1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 灵菌红素染色性能及染色后抗菌稳定性研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要： 灵菌红素 (prodigiosins， PG)是具有多种生物活性的微生物次级代谢产物，在医学、环境治理、食品、纺织等方面均有重要作用。本实验 先 用平板抑菌圈法，对灵菌红素的抗菌活性进行初步定性探讨。结果表明灵菌红素对四种供试菌皆表现出不同程度的抑制作用，其中对枯草芽孢杆菌的抑制效果最明显，金黄色葡萄球菌次之，对大肠杆茵抑制效果较弱，在一定程度上对铜绿假单胞菌有抑制作用。 其次选择真丝作为试样，研究了温度、溶剂比、 p
2、H 值等因素对灵菌红素上染率的影响，确定简单的染色工艺条件：溶剂比例，丙酮 :水 1： 2；染色温度 70；染色 pH 67；染色时间 1h；在此基础上选择金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为试验菌种，通过平板抑 菌圈法和摇瓶震荡法进一步研究染色后织物的抑菌活性。结果表明：染色后的织物仍具有抗菌活性，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌率为 98%，抑制作用强于大肠杆菌 47%。本次实验为灵菌红素在抗菌织物方面的价值评价及开发利用提供依据。 关键词： 灵菌红素；抑菌性能；真丝；染色工艺条件；天然抗菌材料 II Abstract: Prodigiosin is a kind of variety active bi
3、ologically secondary metabolites, which played an important role in medicine, environmental management, food, textiles, etc. In this study, with the plate inhibition zone method, we analyzed the preliminary antimicrobial activity qualitative of prodigiosin firstly. The results showed that the prodig
4、iosin showed different degrees of inhibition in four strains, the ability of inhibition was B.subtilis S.aureus P.aeruginosa E.coli. Secondly, we choose silk as a sample, researched the temperature, solvent ratio, pH on prodigiosin dye rate, and identified a simple dyeing conditions: acetone: water
5、1:2; dyeing temperature 70 ;dyeing pH 6 7; staining time 1h; on this basis, we discussed the dyed fabric antibacterial activity by inhibition zone method and plate shaking shock method further. The results showed that: dyed fabric still has antibacterial activity against S.aureus of which 98% inhibi
6、tion, stronger than E. Coli inhibition of 47%. This experiment provide the value of antibacterial evaluation and the basis for exploitation in the fabric of prodigiosin . Keywords: Prodigiosin; antibacterial properties; silk; dyeing conditions; natural antimicrobial materials 目 录 摘要 . I Abstract. .
