1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全生物传感器对食品中致病菌的检测一、选题的背景与意义（一）选题的背景随着经济全球化进程的加快，食品安全已成为当今世界性公共卫生热点。食品中致病菌在条件合适时增长极快，可引发各种流行性疾病。对其中主要致病菌，如大肠杆菌OL57H7、李斯特氏菌、伤寒沙门氏菌等进行实时在线监测对于食品安全意义重大。目前通用的检测方法由分离培养、镜检观察、生化鉴定等组成，步骤繁琐且精度低。聚合酶链反应法，酶联免疫吸附法等也均需通过富集、分离、形态学检测、生物化学和血清学测试来鉴别，虽比传统方法需要的检测时间短，但仍达不到实际要求。因此建立一种快速、方便、可靠的食品中主要致病菌安全检
2、测技术，以防止传染疾病和经济损失，是一个迫切的需求。（二）选题的意义本课题将高灵敏度的传感技术与特异性免疫反应结合起来,通过电流变化监测抗原抗体反应，研制出小巧、方便、灵敏度高，选择性强的电化学免疫传感器，用来快速检测食品中的主要致病菌。实验通过利用抗原抗体作为敏感元件，固定于载体膜上，构成传感器的敏感膜，即接受器，来检测样品中的抗体或抗原。由于抗原抗体的特异性反应，免疫传感器较其他生物和化学传感器有更高的专一性和选择性。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）研究的基本内容1利用铁卟啉（HEMIN），聚烯丙基盐酸盐（PAH），运用层层自组装技术，构筑免疫传感器。2了解传感器检测性能，建立抗
3、原与安培传感信号间的规律性关系。3运用免疫生物传感器检测食品中的致病菌（大肠杆菌OL57H7）。（二）拟解决的主要问题1抗原、抗体的固定方法。2免疫传感器的构建方法。3寻找免疫反应最适宜条件。三、研究的方法与技术路线（一）研究的方法1传感器的构建利用铁卟啉作为电子媒介体，将合成的纳米材料通过吸附、自组装、电沉积等物理化学方法修饰到电极的表面，构筑免疫传感器，用于抗原抗体等免疫蛋白的检测。2一步免疫法信号的变化即电流变化的量与抗原浓度有线性关系，根据这个线性关系进行定量检测。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度12010年9月至2010年12月阅读文献、查找资料、完成开题报告22010年11月
4、至2011年2月运用层层自组装技术构建出层层组装传感器，并研究传感器电化学性质。32011年2月至2011年3月测定该免疫传感器对食品中致病菌的循环伏安响应，对免疫分析条件进行优化。利用层层自组装技术构建传感器碳纳米管，纳米金等纳米材料用于提高电流信号修饰电极制备免疫传感器优化电极制备和免疫反应最适宜条件用于实际样品的测定,检测结果与标准方法进行比较42011年3月至2011年6月整理、总结资料以及研究成果，从理论上和可行性上加以阐述，写出论文。五、主要参考文献1范瑾瑾,俞纯山外国医学临床生物化学与检验学分册中华人民共和国卫生部,1995,164,1591602LEONARDP,HEARTYS
5、,QUINNJ,ETALAGENERICAPPROACHFORTHEDETECTIONOFWHOLELISTERIAMONOCYTOGENESCELLSINCONTAMINATEDSAMPLESUSINGSURFACEPLASMONRESONANCEBIOSENSBIOELECTRONJ2004,19133113353GUILBAULTGG,PRAVDAM,KREUZERMBIOSENSORS42YEARSANDCOUNTINGJANALLETT,2004,3714481144964乌日娜,李建科生物传感器在农药残留分析中的研究现状及展望JOOD检测样品一般不需要进行预处理，除缓冲液外无需其他
6、试剂样品中被测组分的分离和检测可以同时完成，分析操作简单可以实现连续监侧，容易实现自动化测量响应快，样品用量微对样品的清晰度即样品的混浊程度不作要求，生物传感器可以检测较混浊的样品，而不影响测定结果传感器连同侧定仪的成本远低于大型分析仪器，便于推广普及。鉴于这些优点，目前己经在农业、医药卫生等领域广泛应用。在食品领域中，生物传感器更是各学者研究的热点。3生物传感器在食品安全检测中的应用31食品中致病菌的检测KOUBOVA和VGERTIE等人5实现了用SPR生物传感器实时检测肠炎沙门氏菌（SALMONELLAENTERITIDIS）和单核细胞增生性李斯特菌（LISTERIAMONOCYTOGEN
