1、海洋微藻培养液中二甲基硫与二甲基硫丙酸的同步分析作者：周成旭 徐继林 严小军 侯云丹 蒋莹【摘要】 基于水体中二甲基硫(DMS)的固相微萃取 气相色谱 质谱联用分析方法，建立了海洋微藻培养液中 DMS、溶解态二甲基硫丙酸(DMSPd)和颗粒态二甲基硫丙酸(DMSPp)的同步测定方法。 结果表明: 本方法在 0.0110.0 g/L 范围内线性良好, 方法检出限 10.6 pg , 加标回收率为(93.11.3)%; 相对误差范围小于 5%。将 4种微藻培养液高速离心,上层和下层溶液分别加固体 NaCl后立即测定 DMS，加 NaOH 溶液反应 12 h后测定 DMS含量, 根据其数值的差值可得
2、到各微藻培养液中DMS与 DMSP的含量。检出结果与文献报道具有相似的结论：甲藻和定鞭藻是 DMS(P)的重要生产者。其中颗石藻 (Pleurochrysis carterae)单位细胞 DMSPp 的检出含量为(13.80.9)pg/cell 【关键词】 海洋微藻, 培养液, 二甲基硫, 二甲基硫丙酸, 固相微萃取 气相色谱 质谱1 引 言二甲基硫(DMS)是海洋中最丰富的挥发性硫化物1,2, 可以通过海气交换进入大气，从而影响局部甚至整个海域的气候以及形成酸雨、酸雾等3,4。它主要来自海洋微藻，其前体物质是二甲基硫丙酸(DMSP)，海洋微藻产生 DMSP的能力因其种类和所处的海域而不同46
3、。海洋微藻培养液中 DMSP和 DMS变化的研究，对改善海洋环境特别是海洋大气环境具有重要意义。利用液相色谱 质谱联用技术(LCMS) 可以直接定量水体和细胞中的 DMSP7，但预衍生过程繁琐，而且水体中 DMS不能用液相色谱法测定。较简便的方法仍然是通过碱处理将 DMSP转化为 DMS后,气相色谱质谱联用(GCMS) 法测定转化前后 DMS的含量46,8。水体和藻体细胞中对 DMS和 DMSP的影响因素非常多，要准确定量分析培养液及其微藻中 DMS和 DMSP细微变化必须考虑这些因素。因此，与研究纯水体不同，微藻培养液中 DMS和 DMSP的同期检出方法很关键。本研究进一步优化了水体中 DM
4、S的固相微萃取(SPME) 气相色谱 质谱联用分析技术，建立了海洋微藻培养液中 DMS与 DMSP的测定方法，为海洋环境中生物硫循环的研究提供了一种新的分析方法。2 实验部分2.1 仪器与试剂QP2010 气相色谱 质谱分析仪(日本 SHIMADZU公司);VOCOL 色谱柱(60 m0.32 mm， 1.8 m)、固相微萃取系统和 75 m Carboxen/Polydimethylsiloxan(CAR/PDMS)萃取纤维(美国 Supelco公司);CASYTT 颗粒粒度计数分析仪(德国 Casy公司)。二甲基硫(DMS，纯度95%)与丙烯酸(纯度99%)购于美国 SigmaAldric
5、h 公司;甲醇(色谱纯，美国 Tedia公司);二甲基硫丙酸(DMSP,本实验室合成)。其它试剂均为国产分析纯。2.2 实验方法2.2.1 标准溶液的配制 将 DMS溶液加入甲醇溶液中，配成 1.0 g/L储备液，-20 避光保存。绘制工作曲线时再取适量的母液加入到刚煮沸冷却后的海水溶液中，配成 5 mL一定浓度的标准液。2.2.2 DMSP合成 参考文献9，将 1.0 mL(14.5 mmol)丙烯酸和2.5 mL(34 mmol) DMS 溶解在 15 mL二氯甲烷中，室温下不断通入过量HCl气体，生成的沉淀过滤后再在甲醇 乙醚 (11，V/V)溶液中重结晶。通过核磁共振波谱仪检测，纯度9
6、5%。2.2.3 微藻培养 微藻藻种由宁波大学海洋生物实验室藻种室提供，培养海水(盐度 25)经 0.45 m 醋酸纤维滤膜过滤后煮沸冷却，培养液采用浙江水产学院三号液配方(NMB3#)。藻种在 2500 mL锥形瓶中于日光灯光照下培养，光照强度 4555 mol/(m2s)，光暗周期 1212，培养温度为(202)，每天用颗粒粒度计数分析仪测量藻类密度，藻类生长平台期采集样品。每个样品平行培养 3瓶，每瓶样品平行测定 3次，取均值。2.2.4 样品前处理及定量分析 取 2份 2.0 mL藻液，以 8000 r/min高速离心后，立即各取出 1.0 mL上清液。向 15 mL预先放有搅拌磁子的
