1、第八章 蛋白质分选与膜泡运输,第一节 细胞内蛋白质的分选第二节 细胞内膜泡运输,本章主要内容,第一节 细胞内蛋白质的分选,细胞质中合成的上万种蛋白质被分别运送到各自的特定部位，说明细胞中必定存在确保蛋白质准确分选、转运的机制。这是通过一定的结构和一系列复杂的过程来完成的。,一、信号假说与蛋白质分选信号,信号假说(signal hypothesis)指分泌蛋白N端序列作为信号肽，指导分泌性蛋白到内质网膜上合成，在蛋白合成结束之前信号肽被切除。它的提出源于1972年 C.Milstein等发现在骨髓瘤细胞中得到的免疫球蛋白分子的N端要比分泌到细胞外的免疫球蛋白的N端多出一截。,Gunter Blo
2、bel 在上述研究基础上，着重研究了转运出细胞的新合成的蛋白质如何与特定的细胞内质网相互作用的机理。他最先提出了“信号假说”：分泌出胞的蛋白质含有一种内在的信号可以引导他们准确的通过生物膜。这些信号是一段与蛋白整合在一起的氨基酸序列，并推测蛋白质是通过内质网膜上的一种通道来完成的。1975年，Blobel阐述了蛋白质跨膜的主要步骤。,通过与其他研究组的合作，Gunter Blobel发现蛋白质通过其他细胞器时具有相似的内源性信号。1980年提出了蛋白质跨膜定位的普遍机理。每种蛋白质可携带自身细胞定位的信号肽。这段特异的氨基酸序列决定了一种蛋白质是穿过特定细胞器膜、整合到细胞膜、还是分泌出胞的命
3、运。随后，信号假说不仅被证明是正确的，而且在生物界还是普遍存在的，在酵母、植物和动物细胞中具有相同的作用机理。,Gunter Blobel 因信号序列控制蛋白质在细胞内的转移与定位的研究成果，获1999年诺贝尔医学和生理学奖。,Germany,Gunter Blobel 60年代末加入了纽约Rockefeller研究院著名的George Palade细胞生物学研究室。在那里的二十年间，科学家们针对细胞结构和新合成蛋白质的出胞转运进行了深入的研究。,现已确认，指导分泌性蛋白在粗面内质网上合成的决定因素是蛋白质N端的信号肽（signal peptide）。细胞质基质中的信号识别颗粒（signal
4、recognition particle, SRP）和内质网膜上的信号识别颗粒受体（又称停泊蛋白，docking protein,DP）等因子协助完成这一过程,信号肽(signal piptide）指存在于蛋白质的N端，通常有16-26个氨基酸残基，其中包括疏水核心区、信号肽的C端和N端3个部分。,SRP是一种核糖核蛋白复合体，由6种多肽和1个7S 的RNA组成的复合物，它既可与新生肽信号序列和核糖体结合，又可与停泊蛋白结合。,SRP have three main active sites:One that recognizes and binds to ER signal sequence
5、;One that interacts with the ribosome to block further translation;One that binds to the ER membrane (docking protein),信号识别颗粒 (signal recognition particle, SRP),信号识别颗粒受体 (SRP receptor),信号识别颗粒受体(SRP receptor)，又称停泊蛋白(docking protein,DP)，由两个亚基组成，可特异地与SRP结合并起始肽链向内质网腔转运，使肽链延长继续进行。亚基具有GTP酶活性。,易位子 (translo
6、con),易位子(Translocon)位于内质网膜上，直径约 8.5 nm 的通道蛋白，是中心有一直径为2 nm 通道的蛋白复合体，参与新生蛋白的转运。,转位链相关膜蛋白translocating chain-associated membrane protein,TRAM protein,Sec61蛋白(酵母secretion gene 产物)，易位子的主要成分，在哺乳动物细胞中，Sec61p与Sec61和Sec61 形成复合物，能与核糖体大亚基紧密结合，从而把核糖体与内质网膜连接起来。,共转移 (cotranslocation)：肽链边合成边转移至内质网腔中的转运方式，也叫翻译同步转运。
7、,分泌蛋白等在内质网膜上的合成与转运,开始转移序列(Start-transfer Sequence)，引导肽链穿过内质网膜的信号肽序列；停止转移序列(Stop-transfer Sequence)，与内质网膜有很强的亲和力而结合在脂双层之中，这段序列不再转入内质网腔中。,跨膜疏水区,膜结合核糖体的蛋白质合成与转运,Synthesis and insertion into the ER membrane of the GLUT1 glucose transporter and other proteins with multiple transmembrane a-helical segment