7、ES）。该传感器的检测限是106CELLS/ML，灵敏性和标准ELISA相当。LIU等6用免疫磁分离技术和吸光率的测量实现了ESCHERICHIACOLIO157H7的快速检测,总检测时间不超过2H。SU等7研究了一个灵敏的、特定的、快速检测ECOLIO157H7的方法,该方法同时采用量子点QDS作为荧光标记和免疫磁性分离技术。研究结果表明在103107CFU/ML范围内，荧光发射强度的峰值和ECOLIO157H7的初始细胞浓度成比例，检测限比FITC方法至少要低100倍。总检测时间少于2H。LEONARDP8等人采用BIACORE3000生物传感器来检测LISTERIAMONOCYTOGEN
8、ES。他们首先将LISTERIAMONOCYTOGENES细胞和抗体孵育一小段时间，接着用逐步离心法来分离未被绑定的抗体。自由抗体流过经修饰的传感芯片表面，由此产生的响应信号与抑制细胞的浓度成反比。三十分钟内，检测限可达到1105CELL/ML。研究表明，该方法简单、快速，并且只需少量的样品准备。这种检测方法能够在样品有限的情况下，实现快速、灵敏的致病菌检测。SUBRAMANIAN等9研究了表面等离子体共振SPR免疫传感器检测ECOLIO157H7的灵敏性和特异性。他们采用自组装膜法固定抗体，把纯单克隆或者多克隆抗ECOLIO157H7抗体固定到传感器芯片表面，并对ECOLIO157H7进行直
9、接检测和抗体夹心检测。他们研究了蛋白G检测的效果和不同浓度的一抗、二抗下“三明治”检测的效果。研究结果显示“三明治”检测方法中,该传感器的检测限可达到103CFU/ML，且对肠炎沙门氏菌有很高的特异性。直接检测和蛋白G检测的检测限分别是106CFU/ML和104CFU/ML。因此，他们得出结论基于烷烃硫醇自组装膜的SPR生物传感器采用“三明治”方法,能够快速、特定的检测ECOLIO157H7。王凯等10使用集成化手持式SPREETATMSPR传感器快速检测沙门氏菌，利用亲和素生物素系统保证检测的准确性；利用沙门氏菌抗体的免疫吸附反应，保证结果的特异性；并引入复合抗体作为第二抗体以扩大检测的响应
10、信号，检测到鼠伤寒沙门氏菌的浓度为105CFU/ML，整个检测过程在1H内完成,从一定程度实现了食品中病原微生物的快速检测。李杜娟等11建立了一种采用电化学阻抗谱技术快速检测大肠杆菌O157H7的生物传感器，通过石英晶体金电极表面附着一层蛋白A膜来固定抗体的。该生物传感器采用了三电极系统工作电极石英晶体金电极、AG/AGCL/CLSAT参考电极和铂对电极。试验结果说明抗体的固定以及大肠杆菌O157H7与抗体的结合都增加了石英晶体金电极表面的电子传递阻抗，在FECN63/4氧化还原对存在的情况下，用电化学阻抗谱测量该阻抗。该免疫生物传感器的检测限是103CFU/ML,石英晶体金电极的电子传递阻抗
11、变化值和大肠杆菌O157H7的浓度在一定范围内呈线性关系，检测时间少于10MIN。32食品中农兽药残留检测ZHENG等12研制了一种基于固定化鸡肝酶的流动注射量热式生物传感器检测敌敌畏残留。他们用鸡肝酶代替乙酰胆碱酯酶作为生物识别元件,反应温度固定在40。当底物通过注射阀注入到系统中时,在酶反应室里发生催化反应,非酶反应产生的热通过参比室用来排除。用热电偶的传感器测量两个反应室的温度变化。在敌敌畏浓度为1MG/L和10MG/L的情况下,酶反应的抑制率分别为307和418。实验证明这种量热式生物传感器可用作农药的快速检测。蒋雪松等13建立了一种压电免疫生物传感器结合流动注射的方法检测样品中的农药
12、残留。为了有效地捕获有机磷农药抗原，比较了三种在石英晶体金电极表面上固定有机磷单克隆抗体的方法。实验表明在000510G/ML范围内，有机磷浓度与晶体频率的变化之间呈较好的相关关系。回归方程Y59111LNX51979，决定系数为093。该传感器的最低检测限为216103G/ML，选择性好，可以重复使用。MAURIZ14,15等制备了毒死蜱的单克隆抗体，并运用SPR生物传感方法检测了饮用水中的有机磷农药毒死蜱，最低检测限为55NG/L，此外该研究小组还运用SPR方法测定了水中的有机氯农药DDT、有机磷农药毒死蜱和氨基甲酸酯类农药化合物，各自最低检测限分别为20,50,09NG/L。黄强力等16