7、顶空瓶中，加入其中一份样品的上清培养液，用 4.0 mL刚煮沸冷却后的海水稀释样品，加入 0.81 g固体 NaCl(预先在 120 下烘干 6 h)，立即进行固相微萃取;再向两只同样的顶空进样瓶中分别加入另一份样品的上清培养液 1.0 mL和下层含有藻体的 1.0 mL培养液，同样加入 4 mL刚煮沸冷却后的海水稀释样品，加入 0.5 mL 10 mol/L NaOH溶液，4 下放置过夜(12 h 以上)后分别进行固相微萃取。固相萃取纤维预先在 250 下活化 30 min以上，顶空瓶放置于30 恒温水浴电磁搅拌机中，磁力搅拌下，用 SPME装置的针头刺穿瓶盖内聚四氟乙烯密封垫，推出萃取头暴
8、露于顶空中，固定深度 3 cm，萃取 30 min，停止搅拌，25 下再平衡吸附 15 min，随即拔出进行GCMS 分析。根据样品中所含 DMS特征离子信号(m/z 62)响应强度，用外标法求出各样品中 DMS含量。立即测定的上清液样品中 DMS的含量，即为此培养条件下 1.0 mL培养液中 DMS的含量;加 NaOH过夜的上清液样品中测定的 DMS量，为 1.0 mL培养液中溶解态 DMSP(DMSPd)与 DMS的总和;下层带有藻体的培养液加 NaOH放置 12 h后测定的 DMS量，为 1.0 mL培养液中 DMS与 DMSPd的含量加 2.0 mL培养液藻体中颗粒态 DMSP(DMS
9、Pp)总和。取 2份 2.0 mL藻液，按照下面流程进行分析，分别得到DMS1、DMS2 和 DMS3，其中固体 NaCl预先在 120 下烘干 6 h，海水均在实验当日经煮沸冷却后使用。2.3 色谱质谱条件采用不分流进样模式，进样口温度 210 ，载气为 99.999%的高纯氦，总流速 20 mL/min , 柱流速 2.0 mL/min , 柱前压 85.0 kPa, 柱起始温度 35 ，保持 3 min，以 3 /min 升至 40 ，保持 1 min，再以 5 /min 升至 100 后，以 20 /min 升至 210 保持 10 min。用电子轰击(Electron impact,
10、 EI)源分析, 电子能量为 70 eV，离子源温度 200 ，接口温度 250 。选取全程离子碎片扫描(SCAN)模式时，质量扫描范围为 m/z 40400，溶剂延迟 0.6 min。选取特征离子碎片扫描(SIM)模式时， m/z 62作为定量目标特征离子， m/z 47作为定性时的参考离子。3 结果与讨论3.1 样品的收集方式培养液中 DMS、DMSPd 与 DMSPp的关系可用式(1)表示(AA 为丙烯酸)：DMSPP 细胞破裂 DMSPdOH-H+DMS+AA(1)为了测定藻体中 DMSPp的含量，需要把藻体与培养液分离。藻类培养实验中收获藻体一般采用离心和过滤两种方式。相对过滤而言，
11、适宜的离心速度对于既实现收集目的又保护微藻细胞完整性更为有利。实验表明，过滤过程中藻细胞破裂后析出的 DMSP会立即进入滤液中。而采用 8000 r/min离心后立即测定上、中、下层溶液中 DMSP的含量发现，上、中层含量基本一致，而下层含量也只有很少的增加，说明离心过程中藻细胞破裂很少，而且破裂后析出的 DMSP也仍然留在下层，对上清液基本没有影响。比较离心与过滤后培养液中 DMS的含量发现，同一样品过滤后的培养液中 DMS的含量比高速离心后上清液中 DMS的含量高很多。Jiao 10和 Turner11也建议不使用过滤的方法以免对测试结果造成误差。故本研究采用离心方式。考虑到 DMS强挥发
12、性和不同藻体细胞的易碎性，即使采用离心方式，也无法做到既将藻体完全从培养液中分离出来又不影响实际测定结果。故将藻液高速离心后，并不将藻体与培养液完全分开，而是分别对离心管中一半上清液与带藻体的另一部分下层溶液进行测定，两者差值即为藻体贡献结果。3.2 样品溶液介质条件对 DMS和 DMSP测定结果的影响目前，用 GC测定水体中的挥发性硫化物一般有 3种前处理方式：顶空直接进样法4、固相微萃取法12,13和吹扫捕集法5,6,8,14。这 3种方法都有 DMS脱离水溶液进入顶空的情况，水溶液中 DMS进入顶空的百分率跟样品溶液介质条件密切相关。恒定溶液的温度为 30 ，并保持同样的电磁搅拌速度，盐