7、II 1 绪论 . 1 1.1 灵菌红素的基本性质 . 1 1.2 选题背景及意义 . 2 2 方法与材料 . 4 2.1 实验材料 . 4 2.1.1 菌种 . 4 2.1.2 主要仪器与试剂 . 4 2.1.3 培养基及溶剂配方 . 4 2.2 实验方法 . 5 2.2.1 灵菌红素的制备 . 5 2.2.2 灵菌红素的抗菌性能测试 . 6 2.2.3 灵菌红素染色性能研究 . 6 2.2.4 经染色整理后的织物其抗菌性能研究 . 7 3 结果与分析 . 8 3.1 灵菌红素对不同微生物抑菌性能的研究 . 8 3.2 灵菌红素染色性能研究 . 9 3.2.1 染色时丙酮与水的比例对上染率的
8、影响 . 9 3.2.2 染色温度对上染率的影响 . 10 3.2.3 染液 pH 对上染率的影响 . 12 3.3 经染色整理后的织物其抗菌性能研究 . 13 3.3.1 平板抑菌圈法定性测染色后织物的抗菌性能 . 13 3.3.2 瓶振荡法定量测染色后织物的抗菌 性能 . 14 4 结论 . 16 致 谢 . 16 参考文献 . 18 1 1 绪论 1.1 灵菌红素的基本性质 灵菌红素 (prodigiosins， PG)是一类天然红色素的总称，呈暗红色，具有绿色反光，熔点151152 1。是由一些放线菌、沙雷氏菌及其它细 菌产生的次级代谢产物，具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、 抗原生动物 、
9、抗肿瘤等免疫抑制活性，通常都有 3 个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构，1929 年由 Amak 等研究 Serratia 生 长 时 发 现 ， 包 括 prodigiosin ， prodigiosin 25-C ，metacycloprodigiosin(MP) desmethoxyprodigiosin 和 uncedylprodigiosin(UP)等。 2,3 其结构式如下： PG 属于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，几乎不溶于水，在极性较强的酸性和碱性水溶液中微溶，在极 性较弱的有机溶剂如乙醚或石油醚中微溶或不溶。在碱性或中性溶液中呈橙黄色，在酸性溶液中呈红色。以乙醇为溶剂，酸性条件
10、下灵菌红素在 535nm 处有特征吸收；碱性条件下在466nm 处有特征吸收 4。 PG 对温度稳定，但受 pH 的影响较大，酸性环境中能保持较长的时间，碱性条件下则损失较大； A13+， Ca2+， K+， Ba2+等金属离子对 PG 的稳定性影响不大， Zn2+有使 PG增色的作用， Mg2+和 Mn2+对 PG 有一定的破坏作用， Pb2+可以络合 PG，使之成为沉淀 5。白光和蓝光使 PG 发生光解，在红光和远红光下 PG 则不会降 解 6。 在医学上， PG 日渐成为医学专家的研究对象 。 Cang 等 7以沙雷 氏 菌发酵生产的 PG 做抗菌实验，结果表明， 其 对芽孢杆菌具有显著
11、地杀菌作用。 PG 的结构类似物具有显著的抗 Trichopyton spp.等真菌的活性 8，在临床测试中表现出对 Coccidmycosis 引起的一种地方性真菌传染病有良好的治愈作用。 Isaka 等 9从 Streptomyces spectabilis BCC 4785 的发酵产物中分离得到的 MP 有显著的抗疟疾活性。但由于可获得的 PG 量有限，对其进一步作用的研究很少。 PG 不仅 拥有抗菌和抗疟疾等方面的活性，最近研究表明 PG有很强的抗肿瘤及免疫抑制活性，在平均 IC50 为 2.1 molL-1 时对 57 种不同的人癌细胞有抗性作用 10，如 肺 ， 结肠 ， 肾 和
12、乳房 的癌细胞系等。比起化学疗法药剂，如 环磷琉胺 （ cyclophosphamide）， PG 具有低细胞毒作用，只有当浓度大于 300nM 时才具有明显的淋巴细胞抑制作用。而后者在其有效浓度时毒性已非常高 3,4。临床上将 PG 与 CyA 结合用于解除器官移植急性排斥反应，作用效果好 7。对其潜伏期和临床应用有待进一步的研究。虽然 Melvin11， Montaner12， Songia13， Yamamoto14， ,avila15等人对2 prodigiosins 抗肿瘤机制尚有争议，但其抗肿瘤的生物活性已被众人认可 ,这为治疗一些类似于癌症这样的不治之症提供了一些新的研究方向。