13、利用SPR生物传感器快速检测动物源性食品中残留的醋酸甲羟孕酮（MPA）,对抗原的固定条件、抗体的浓度及芯片再生条件进行了优化,，同时对抗体的稳定性及特异性进行了分析。结果显示，该方法检测的最低限约为1NG/ML。利用模拟标本进行平行测试表明,其与进口ELISA检测试剂盒结果基本一致。SPR生物传感器检测MPA，单个样品的检测时间小于5MIN,非常适合现场的快速检测,具有广泛的应用前景。李辉等17利用表面等离子体共振生物传感器对莱克多巴胺抗体与固定在芯片表面的莱克多巴胺衍生物的相互作用进行了分析，解离常数为256106S1。根据一定范围内相对响应值和时间近似呈线性关系的动力学特性，建立了连续检测
14、的方法，从而简化了实验步骤，有利于提高芯片的使用寿命。检测莱克多巴胺采用抑制法，将莱克多巴胺衍生物固定在芯片的表面，莱克多巴胺抗体与样品混合后流过芯片的表面，所得相对响应值与样品中莱克多巴胺的浓度成反比。单个样品的检测时间设定为15MIN，对应的检出限小于4G/L。33食品中其他物质的检测GUSTAVSSON等18用基于生物传感器的表面等离子共振SPR设计了检测牛奶中内酰胺类抗生素的实验。将带有羧肽酶活性的微生物受体蛋白用作探测分子，在内酰胺类抗生素存在时，受体蛋白和抗生素之间形成稳定的复合物，抑制了蛋白酶的活性，从而可以通过酶活性的降低值,定性地检测出牛奶中的青霉素G。这种方法的检测极限为2
15、6G/KG，低于欧洲4G/KG的最大残留限MRL。CARLACROSA等19利用光学生物传感器对亚硝酸盐进行检测，用络合沉淀凝胶法CPG法将一种亚硝酸盐还原酶固定在光纤一端的可控微孔玻璃珠上，当亚硝酸盐与酶发生接触反应时，会发生一系列分光变化，且这种光学变化与亚硝酸盐的浓度在一定范围内呈线性关系，通过检测这些光学变化即可对亚硝酸盐进行定量分析。其检测限为093MOL/L，大大低于欧盟所要求的最大限量22MOL/L。上海交通大学农业与生物学院的研究人员根据竞争酶免疫反应原理设计的传感器在检测肉类食品中的激素残留获得了较好的效果。其设计的己烯雌酚传感器是由过氧化氢电极和己烯雌酚抗体膜组成,将一定量
16、的过氧化氢酶标记的己烯雌酚加到待测样品中,酶标记的及未标记的己烯雌酚会与膜上的己烯雌酚抗体发生竞争反应,测定酶标己烯雌酚与抗体的结合率便可知食品中己烯雌酚的含量20。CARTER等人21利用光纤免疫传感器来测定花生和玉米抽提物中的AFB1,检测限可达005NG/ML。KREUZER22等人用酶免疫传感器法检测河豚毒素TTX。实验结果线性范围为01100NG/ML,最低检出限为0016NG/ML。FREVERT等人23采用荧光标记抗体生物传感器测定肉毒梭菌毒素,利用抗原固定化到波导表面上,并与荧光标记抗体反应,样品中游离抗原抑制抗体的结合,从而利用荧光强度的降低,达到定量分析的目的，结果表明该方
17、法可测定200NG/ML的毒素。RASOOLY24等用抗体作为检测器做成了一个实时生物传感器，用于检测牛奶、热狗等食品中的葡萄糖球菌肠毒素，灵敏度可达10100NG/G，而且检测过程不超过4MIN。石婷25等采用基于表面等离子体共振技术的光学传感器，通过自组装分子技术将单克隆抗体固定到传感器金膜表面用于检测对应抗原，即待测抗生素，并记录传感器表面液体折射率的变化曲线，其反映了被吸附抗生素的浓度的大小。对不同浓度的氨苄青霉素水溶液进行了测定，得到该传感器的工作曲线，整体工作曲线呈单调上升，且线性关系较好，同时得到了该检测方法的最低检测极限为125NG/ML，明显低于欧盟规定的最大残留限量4G/K
18、G。4展望食品安全检测过程中，常常经过繁杂的前处理,需要大量复杂、昂贵的仪器，且难于实现现场检测，生物传感器的研发和使用不仅减少了分析时间,提高了灵敏度，使测定过程变得更为简单,便于实现自动化。但因其起步较晚，针对目前的研究现状与发展实际,在实际推广应用前,还有许多需要探索和改进的地方。开发新一代低成本、高灵敏度、高稳定性和高寿命的生物传感器已成了目前研究的热点。相信不久的将来，随着生物学、化学、物理学、电子学、材料等技术的不断进步,生物传感器将在食品安全检测和整个农业工程领域里被广泛应用。参考文献1范瑾瑾,俞纯山外国医学临床生物化学与检验学分册中华人民共和国卫生部,1995,16415916
19、02LEONARDP,HEARTYS,QUINNJ,ETALAGENERICAPPROACHFORTHEDETECTIONOFWHOLELISTERIAMONOCYTOGENESCELLSINCONTAMINATEDSAMPLESUSINGSURFACEPLASMONRESONANCEBIOSENSBIOELECTRONJ2004,19133113353GUILBAULTGG,PRAVDAM,KREUZERMBIOSENSORS42YEARSANDCOUNTINGJANALLETT,2004,3714481144964乌日娜,李建科生物传感器在农药残留分析中的研究现状及展望JFOODECOLI