13、度和pH成为影响 DMS挥发的重要因素。加入无机盐可提高试液的离子强度，使有机化合物在水溶液中的溶解度降低，促进其挥发至顶空12，故向含有标准 DMS的海水溶液中添加 NaCl，随着盐度增加，用固相微萃取法测得的信号强度明显增加(图 1)。同样，加入 NaOH后由于离子强度及 pH的增加也会使测得的信号强度明显增加。在碱性条件下，DMSP 可以分解为 DMS和丙烯酸(式 1)，向溶液中加入 NaOH后测定的 DMS，即为水体中本底 DMS与 DMSPd的和。但由于碱化后溶液中离子强度增加及 pH改变，测得的 DMS总量中，本底 DMS测定值大于碱化前测得的本底值。有研究者为了降低 pH变化对测
14、定结果的影响，碱化反应后加入 HCl中和再进行测定4,5。但向两份含等量标准DMSP不含 DMS的海水溶液中，加入 0.5 mL 10 mol/L NaOH， 在 4 反应过夜后，一份直接测定 DMS，另一份加 0.5 mL 10 mol/L HCl中和后测DMS，发现虽然中和后离子强度比中和前高，但测得的 DMS信号却比中和前低很多，用实际微藻样品实验也得到同样的结果。这可能是反应式(1)的后一反应的逆反应引起。回收率实验表明，根据不中和条件下测到的DMS摩尔数推算 DMSP反应到 DMS的反应率达(102.35.6)%, 而中和后测到的反应率只有(85.74.3)%。可见，中和反应虽然可能
15、部分消除介质pH对测定结果的影响，但却会降低 DMSP反应生成 DMS的反应率。文献4用绘制标准 DMSP工作曲线的方法来进行校正。只有调控反应前后的介质条件，使 DMS进入顶空的百分率一致，才能准确测定出溶液中 DMS和 DMSP的含量。向 5.0 mL含 5.0 g/L 标准 DMS的海水溶液中加入不同量固体 NaCl，分别测定 DMS的信号强度(图 1)，A 点对应同样标准溶液中加入 0.5 mL 10 mol/L NaOH后的平均信号强度。可见，当盐度达到 0.16 g/mL时，DMS 信号强度与加入 NaOH后的信号强度相当，可以认为这两个介质条件能使 5.0 g/L 标准溶液中的
16、DMS进入顶空的百分率一致。在 0.110 g/L 浓度范围内改变 DMS含量，重复上述实验，需要加入的 NaCl的量为(0.1620.006) g/mL。向含标准 DMSP不含 DMS的海水溶液中加入 NaCl过夜，无法检测到 DMS的信号，说明盐度增加不能引起 DMSP向 DMS的转化。故可以向一份水样中加入 HCl (0.1620.006) g/mL测定本底的 DMS值，再在另一份水样中加入 0.5 mL 10 mol/L NaOH反应足够时间 (一般大于 12 h)，测得水样中本底 DMS与由 DMSP转化而来的 DMS之和，两份水样测定结果之差即为此水样中 DMSP的量。3.3 方法
17、的线性范围、灵敏度、精密度和回收率选用普通的毛细管柱(30 m0.32 mm， 0.25 m)，如果极性稍强，DMS 在柱子上保留性很差，即使选用极性很弱的 Spb1 型，出峰仍然很快，保留时间 2.6 min，很难得到良好的色谱峰，而且容易被环境中其它低分子量强挥发性物质干扰(图 2A)。选用专用测定挥发性物质的Vocol色谱柱(60 m0.32 mm， 1.8 m)，由于柱长和膜厚增加，分离能力明显增强，保留时间为 9.2 min，与用 Spb1 柱得到的色谱峰相比，同样浓度的信号峰宽明显减少而峰高明显增加(图 2B)。另外，由于采用了选择特征离子碎片扫描(SIM)模式，使方法灵敏度进一步
18、提高，0.01 g/L 的样品信号的信噪比(S/N)达 14.2，对应信噪比为 3的标准物浓度作为检出限,可计算出仪器对 DMS的检出限为 10.6 pg。在 0.01100 g/L 范围内，以响应信号对 DMS浓度做工作曲线，在 0.0110.0 g/L 范围内线性良好，线性回归方程 Y=130152.3X-5798.3, r=0.9999。而当浓度大于 10.0 g/L 时，信号有明显钝化现象。通过曲线回归，基本吻合二次方程：Y=-7680.5X2+170118.6X-17269.7， r=0.9768。选择离心后的上层培养液进行加标回收实验，加标浓度分别为0.02、0.20 和 2.0
19、g/L，平行测定 3次，回收率为(93.14.3)%; 平行测定的相对标准偏差均小于 5%。3.4 培养液和藻体中 DMS与 DMSP的含量由于含有微藻的样品中 DMSP转化为 DMS后, DMS浓度远超出方法的线性范围，所以实际测定时需要用刚刚煮沸冷却后的海水稀释样品，以确保样品测定的信号强度落在线性范围内。另外，为了方便计算 DMSP与 DMS之间的转换,实验结果用摩尔浓度表示。考虑到不同种类微藻平台期密度不同，为了便于比较，根据测定时微藻的密度，将最后结果换算为单位细胞 DMS和 DMSP的量(表 1)。平行测定相对标准偏差均小于7%(n=3)。表 1 不同类群微藻培养液中 DMS(P)