13、PG做为一种生物发酵产生的染料，稳定性高、专一性强、无污染，生产过程对人无害，是一种很好的染料合成的方法。 4 此外， PG 具有强烈的细胞溶解酶活性，能杀灭引起赤潮的浮游藻类 16。韩国科学家于 1996年首次在海洋中发现 ，并 将位于朝鲜半岛以南的美罗岛海域 被 命名为 “哈赫 拉 下济州 ”的 一种微生物，进行了基因组测序分析后发现，这种微生物能产生可以清除赤潮的灵菌红素。将灵菌红素撒在赤潮中，只需十亿分之一的浓度，一小时后就能将导致赤潮的浮游生物大部分杀死。 目前，韩国科学家已经为灵菌红素申请了韩国和国际专利。灵菌红素有望经过毒性试验和环境影响检测，在 3 年后作为治理赤潮的产品投入应
14、用 17。 20 世纪 60 年代早期， Rapoport 等首先描述了 PG 化学合成的全过程，但比较复杂和困难。 1996年 DAlessio 等 18提出了新的制备 PG 类似物的方案，先将 C 环和 B 环相连然后再和 A 环 结合（以往模拟生物合成路线是先将 B 环和 A 环相连）即得 PG 前体物质，步骤简单，合成效率明显提高，但不能用来合成天然的十二烷基 PG。利用化学合成法大量制备 PG 一直未能实施，人们寄希望于微生物发酵生产。国内外对产 PG 微生物的研究主要集中在陆地微生物沙雷菌上。主要通过诱变方式希冀得到高产菌株。 20 世纪 80 年代以来，人们开始从基因水平研究 P
15、G 的生物合成途径及其调节，随着生物操作技术的发展和对 PG 的深入研究，人们将更加清晰地认识 PG 的产生和作用机制，大量生产制备 PG，用于替代对人体有害作用的化学药物，造福于人类 2。 PG 在医药、食品、印染、饲料添加剂、环境治理等领域，均具有巨大的应用潜力和广阔的市场前景。 1.2 选题的背景及意义 近年来，由于环境和能源等问题，人们趋于追求健康可持续的方法制取染料。开发天然 色素染料是世界应用染料发展的总趋势 。 天然 色素 是指从植物、动物或矿产资源中获得的、很少或没有经过化学加工的染料，很多天然 色素 具有安全可靠、色调自然、接近天然物质等优点 ；而且使用 天然 色素 染色在我
16、国具有悠久的历史，明清时期，我国天然染料的制备和染色技术都已达到很高的水平 。 19 天然染料多来源于动植物 ，这使得它难以进行标准化生产。以植物染料为例，即使是同一种植物，由于产地不同、气候条件不同及采集时间不同都会影响色素的组成及色泽。而这必然会导致染料的染色重复性差 。 20 再者，由于动植物中色素含量较小，要想获得足够染料，就3 要大量采摘或砍伐植物，或者猎取动物。这会造成对生态环境的破坏，违背了使用天然染料染色以利于生态和环保的初衷。另外，许多天然染料也都是中草药资源，具有很高的药用价值和经济价值，如果将它们大量用于染料的提 取，也是不经济的。 21 因此 ，天然 染料制取不易， 价
17、格 高昂 ， 且 在加工、贮存过程中容 易褪色和变色，其应用受到 一定的 限制 ， 目前 无法用天然染料 完全替代合成染料 。 合成染料自 19 世纪中叶问世以来，由于色泽鲜艳 、 色谱齐全、性质稳定，易于调色，着色力强，成本低廉，使用方便，等特点，逐步取代了天然染料，为色素的使用提供了更经济的生产途径 ， 成为纺织品最主要的着色剂 19。 但合 成 染料 多为含有 RN=NR 键、苯环或氧杂葸结构的化台物，它们对人体存在一定的不安全性。近几年的研究表明，随着色素安全性试验技术的发展，人们 陆续发现 合成色素对人体有不同程度的毒性作用 ， 有 100 多种常用染料有可能产生致癌物质。 1994
18、 年德国等发达国家颁布了禁用这些染料的法规。 19 不仅如此，随着地球石油资源的消耗，合成染料的原料问题已暴露出来 。 因此， 天然、多功能 、环保 是染料发展的 必然 趋势。随着生物技术的发展，利用生物技术生产天然染料为人们开辟了广阔的领域。生物发酵 产物 稳定性高、专一性强、无污染，生产过程对人无害，是一种很好的染料合成的方法 4。从自然资源中筛选出可以生产天然染料的微生物，进而开发新品种的天然染料，尤其是具有功能性的天然染料 22,23，具有广阔的前景。 PG 作为由发酵产生的具有重要生物活性的微生物次级代谢 产物，是一类 呈暗红色的天然色素，色泽亮丽诱人 ，有抗菌活性 ，有较好的生物可