20、LAYERBYLAYERPAHHEMIN1引言现今，随着改革开放的发展和人民物质生活水平的提高，人们对食品营养成分和食品安全也越来越关注。然而，近些年来，由疯牛病、禽流感、口蹄疫、二恶英、苏丹红,三聚氰胺等引发的重大食品安全问题在世界各地频频发生，严重威胁着人类的生命和健康，阻碍着全球食品贸易的发展。食品安全问题日趋成为人们关注的焦点，并发展成为一个世界性的问题。确保食品安全卫生,最大限度的降低风险,已成为现代食品行业所追求的核心管理目标,也是各国政府不断加大对食品安全行政监督管理力度重要方向。民以食为天，食以安为先。食品安全问题乃是关系国计民生的重大问题，应引起我们的高度重视。食品中致病菌如
21、大肠杆菌OL57H7、李斯特氏菌、伤寒沙门氏菌等在条件合适时增长极快，可引发各种流行性疾病。美国疾病控制和预防中心CDC估计，美国每年由上述几种致病菌造成大约7600万例疾病，3215万例住院治疗，5200例死亡1，而由此造成的医疗花费和生产力损失，每年达2967亿美元2。在我国，水产品中主要致病菌危害非常严重。1999至2000年，在中国江苏、上海、浙江发生了较大规模的ECOLIOL57H7爆发，可能是迄今为止世界上流行规模最大的一次3，卫生部通过中国CDC直报系统共收到中毒报告596起，中毒18063人，死亡196人，涉及100人以上的食物中毒17起，对我国经济造成了重大损失。因此，我国已
22、将食源性致病菌检测技术列入“十一五”重点项目之一。肠杆菌科是由多个菌属组成的，生物学性状类似，均为革兰氏阴性杆菌，这些细菌通常寄居在人和动物的消化道，并随着粪便排出体外，广泛的分布在水和土壤中，大多数肠道杆菌属于正常菌群，当机体免疫力降低，侵入肠道外组织时，成为条件致病菌而引起疾病4。大肠杆菌属于细菌，是ESCHERICH在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物，根据不同的生物学特性将致病性大肠杆菌分为5
23、类致病性大肠杆菌EPEC、肠产毒性大肠杆菌ETEC、肠侵袭性大肠杆菌EIEC、肠出血性大肠杆菌EHEC、肠黏附性大肠杆菌EAEC。常用的大肠杆菌检测方法有细菌学分离、免疫学检测、分子生物学检测。以大肠杆菌O157H7为例做介绍大肠杆菌O157H7的细菌学分离方法包括样本采集与增菌、免疫磁珠富集与培养、生化反应、血清学和毒力因子鉴定等步骤5，其具体操作过程如图1所示。图1大肠杆菌O157H7的检验程序细菌学分离技术准确性高，无需大型设备，易于在基层推广。但是它也有检测限低，需要两次增菌，耗时长的缺点。免疫学检测方法的基本原理是抗原和抗体的特异性反应。其检测方法简便、快速、灵敏度高、特异性强，是食
24、品检测技术中的一个重要组成部分。常用的免疫学检测方法有以下几种ELISA的基本原理是预先结合在固相载体上的抗体或抗原分子与样品中的抗原或抗体分子在一定条件下进行免疫学反应,免疫复合物所携带的酶分子可将特定的底物分子转化为具有特定颜色的化合物,并由颜色的深浅反映样品中抗原或抗体分子的量。该方法具有灵敏、特异、快速、稳定以及易于自动化操作等特点。赵志晶6等研究获得了抗肠出血性大肠杆菌0157H7的多克隆抗体,建立了用于食品样品检测的双抗ELISA检测方法。该方法对纯培养菌液检测限为103104CFU/ML只对0157菌株有特异性反应,对非0157菌株无交叉反应经过增菌,鸡肉与牛奶染菌样品中的大肠杆
25、菌0157的检出下限均为01CFU/GML。荧光免疫测定法是以荧光素作为标记物，将免疫反应的特异性与灵敏性结合，通过荧光分光光度计测量荧光强度，推算待测物质的浓度。这种技术已被广泛应用。YU等利用该法来检测苹果酒中的大肠杆菌O157H7，可在6H内检测出大肠杆菌O157H7（101105CFU/ML）。该法超过了放射性同位素标记所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备方便，储存时间长，无放射性污染，检测重复性好，操作流程断，标准曲线范围宽，应用范围广等优点。化学发光免疫分析法利用化学发光物质作为标记物，将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合进行检测。免疫胶体金标记技术是以胶体金