20、的含量(mol/cell)Table 1 Content of DMS, disolved dimethylsulfoniopropionate(DMSPd) and particalate dimethylsulfoniopropionate(DMSPp) in different microalgae culture微藻 MicroalgaeDMSDMSPdDMSPp锥状斯克里普藻 Scrippsiella trochoidea(mol/cell)6.4310-99.0710-88.3610-7 颗石藻 Pleurochrysis carterae(mol/cell)2.7610-98.9
21、710-91.0310-7扁藻 Platymonas helgolandica(mol/cell)1.1710-114.7310-94.4810-8小球藻 Chlorella sp.(mol/cell)3.1410-132.4210-122.3610-12 由表 1可见，的相同培养条件下，属甲藻门的锥状斯克里普藻和属定鞭藻门的颗石藻，含量都高于属绿藻门的扁藻或小球藻。Stefels等 15对不同微藻类群产生 DMS(P)的分析发现，定鞭藻和甲藻是 DMS(P)高产种类，甲藻中的 DMSP裂解酶活性明显。几乎所有被检的蓝藻、原绿藻和隐藻门不产 DMSP。本实验的结果也显示，甲藻和定鞭藻是DMS(
22、P)的大量生产者。本研究的检出结果中，所测得的颗石藻(P. carterae)培养液含 DMSPp (13.80.9)pg/cell，与 Wiesemeier等7衍生后用 LCMS方法直接测得的颗石藻 Emiliania huxleyi(CCMP 1516)的结果(10.83.3)pg/cell 相似。颗石藻 E. huxleyi属低温种， P. carterae的适宜温度更宽泛且偏高温。但两个研究中，微藻都培养于各自适宜环境条件下，说明这两种在海洋环境中常发水华的颗石藻有着类似的产生 DMSP的能力，同时也可说明这两种方法对微藻中 DMSP的测定有着相似的测定效果。致 谢 宁波大学材料科学与
23、化学工程学院梁洪泽教授帮助合成 DMSP，谨致谢忱!【参考文献】1 Malin G, Kirst G. J. Phycol., 1997, 33: 8898962 Norici A, Hell R, Giordano M. Photosynth. Res., 2005, 86: 4094173 Charlson R J, Lovelock J E, Andreae M O, Warren S G. Nature, 1987, 326: 6556614 Rijssel M V, Gieskes W W C. J. Sea Res., 2002, 48: 17275 Wang Yan (王 艳),
24、 Qi YuZao (齐雨藻), Shen PingPing (沈萍萍), Li ShaoShan (李韶山), L SongHui( 吕颂辉). Acta Hydrobiologica Sinica(水生生物学报), 2003, 27(4): 3673716 Li Meng (李 猛), Yuan DongXing( 袁东星),Lin QingMei (林庆梅). Chinese Journal of Applied Ecology(应用生态学报), 2007, 18(8): 184318487 Wiesemeier T, Pohnert G. J. Chromatogr. B, 2007, 850: 4934988 Yang G P, Jing W W, Kang Z Q, Zhang H H, Song G S. Marine Environ. Res., 2008, 65: 85979 Chambers S T, Kunin C M, Miller D, Hamada A. J. Bacteriol., 1987, 169: 4845484710 Jiao N Z, Liu C Z, Hong H S, Harada S, Koshikawa H, Watanabe M. Acta Botanica Sinica, 2003, 45 (7): 774786
