1、含双 T 切换接口的胶束电动色谱 毛细管区带电泳二维电泳芯片上混合氨基酸的分离富集作者：徐溢 申纪伟 曹明霞 张文品【摘要】 基于时间顺序设计提出了含双 T 切换接口的胶束电动色谱(MEKC)和毛细管区带电泳(CZE)的二维芯片，构建了相应的芯片分析测试系统。基于 FITC 标记的氨基酸样品的一维 MEKC 和 CZE 实验结果，对二维进样时间、二维分离启动时间等二维芯片电泳关键操作参数进行了优化。采用所构建的 MEKCCZE 二维芯片电泳分析系统对精氨酸、赖氨酸、组氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的混合样品进行了二维芯片电泳分离分析，计算得到两种分离模式的正交性为 56.0%。 【关键词】 二维芯片电
2、泳，胶束电动色谱，毛细管区带电泳，氨基酸分离本文系国家自然科学基金项目(Nos.20675089，90307015), 国家科技部 863 计划项目(No.2006AA04Z345)和科技部国际科技合作项目(No.2006DFA13510), 重庆市自然科学基金重点项目(No.2006BA4012)资助1 引 言在微流控芯片上集成微管道网络构建的二维芯片分离系统是近年来发展起来的一种用于复杂样品的分离分析的新型复合分离技术1。它将两种不同的电泳分离模式耦联起来，具有接口处死体积小的优点，在提高分离系统的分辨率和峰容量方面显示出巨大潜力，使其成为复杂生化样品体系分析中备受关注的分离分析手段24。
3、胶束电动色谱(Micellar electrokinetic chromatography，MEKC)与毛细管区带电泳(Capillary zone electrophoresis，CZE)是两种正交性较好的分离模式，以这两种分离模式进行耦联来构建二维分离分析系统，分析成本较低，操作难度适中5，且 MEKC 在线富集技术可以使样品浓缩，使得初始浓度很低的样品能够在第二维 CZE 分离中得以实现，提高了微系统的检测能力6,7。切换接口的设计是微流控二维电泳芯片技术的难点和核心。针对基于时间的微流控二维芯片电泳分离方式，一般是在两维之间采用门式进样，其切换接口的结构为常规的十字型结构。这种方法的操
4、作难度大，重现性差。双 T 型结构本身是基于体积的进样方式，以这种结构为微流控二维电泳芯片的切换接口，可根据分析对象方便地调整接口尺寸，二维芯片电泳的操作难度明显降低，既能应用于时间顺序上的二维芯片电泳分离方式，又能保持体积进样方式的优点，有效降低了二维进样的样品损失。本研究将胶束电动色谱(MEKC)与毛细管区带电泳(CZE)两种分离模式进行耦联，设计了基于时间顺序的二维电泳芯片双 T 切换接口，构建了相应的二维芯片电泳分析测试系统。以荧光标记的氨基酸为样品，进行 MEKC 和 CZE 分离过程的缓冲介质、分离场强等芯片电泳操作参数优化，用以实现混合氨基酸样品的二维芯片电泳分离分析，并对所构建
5、的二维分析系统进行了评价。本系统为新型微全分析系统的研发提供了一定的理论依据和技术支撑。2 实验部分2.1 仪器与试剂XCDY 微流控芯片智能多通道高压电源(山东省化工研究院仪表研究所); 共聚焦激光诱导荧光检测器(山东省化工研究院仪表研究所); KCN 7E12500 高压电源(Omiran Ltd Mildenhall, England )。硼砂(AR，重庆市东方红试剂厂); L 精氨酸(LArg) 、L 赖氨酸(LLys) 、L 组氨酸(LHis) 、L 酪氨酸(LTyr) 、L 苯丙氨酸(LPhe)(AR ，上海康达氨基酸厂); 异硫氰酸荧光素(FITC，AR, Sigma公司); 十
6、二烷基硫酸钠(CR，上海化学试剂厂); 聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sylgard184 有机硅弹性体美国道康宁公司)。所有试剂和溶液均用二次蒸馏水配制，上片前均用 0.22 m 水性微孔滤膜过滤。微管道宽(Width of channel) 80 m，深(Depth of channel)25 m; S, W, B1, W1 分别为第一维样品池、样品废液池、缓冲液池和缓冲废液池(Sample cell, waste cell, buffer cell and waste cell for first part, respectively)， B2 和 W2 分别为第二维缓冲液池和缓冲废液池，d
7、1 为第一维检测点，d2 为第二维检测点(B2 and W were buffer cell and waste buffer cell for second part, respectively. d1 and d2 were the detecting point)。2.2 MEKCCZE 二维电泳芯片设计和制作芯片结构如图 1 所示, 其中含微管道的玻璃基片采用标准湿法刻蚀工艺加工而成，与 PDMS 直接键合得到玻璃PDMS 复合芯片。由此建立的二维电泳芯片分离分析系统包括多通道高压电源、MEKCCZE 二维芯片、激光诱导荧光(LIF)检测器以及 N2000 色谱工作站等。3 结果与讨论
8、3.1 MEKCCZE 二维芯片电泳芯片设计MEKCCZE 二维电泳芯片的设计不仅要满足每一维分离的需要，而且芯片接口须有效地保证样品的连续切换。本研究提出了用于 MEKCCZE二维芯片分离分析系统的双 T 型耦联接口设计，既可根据分析对象设计接口尺寸，又能满足基于时间顺序的微流控二维芯片电泳分离方式的需要。通过双 T 切换接口的设计，降低了操作难度，有效地控制了二维进样量，提高了检测的重现性，避免了二维进样的样品损失。3.2 二维芯片电泳操作参数优化3.2.1 MEKC 模式中 SDS 浓度的优化 在电泳操作过程中，缓冲介质的选择对于减小溶质与管壁的相互作用，克服峰型畸变，改善分离度都具有十
9、分重要的作用。由于 MEKC 模式电泳缓冲溶液中含有大量 SDS 胶束，SDS 浓度是进样和分离操作的关键因素。用含 SDS 胶束的硼砂(10 mmol/L)缓冲液对 FITC 标记的 LArg ，LLys ，LHis ，LPhe 和LTyr 混合样品进行分析，分别考察 10，15，20 和 25 mmol/L 的 SDS 对样品分离效果的影响(图 3)。通过氨基酸单样品电泳图谱与混合氨基酸样品图谱的比对，对样品峰进行了识别，分析样品的出峰顺序依次为LArg ，LLys ，LHis ，LPhe 和 LTyr 。实验表明：当 SDS 浓度为20 mmol/L 时，保留时间、分离度、样品峰形均处于较佳状态，所以MEKC 缓冲液中 SDS 的浓度选择为 20 mmol/L。ac: 一维进样、一维分离(Injection and separation of first dimension); df: 二维进样、二维分离及其循环过程(Injection and separation of second dimension and its circulation). 图 3 MEKC 模式中 SDS 浓度对样品分离的影响