26、作为示踪标志物，应用于抗原抗体的一种新型免疫标一记技术。该法具有快速反应的特点，但只能作为大肠杆菌的定性或半定量检测。分子生物学检测中的聚合酶链式反应，简称PCR，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，是近年来用于检测和研究各自致病微生物的新技术。但该方法往往需要大型的设备和专业的知识及研究人员，不利于推广。生物传感器是将生物识别元件和信号转换元件紧密结合,从而检测目标化合物的分析装置7。生物传感器中生物识别元件有酶、抗体抗原、微生物、细胞、动植物组织、基因
27、等生物传感器的信号转换元件则包括电化学电极、半导体、光学元件如光纤、表面等离子共振、热敏元件、压电装置如石英晶体微天平、表面声波等。不同的生物识别元件和信号转换元件组成了不同的生物传感器,它们的命名也因此而得来。其基本原理为待测物质和分子识别元件特异性结合,发生生物化学反应,产生的生物学信息通过信号转换器转化为可以定量处理的电、光等信号,再经仪表放大和输出,从而达到分析检测的目的。与传统的分析方法相比，生物传感器具有如下优点8敏感物质经固定化可重复使用检测样品一般不需要进行预处理，除缓冲液外无需其他试剂样品中被测组分的分离和检测可以同时完成，分析操作简单可以实现连续监侧，容易实现自动化测量响应
28、快，样品用量微对样品的清晰度即样品的混浊程度不作要求，生物传感器可以检测较混浊的样品，而不影响测定结果传感器连同侧定仪的成本远低于大型分析仪器，便于推广普及。鉴于这些优点，目前己经在农业、医药卫生等领域广泛应用。在食品领域中，生物传感器更是各学者研究的热点。KOUBOVA和VGERTIE等人9实现了用SPR生物传感器实时检测肠炎沙门氏菌（SALMONELLAENTERITIDIS）和单核细胞增生性李斯特菌（LISTERIAMONOCYTOGENES）。该传感器的检测限是106CELLS/ML，灵敏性和标准ELISA相当。SU等10研究了一个灵敏的、特定的、快速检测ECOLIO157H7的方法,
29、该方法同时采用量子点QDS作为荧光标记和免疫磁性分离技术。研究结果表明在103107CFU/ML范围内，荧光发射强度的峰值和ECOLIO157H7的初始细胞浓度成比例，检测限比FITC方法至少要低100倍。总检测时间少于2H。LEONARD等人11采用BIACORE3000生物传感器来检测单核细胞增生性李斯特菌。他们首先将单核细胞增生性李斯特菌细胞和抗体孵育一小段时间，接着用逐步离心法来分离未被绑定的抗体。自由抗体流过经修饰的传感芯片表面，由此产生的响应信号与抑制细胞的浓度成反比。三十分钟内，检测限可达到1105CELL/ML。研究表明，该方法简单、快速，并且只需少量的样品准备。这种检测方法能
30、够在样品有限的情况下，实现快速、灵敏的致病菌检测。王凯等12使用集成化手持式SPREETATMSPR传感器快速检测沙门氏菌，利用亲和素生物素系统保证检测的准确性；利用沙门氏菌抗体的免疫吸附反应，保证结果的特异性；并引入复合抗体作为第二抗体以扩大检测的响应信号，检测到鼠伤寒沙门氏菌的浓度为105CFU/ML，整个检测过程在1H内完成,从一定程度实现了食品中病原微生物的快速检测。LIU13等将涂有抗沙门氏菌的磁珠通过特定的抗体抗原在室温下相互作用30分钟，来分离样品溶液中的沙门氏菌。然后，通过把从样品溶液中捕获的磁珠和标有碱性磷酸酶的抗沙门氏菌在室温下捆绑30分钟从而形成“三明治”复合物（涂有抗沙
31、门氏菌的磁珠，沙门氏菌，标有碱性磷酸酶的抗沙门氏菌）。“三明治”复合物通过磁场和P硝基苯磷酸基在37温育30分钟，用酶水解来生成P硝基酚，从而从溶液中被分离出来。细胞数量通过测定404NM吸光度下P硝基酚的量而确定。在22104和22106菌落形成单位（CFU）ML1发现了一个线性反应。整个检测过程可在2小时内完成。ASHWIN14等利用SPR生物传感器和液相色谱串联质谱法来检测食品中的氯霉素和氯霉素葡糖甘酸，该方法已被证实符合欧盟最新要求（委员会决定2002/657/EC）。筛选和证明方法的计算结果范围（CC）和检测能力（CC）分别小于01和02GKG1。将高灵敏度的传感技术与特异性免疫反应
32、结合起来,用以检测抗原抗体反应的生物传感器称作免疫传感器，是生物传感器中一大分支15。免疫传感器利用了抗体抗原反应的高亲合性和分子识别能力，使其具有实时输出、分析灵敏度高、特异性强、使用简便而且成本低的优点，已逐渐在食品工业、环境监测与处理、生物学技术及临床诊断等许多领域得到广泛应用1,16。安培免疫传感器的原理步骤17首先通过一个竞争或夹心式的免疫反应将抗体（抗原）结合在电极表面，用一步或多步清洗步骤洗去表面没有特异性结合的物质，以排除非特异性吸附的影响，然后通过免疫反应，引起测试体系的电流变化并进行测定。根据电流变化和检测抗原（抗体）含量成正比的特点，达到检测目标物的效果。电化学过程与电极