19、降解性和环境相容性 ，是一种多功能染料， 在印染、纺织领域， 应用优势相当明显 ， 在高档真丝制品、保健内衣、家纺产品、装饰用品等领域中拥有广阔的发展前景 ， 具有巨大的 商业潜力 。 由于纤维自身结构与染料亲和力的原因， PG 染腈纶织物的上染率要比染羊毛织物的上染率高，且耐皂洗牢度和摩擦牢度也要比羊毛织物的好 ， 经 A13+媒染剂处理后的羊毛织物的各项牢度均有所改善 。 4 Cang 等 9以沙雷 氏 菌发酵生产的 PG 做抗菌实验，结果表明，对芽孢杆菌具有显著地 杀菌作用。钟绵国等 对 灵菌红素羊毛、腈纶染色性能进行研究，确定其最佳染色工艺 。灵菌红素羊毛织物的最佳染色工艺条件为：染料
20、用量 4%（ o.w.f），乙醇：水为 1： 3，浴比 1： 50， pH值为 7.0，染色温度 80，染色 60min；灵菌红素腈纶织物的最佳染色工艺条件为：染料用量 3%（ o.w.f），乙醇：水为 1： 2，浴比 1： 40， pH 为 6.0， 95条件下染色 50min。 并 通过抑菌率的测试 证明灵菌红素具有较好的抗菌性能 4。 4 本次实验在前人基础上，用丙酮与水的混合溶液作为灵菌红素染色的溶剂，选择真丝作为试样， 探究其染 色性能。 并采用 平板抑菌圈法、摇瓶振荡法定性或定量测定灵菌红素对常见微生物（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌）的抗菌性能 。为灵菌红素
21、在抗菌织物方面的价值评价及开发利用提供一定依据，加快灵菌红素工业化进程。 2 方法与材料 2.1 实验材料 2.1.1 菌种 沙雷氏菌 ( Serratia jx.1)，本实验室保藏 ； 大肠埃希菌（ Escherichia coli），本实验室保藏 ； 金黄色葡萄球菌（ staphylococcus aureus），本实验室保藏 ； 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis），本实验室保藏 ； 铜绿假单胞菌（ Pseudomonas aeruginosa），本实验室保藏。 2.1.2 主要仪器与试剂 QYC-211 型全温空气摇床（上海福玛实验设备有限公司）； H2050R 型台式
22、高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）； VS-1300 型洁净工作台（苏州时速为净化设备有限公司）； PHS-3C 型精密 pH 计（上海安亨昌吉 149 号雷磁仪器厂）； AL-204 型电子天平（梅特勒 -托利多仪器上海有限公司）； DGX-914381 型电热恒温鼓风干燥器（上海福玛实验设 备有限公司）； DK-S24 型电热恒温 水浴锅 （上海精宏实验设备有限公司）； LRH-250A 型生化培养箱 (广东省医疗器械厂）； DSX-280A 型不锈钢手提式灭菌器（上海申安医疗器械厂）； 灭菌锅； 旋转蒸发仪 ； 752s 紫外可见分光光度计； 1000L、 200L 移液枪 。
23、 本实验所用丙酮、氯化钠、硫酸镁、甘油等均为分析纯； PN5247 蛋白胨、牛肉浸膏等均为生化试剂。 5 2.1.3 培养基 及溶剂配方 种子培养基 (g/L)：牛肉膏 3.0，蛋白胨 10.0， NaCl 5.0，琼脂 15， pH 7.47.6。 种 子扩大培养基（ g/L）：蛋白胨 13.0，甘油 20.0， Nacl 5.0，摇瓶装液量 20mL/250mL（ V/V），pH 自然， 28 ， 170r/min，培养 24h。 发酵培养基 (g/L)：蛋白胨 16.0，甘油 20.0， MgSO4 1.2， NaCl 2.0， Gly 0.75， pH 5.7，摇瓶装液量 50 mL/
24、250mL(V/V)，接种量 5 (V/V)， 28 ， 170r/min，培养 48h。 固体培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g， Nacl 5g，琼脂 1520g，水1000mL， pH 7.07.2。 液体培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g， Nacl 5g，水 1000mL， pH 7.07.2。 0.03mol/L PBS（磷酸盐）缓冲液：磷酸氢二钠 2.84g，磷酸二氢钾 1.36g，蒸馏水（最终定容至） 1000mL，灭菌后， pH 值约为 7.27.4， 5 10保存备用。 2.2 实验方法 菌种：沙雷氏菌，大肠埃希菌，金黄色葡萄