8、s. The N-terminal a helix functions as an internal, uncleaved signal-anchor sequence (red), directing binding of the nascent polypeptide chain to the rER membrane and initiating cotranslational insertion. Both SRP and the SRP receptor are involved in this step. Following synthesis of helix 2, which
9、functions as a stop-transfer membrane-anchor sequence, extrusion of the chain through the translocon into the ER lumen ceases. The first two a helices then move out of the translocon into the ER bilayer, anchoring the nascent chain as an a-helical hairpin. The C-terminus of the nascent chain continu
10、es to grow in the cytosol. Subsequent a-helical hairpins could insert similarly, although SRP and the SRP receptor are required only for insertion of the first signalanchor sequence. Although only six transmembrane a helices are depicted here, GLUT1 and proteins of similar structure have twelve or m
11、ore. H. P. Wessels et al., Cell 55:61.,二、蛋白质分选的基本途径与类型,蛋白质分选大体可分为两条途径：共转移和后转移。共转移(cotranslocation)：肽链边合成边转移至内质网腔中的转运方式，也叫翻译同步转运。,后转移(post translocation)，蛋白质在细胞质基质中合成后，再转移到细胞器中，又称翻译后转运。如线粒体、叶绿体及过氧化物酶体中的蛋白转运。这种转运方式在蛋白质跨膜过程中不仅需要ATP使多肽去折叠，还需要一些蛋白的帮助(如热休克蛋白Hsp70)使其能够正确地折叠成有功能的蛋白。,分选途径,如果从蛋白质分选的转运方式或机制来看，
12、又可将其分为4类：,蛋白质的跨膜转运(transmembrane transport)：主要指在细胞质基质中合成的蛋白质转运到内质网、线粒体、质体(包括叶绿体)和过氧化物酶体等细胞器。膜泡运输(vesicular transport)选择性门控转运(gated transport)细胞质基质中的蛋白质的转运,蛋白质分选信号,每种蛋白质含有一种或多种信号序列或跨膜疏水区，从而决定了它们在细胞内的精确定位。信号序列（signal sequence）指存在于蛋白质一级结构上的线性序列，信号序列对所引导的蛋白质没有特异性要求，每一种信号序列决定特殊的蛋白质转运方向。进入内质网称内质网信号肽序列，进入线
13、粒体、叶绿体和过氧化物酶体的称导肽或前导肽(leader peptide)，以及后面要讲的核定位序列。,其它分选信号：存在于已合成的蛋白质中，能被特异的受体所识别，从而引导蛋白质到达合适的地点。如溶酶体分选信号M6P、内质网分选信号KDEL(赖-天-谷-亮)等。,信号斑（signal patch）：存在于完成折叠的蛋白质中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻，折叠在一起构成蛋白质分选的信号。,Wild-type: T-antigen in nucleus,Mutant-type: T-antigen in cytosol,蛋白质的合成与分选,参阅：彭佳师，龚继明. 信号肽与蛋白质的分选转运.
14、植物生理学报，2011，47（1）：9-17.,三、细胞内的膜泡运输,细胞必须具有精确而有效地机制，确保在粗面内质网上合成的各种蛋白质，在高尔基体TGN等结构中通过形成不同的转运泡而被分选、运输，并在特定时间和位点发挥其特定功能。完成细胞内的膜泡运输至少需要10种以上的运输小泡，每种小泡表面都有特殊的标志以保证其物质的准确运输。目前，了解较清楚的有3种有被小泡，分别是：COP有被小泡COP有被小泡网格蛋白有被小泡,1.COP有被小泡的组装与运输,介导从内质网到高尔基体的物质运输。由5种蛋白亚基组成，首先从酵母中鉴定。其中Sar为一种小G蛋白，调节膜泡的装配与去装配。COP有被小泡是通过可溶性包