33、材料的表面积有关，当物理量小到纳米级时，表面积有数量级的变化，会带来材料性能上的变化，化学性能出现新的趋向。所以如果将纳米材料修饰在电极的表面，基于其尺寸效应等特性，电极呈现表面电催化作用，降低底物过电位，使可能的干扰及背景降至最小，可以用于许多微量的生物活体样品的分析。纳米碳管的管壁中存在有大量拓扑学缺陷,因此碳纳米管的表面本质上比其它的石墨变体具有更大的反应活性。纳米碳管的端部因有五元环的缺陷以及由缺陷引起的维度弯曲,使其反应活性增加。利用这一特性,通过适当的氧化反应可使碳纳米管脱帽、开口。由于碳纳米管的弯曲使电荷在其中的传输比石墨更快,将其修饰在电化学的工作电极上,能表现出更大的传递速率
34、18。本实验将碳纳米管有效地修饰在玻碳电极表面,形成的修饰层对电化学活性物质具有催化作用,提高检测灵敏度,降低氧化反应过电位,提高电极的选择性和稳定性。本实验构建的是一个层层组装的电化学免疫传感器，层层组装技术是近十几年来发展起来的一种新技术，该技术是利用静电吸附，使带正电荷的物质与负电荷的物质交替吸附在电极表面，从而构建出层层组装生物传感器。其主要的优点在于其具有较好专一性，信号强，灵敏度高，检出下限低，能较好实现痕量检测，且低成本。本实验中正电荷是聚烯丙基盐酸盐（PAH）,负电荷是高铁血红素（HEMIN）,通过其电荷间的静电吸引来构建传感器。实验中各溶液的修饰采用吸附法19（直接法）用含抗
35、体或抗原的溶液涂覆或浸泡电极，通过物理或化学吸附作用使其表面生成具有识别功能的生物膜。2材料与方法21试剂与仪器CHI660电化学工作站上海辰华仪器公司，仪器装置图见图2。三电极系统分别为玻碳电极为工作电极，饱和氯化亚汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极；SC15型数控超级恒温槽宁波天恒仪器厂；THZ82B气浴恒温振荡器江苏省金坛市医疗仪器厂；双目生物显微镜上海蔡康光学仪器有限公司；电子天平（110G/01MG）常熟市百灵天平仪器有限公司；实验室PH计梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；单层碳纳米管CNTTIMENANO公司，纯度99WT；铁卟啉，即高铁血红素（HEMIN）SIGMA公司；聚烯丙烯盐
36、酸盐（PAH）SIGMA公司；磷酸二氢钾分析纯，国药集团化学试剂有限公司；纳米金（30NM）NEWBURYPORT,MA01950USA；牛血清白蛋白BSA北京鼎国生物技术有限责任公司；氢氧化钠分析纯，上海山海工学团实验二厂；盐酸分析纯，上海山海工学团实验二厂；人大肠杆菌ELISA检测试剂盒上海安迪生物技术有限公司；大肠杆菌阳性标本宁波大学生命学院微生物实验室提供；超纯水艾科浦公司，比电阻达到13MCM；图2CHI660电化学工作站仪器装置图22实验方法221溶液的配制PBS缓冲溶液，01MOL/L，磷酸二氢钾水，1MOL/LNAOH调节PH，PH7。CNT，碳纳米管，4MG/ML，水碳纳米管
37、（水可以用氮氮二甲基甲酰胺代替，一般水溶液配置的CNT用于丝网电极，丝网电极不能用氮氮二甲基甲酰胺配置的CNT。配置完后置于气浴恒温振荡器上震荡，使其混合均匀。TPP，铁卟啉，4MG/ML，水铁卟啉，然后加微量氨水（加入的氨水只要保证碳纳米管溶解就好）。配制完后置于4冰箱中冷藏。PAH，聚烯丙烯盐酸盐，3MG/ML，水聚烯丙烯盐酸盐，配制完后置于4冰箱中冷藏。BSA，牛血清白蛋白，3MG/ML，水牛血清白蛋白，配制完后置于4冰箱中冷藏。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，蛋白胨10G牛肉膏3GNACL5G琼脂1517G水1000ML。将除琼脂外的各成分溶解于水中，以1MOL/LNAOH溶液校正PH74，分
38、装三角瓶，而后按培养基的量加入1517琼脂，01MPA灭菌20MIN后倒平板备用。222电化学工作站的参数设置循环伏安法的起始电位为0V，终点电位为08V，扫描速度为01V/S，静息时间为2S。采样间隔为0002V。具体如图3所示。图3循环伏安法参数223生物传感器的构建1在磨光的玻碳电极上修饰上4MG/ML的碳纳米管（CNT）5UL，于红外灯下烤干，用超纯水冲洗后置于电化学工作站扫描至稳定。据文献报道，碳纳米管（CNT）可以很好的提高导电性，增强电流信号。2在电极上修饰上4MG/ML的铁卟啉（TPP）5UL，于红外灯下烤干，用超纯水冲洗后置于电化学工作站扫描至稳定。TPP是本实验的电子媒介体