25、球菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌。 菌种 活化：按照种子培养基的组成称取牛肉膏 3.0g，蛋白胨 10.0g， NaCl 5.0g，琼脂 15g， 于容器内 加水至 1000mL，加热搅拌 至物料 溶解，用 1mol/L HCl 和 1mol/L NaOH 调节培养基的 pH，使其在 7.4-7.614。然后分装在 250mL 的摇瓶中，用灭菌锅在 121 下灭菌 20min， 冷却至适当温度时 倒平板。待平板冷却后在无菌条件下，用接种针挑取 甘油冷冻保藏 的菌种划平板， 37 培养1824h，即得到活化的菌种，将其放于冰箱内 ， 4左右 保存备用。 2.2.1 灵菌红素的制备 分别称取（ g
26、/L）蛋白胨 13.0、甘油 20.0、 NaCl 5.0 放入烧杯中加水，搅 拌，使烧杯中的物料完全 溶解并分装于 250mL 的摇瓶中，每个摇瓶装 20mL 的培养基，并用灭菌锅在 121 下高温蒸汽灭菌 20min，待摇瓶内的培养基冷却后 ， 在无菌条件下 用接种针挑取两环平板上的单菌落于摇瓶中 。接种完后， 28 ， 170r/min 培养 24h，作为种子扩大培养。 分别称取（ g/L）蛋白胨 16.0、甘油 20.0、 MgSO4 1.2、 NaCl 2.0、 Gly 0.75 放入 容器 中加水 加热 搅拌，使烧杯中的物料 完全 溶解并分装于 250mL 的摇瓶中，每个摇瓶装 5
27、0mL 的培养基，并用灭菌锅在 121 下高温蒸汽灭菌 20min，待摇瓶内的培养基冷却后 ，在无菌条件下，从种子扩大培养基中转接，接种量为 5%（ v/v)。接种完后， 28 ， 170r/min 培养 48h。 48h 后 从摇床 取出 发酵液 ，摇匀，分别用量筒 量 取 40mL 发酵液于 50mL 离心管中， 0 ，6 10000r/min，离心 10min，弃上清液，然后用移液管移取 20mL 的丙酮于各个离心管中，用玻璃棒搅拌使色素完全溶于丙酮中，再离心，温度为 0 ， 10000r/min，离心 10min。取出上清液，使用旋转蒸发仪蒸发大部分丙酮，余下置于通风橱内自然风干，收集
28、色素并于干燥暗处保存，备用 。 2.2.2 灵菌红素的抗菌性能测试 测试的菌种包括革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌 ）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌、 铜绿假单胞菌 ）。 金黄色葡萄球菌是无芽胞细菌中抵抗力最强的致病菌 ， 可作为革兰氏阳性菌的代表 ； 枯草杆菌易形成芽胞 ， 抵抗力强 ， 可作为芽胞菌的代表 ； 大肠杆菌分布相当广泛 ， 通常作为革兰氏阴性菌的代表性菌种用于各种试验 ； 铜绿假单胞菌在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一 ， 各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在 ，可 作为革兰氏阴性菌的代表性菌。 方法：平板抑菌圈法 。 灵菌红素溶液配制：称
29、取 0.002g 灵菌红素溶于 5mL 的二甲亚砜，制成 4g/L 的灵菌红素溶液，90灭菌 30min 后， 暗处保存，备用。 试验 菌液的培养和准备：从 3 代 10 代的细菌保存菌所在培养基挑取一纯种细菌，在营养琼脂平板上划线，于 37 1 培养 18 24h。用接种针挑取两环于 5mL 无菌水中，混匀，调节各菌浓度至 108 个 /mL，即制成了菌悬液。 平板抑菌圈法： 分别用移液枪 取 0.2mL 各菌悬液 于营养琼脂平板上， 涂布，每种菌做两个平行样。将灵菌红素溶液浸泡的无菌滤纸片贴于该平板，每个平板分 3 个区域，贴 2 个灵 菌红素滤纸片和1 个二甲亚砜对照滤纸片 （如图 3-
30、13-4 所示） 。 37 1 倒置培养 24h 48h，分别记录抑菌圈大小 （见表 3-1） 。 2.2.3 灵菌红素染色性能研究 材料：真丝。 内容：用灵菌红素对上述材料进行处理，测定其上染率，确定其简单染色条件。 备 注：每染 1g 织物用灵菌红素 0.04g，溶于 100mL 有机溶剂，每次用 0.02g 织物进行实验。 上染率测试：用紫外可见分光光度计测灵菌红素最大吸收波段处的吸光度来计算上染率。上染率的测试公式：上染百分率 %=（ 1-Ei/Eo） 100% 。式中 Ei 染液残液吸光度； Eo 标准染液吸光度。 溶剂比例：以丙酮和水作为灵菌红素的溶剂，设定其比例分别为 1： 1， 1： 2， 1： 3， 1： 4，染色 60min，于 OD535 测染液吸光度，确定其上染率。 实验结果见图 3-5。染色时溶剂比对上染