15、被蛋白COP复合物在内质网膜上组装形成的。ER腔中的可溶性蛋白通过与选择性跨膜蛋白腔面一端结合而被募集。同时，选择性跨膜蛋白胞质面一端的信号序列以及v-SNARE被COP蛋白识别，从而形成包含有货物的有被小泡。随后在小分子GTP结合蛋白（Sar1）的参与下脱被并定位到高尔基体的cis面。脱被后暴露的v-SNARE与高尔基体cis面的同类蛋白t-SNARE相互配合，介导膜泡和靶膜融合，内含物释放进入高尔基体。被脱去的包膜蛋白再循环利用。,动物细胞中已发现20多种SNAREs，位于运输小泡上的叫作v-SNAREs，位于靶膜上的叫作t-SNAREs。v-和t-SNAREs都具有一个螺旋结构域，能相互
16、缠绕形成跨SNAREs复合体（trans-SNAREs complexes），将运输小泡的膜与靶膜拉在一起，实现运输小泡特异性停泊和融合。,2.COPI 衣被小泡,功能：负责回收、转运内质网逃逸蛋白（escaped proteins）返回内质网，由7种蛋白组成。回收信号：Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）。内质网的膜蛋白（如SRP受体）在C端有一个不同的回收信号Lys-Lys-X-X。COPI 还可以介导高尔基体不同区域间的蛋白质运输。,COPI含有7种蛋白亚基，其中ARF是一种调节膜泡转运的GTP结合蛋白，包被蛋白复合物的装配与去装配依赖于ARF。,顺行转运(anterograde
17、transport)逆行转运(retrograde transport),3. 网格蛋白有被小泡,相关运输途径：,结构：由3个重链和3个轻链组成，形成一个具有3个曲臂的形状。许多笼形蛋白的曲臂部分交织在一起，形成具有5或6边形网孔的笼子。衔接蛋白(adaptin)：介于笼形蛋白与配体受体复合物之间，起连接作用。目前至少发现4种，分别结合不同类型的受体，形成不同性质的转运小泡。,一种小分子GTP结合蛋白，在深陷有被小窝的颈部装配成环，发动蛋白水解与其结合的GTP引起颈部缢缩，最终脱离质膜形成网格蛋白有被小泡。,发动蛋白（dynamin）,介于网格蛋白与配体受体复合物之间，起连接作用。目前至少发现
18、4种，分别结合不同类型的受体，形成不同性质的转运小泡。,连接蛋白（adapter protein/ adaptin ）,4. 膜泡运输的定向机制选择性融合是保证细胞内定向膜流的因素之一,SNAREs：soluble NSF attachment protein receptor,NSF：N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感因子，具ATP酶活性,SNAP：soluble NSF attachment protein,选择性融合主要是由下列蛋白的作用造成的：,SNAREs in vesicle transport,Rab蛋白(Rab protein)在小泡运输与融合中的调节作用,Rab蛋白是一类调节型的单体
19、GTPase, 所有的Rab蛋白都是由大约200个氨基酸组成的。它能够结合GTP并将其水解,因此认为Rab蛋白通过GTP的循环来调节小泡的融合,供体膜上的鸟嘌呤核苷释放蛋白(GNRP)识别胞质溶胶中特异的Rab蛋白，诱导GDP的释放并和GTP结合，进而改变Rab蛋白的构型，改变了构型的Rab蛋白暴露出其脂基团，从而将Rab蛋白锚定到膜上。运输小泡形成后，在V-SNARE的引导下，到达受体膜的T-SNARE部位，Rab帮助小泡与受体膜结合。Rab蛋白上的GTP水解后从膜中释放出来，而小泡却锁定在受体膜上，释放出的Rab进入胞质溶胶进行再利用, 运输小泡通过小泡膜中的V-SNARE与靶膜T-SNR
20、E/SNAP25复合物的细胞质结构域相互作用,形成螺旋结构,使运输小泡附着到受体膜。小泡膜中的Rab蛋白作为小泡寻靶和融合的定时器； 通过多个V-SNARE与靶膜T-SNRE相互作用以及ATP的水解形成预融合复合物； 预融合开始之后立即进行融合,但详细机理不清； 在融合过程中,相互作用的蛋白进行解离,如T-SNARE/V-SNARE/SNAP25相互分开,促进了进一步的融合； 含有V-SNARE小泡的形成并回到原始膜中。,四、细胞结构体系的装配,自我装配(self-assembly)：装配信息存在于装配亚基本身；协助装配(aided-assembly)：需要其它成分的介入或对装配亚基进行修饰；直接装配(direct-assembly)：某种亚基直接装配到已形成的结构上；细胞结构的装配结构体系之间的装配,装配的生物学意义,减少和校正蛋白质合成中出现的错误；可大大减少所需的遗传物质的信息量；通过装配与去装配更容易调节与控制多种生物学过程。,思 考 题,1. 为什么细胞膜蛋白的N端很多在细胞的外侧？如果在细胞膜的内侧，我们可以判定蛋白来源于哪种途径及其发生的事件？2. 概述细胞内蛋白质分选的整个过程。3. 内质网、高尔基体等是如何保持其特异性结构的？,