39、，由于CNT与TPP都具有共轭大键，所以两者之间可以很好的结合。3在电极上修饰上3MG/ML聚烯丙烯盐酸盐（PAH）5UL，于红外灯下烤干，用超纯水冲洗后置于电化学工作站扫描至稳定。由于TPP同时又带有很多的负电荷，所以又可以吸附带有很多正电荷的聚烯丙基盐酸盐（PAH）。4重复地在玻碳电极上修饰TPP和PAH，一层带正电荷的PAH吸附一层负电荷的TPP，算作传感器上的一层。找出能使电流信号最大扩增的层数即最佳层数。5在上述玻碳电极上修饰上纳米金，用来吸附抗体。生物传感器基本构建完成。其基本构建程序如图4所示。图4生物传感器基本构建程序图224大肠杆菌标准曲线的绘制取大肠杆菌试剂盒中的抗原标准品
40、（400NG/UL）1UL加标准品稀释缓冲液至100UL，以199的比例配制成4NG/UL的浓度，混合均匀，用移液器吸取10UL与990UL稀释缓冲液混合，配成004NG/UL的浓度。用移液器吸取004NG/UL浓度的抗原1UL于干净的无菌玻璃片上，静置几分钟，将玻璃片放在显微镜下，先用低倍镜找到计数区域，再用高倍镜进行计数。重复该步骤3次，取平均值，计算出每NG抗原标准品中含有的细菌个数。在上述CNTTPPPAH5AU层层组装构建而成的生物传感器上修饰上抗ECOLI抗体2UL，在室温下自然吹干，用超纯水冲洗后置于电化学工作站扫描至稳定。因吸附完抗体，纳米金颗粒周围有未结合的位点，故再修饰上3
41、MG/ML的BSA，在37温育30MIN，用超纯水冲洗后置于电化学工作站扫描至稳定。取前面配制好的4NG/UL浓度的抗原2UL修饰于上述电极上，在37温育15MIN，用超纯水冲洗后置于电化学工作站扫描至稳定。重复该步骤，观察随抗原质量的增多，其对应峰值电流的变化。以抗原质量对峰值电流作图即可绘出标准曲线，计算出Y和X的线性回归方程YKXBB为截距，K为斜率225最适PH条件的确定取7份01MOL/L的PBS缓冲液5ML，用浓度为01MOL/L的NAOH溶液和01MOL/L的稀HCL将PBS缓冲液的PH值分别调至45，50，55，60，65，70，75。在磨光的玻碳电极上修饰上4MG/ML的碳纳
42、米管（CNT）5UL，于红外灯下烤干，用超纯水冲洗后浸入PH45的PBS缓冲液，用电化学工作站扫描至稳定。再在电极上修饰上4MG/ML的铁卟啉（TPP）5UL，于红外灯下烤干，用超纯水冲洗后浸入PBS缓冲液，用电化学工作站扫描至稳定。最后在电极上修饰上3MG/ML聚烯丙烯盐酸盐（PAH）5UL，于红外灯下烤干，用超纯水冲洗后浸入PBS缓冲液，用电化学工作站扫描至稳定。在PH为50，55，60，65，70，75的PBS溶液中重复上述步骤。226最适温度的确定取6份5ML的PBS缓冲液01MOL/L,PH70分别置于冰水混合物或温水中温育，使其温度为5，10，15，20，25，30。在磨光的玻碳电
43、极上修饰上4MG/ML的碳纳米管（CNT）5UL，于红外灯下烤干，用超纯水冲洗后浸入5的PBS缓冲液，用电化学工作站扫描至稳定。再在电极上修饰上4MG/ML的铁卟啉（TPP）5UL，于红外灯下烤干，用超纯水冲洗后浸入PBS缓冲液，用电化学工作站扫描至稳定。最后在电极上修饰上3MG/ML聚烯丙烯盐酸盐（PAH）5UL，于红外灯下烤干，用超纯水冲洗后浸入PBS缓冲液，用电化学工作站扫描至稳定。在温度为10，15，20，25，30的PBS溶液中重复上述步骤。227生物传感器对实际样品中大肠杆菌的检测取微生物实验室提供的大肠杆菌阳性标本一环，用生理盐水稀释至10ML制成大肠杆菌悬液。生物传感器测定取大
44、肠杆菌悬液2UL修饰在上述CNTTPPPAH5AUABBSA层层组装而成的电化学免疫传感器，在最佳实验条件下于电化学工作站中扫描，读出其峰值电流。重复3次，取平均值。将该峰值电流代入上述的线性回归方程YKXBB为截距，K为斜率中，计算出大肠杆菌的质量，并折算成个数，算出每毫升上述大肠杆菌悬液中的大肠杆菌个数。平板菌落计数法取无菌平皿9套，分别用记号笔标明104、105、106各3套。另取6支盛有45ML无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明101、102、103、104、105、106。用1ML无菌吸管精确地吸取05ML大肠杆菌悬液放入101的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内
