引起肺组织炎症可能和巨噬细胞有关24。不同的纳米材料（如SWCNTS和CB）被肺泡巨噬细胞吸收，但是不同材料在肺组织中的反应却不同25。吸收SWCNTS的巨噬细胞会快速移动到肺小叶中央位置，并且聚集在肺泡隔膜，导致肉芽瘤生成，而吸收CB的巨噬细胞会分散在肺泡空间中
28、。李小云等5实验纳米ZNO可以在鱼体内富集。颗粒态锌在鱼鳃和鱼肉中的积累，颗粒态锌在鱼鳃和鱼肉的积累都随锌浓度的升高而升高，颗粒态鱼鳃积累尤其大于鱼肉，其他形式进入鳃组织，再转移到血液的浓度梯度驱动的被动扩散过程。有研究发现，纳米TIO2能够进入鲤鱼（CYPRINUSCARPIO）体内，造成鳃和肝的病理学变化并产生氧化损伤。5总结根据实验结果，可以得出以下结论A56MG/L的纳米氧化锌中的斑马鱼，其鳃组织出现增生，水肿，斑马鱼的肝组织也发生明显的损伤，说明本研究使用的纳米粒子对斑马鱼有毒性作用。B随着纳米氧化锌浓度的增加，斑马鱼的肝和鳃组织损伤越严重。纳米氧化锌对生物的毒性具有剂量效应已从关系
29、。C与传统的化学品相比，在目前的测试的纳米粒子尺度越小毒性越强，这表明适用于“传统”化学品的现行法规评需要重新适用于纳米材料。应建立新的法规，不仅是化学成分，而且根据大小，如化学性质的纳米级的变化来建立新法规。10本研究提出的结果表明，纳米氧化锌潜在生态毒性和环境健康的影响不容忽视。到达生态途径和环境效应试验应包括商业产品是主要类别代表的纳米材料（例如，此处测试的金属氧化物和碳为基础的纳米颗粒），特别是那些最有可能进入水生环境释放的纳米材料。11参考文献1刘扬,高愈希,吴刚,等典型纳米材料生物效应及其毒理学研究的进展J中华预防医学杂志,2007,31301332骆蓉芳,倪士峰,刘惠纳米材料的生
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