45、液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自101试管吸05ML放入102试管中，吸吹三次，依次类推至106。用3支1ML无菌吸管分别精确地吸取104、105、106的稀释菌液02ML，对号放入编好号的无菌培养皿中。于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基约1015ML，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37温室中培养。培养24小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算每毫升中总活菌数同一稀释度三次重复的菌落平均数稀释倍数5。一般选择每个平板上长有3
46、0300个菌落的稀释度计算每毫升的菌数最为合适。同一稀释度的三个重复的菌数不能相差很悬殊。由104、105、106三个稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬殊，如相差较大，表示试验不精确。将上述两种方法的测定结果对比。3结果和分析31TPP与PAH的修饰层数对电流信号的影响运用层层组装构建生物传感器的目的就是提高电信号，将层层修饰后的玻碳电极置于电化学工作站扫描，得到不同阶段修饰电极的循环伏安曲线，其结果如图5所示。图5不同（TPPPAH）层数下的峰值电流由图5可见，随着修饰层数的增加，峰值电流不断增强，到第五层达到最大值。当（TPPPAH）的修饰层数大于5时，其峰值电流反而下降。研究
47、表明，（TPPPAH）的最佳修饰层数为5层，此时，电流扩增最明显。32大肠杆菌标准曲线的建立用移液器吸取004NG/UL浓度的抗原稀释液1UL于干净的无菌玻璃片上，用显微镜计数，其3次计数结果分别为15、17、14，取其平均值为15，故每NG抗原标准品中含有大肠杆菌375个。在CNTTPPPAH5AUABBSA层层组装而成的电化学免疫传感器上重复的修饰上4NG/UL的抗原2UL，电极表面的抗原质量以8的倍数逐渐增加，在不同的抗原量下，其对应的峰值电流如表1所示表1不同质量抗原标准品对应的峰值电流M（NG）0816243240485664IP（105A）257524582275216321502
48、066183618311546由表1可见，随着抗原标准品质量的增加，其在电化学工作站中扫描后的峰值电流逐渐降低，说明抗原抗体发生了特异性免疫反应。以抗原质量M为X轴，峰值电流IP为Y轴，作图绘出大肠杆菌的标准曲线，如图6所示。其Y和X的线性回归方程为Y00145X25648，相关系数为09633。图6大肠杆菌标准曲线33PBS缓冲溶液的PH对电信号的影响用CNT、TPP、PAH修饰在玻碳电极表面，层层组装构建的的传感器置于不同PH的PBS缓冲溶液中扫描，其扫描结果如图7所示。图7PH对传感器电流响应图7显示了PBS缓冲溶液PH值对免疫传感器峰值电流的影响，在01MOL/L的PBS中，当溶液的P
49、H达到65时，免疫传感器峰值电流达到最大，因此可确立实验所用PBS缓冲溶液的PH为65，即生物传感器在检测中的最适PH条件为65。34PBS缓冲溶液的温度对电信号的影响用CNT、TPP、PAH修饰在玻碳电极表面，层层组装构建的的传感器置于不同温度的PBS缓冲溶液中扫描，其扫描结果如图8所示。图8温度对传感器电流响应图8显示了溶液温度对免疫传感器峰值电流的影响，在01MOL/L的PBS缓冲溶液中，当温度为20时，免疫传感器峰值电流达到最大，因此可确立实验所用PBS缓冲溶液的温度为20，即生物传感器在检测中的最适温度为20。35实际样品中大肠杆菌测定结果生物传感器测定大肠杆菌实验中，电化学工作站3次扫描结果如表2所示。表2生物传感器测定大肠杆菌扫描结果次数123平均峰值电流（105A）1593156916311598将1598代入线性回归方程为Y00145X25648中，得到X为667NG，因每NG抗原标准品中含有大肠杆菌375个，故2UL该大肠杆菌悬液中含有大肠杆菌个数为25012，即每毫升该大肠杆菌悬液的个数为1250625106。平板菌落计数法测定大肠杆菌个数结果表3所示。表3平板菌落计数法测定结果稀释度104105106平板123123
