1、本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境鲈鱼GK（GLUCOKINASE）基因CDNA克隆一、选题的背景与意义鲈鱼主要分布于我国东海、渤海沿海及通海淡水水体，是我国重要的养殖鱼类，在我国广泛的养殖。鲈鱼肉质鲜美，营养价值很高，具有较高的经济价值。目前鱼类对碳水化合物的消化和代谢能力较差，缺乏对血糖水平的调控能力。众多的研究资料表明，摄入高碳水化合物通常会导致鱼体出现持续的高血糖、肝肿大、肝糖原积累、生长率和饲料效率降低。影响鱼类利用饲料的因素很多，包括鱼的食性、生长发育、胰岛素水平、消化及代谢酶、能量代谢水平等内因及碳水化合物的种类、含量、摄食频率、环境温度等外因。葡萄糖激酶（GLUCOKI
2、NASE,GK）是糖酵解过程中很重要的限速酶，当哺乳动物血糖增高时，GK活性诱导性增强，从而增强糖酵解。早期的研究者认为鱼类可能缺乏GK，因而不能正常分解利用葡萄糖，导致鱼类摄食血糖后血糖持续偏高，但近年的研究在鱼类的肝脏中发现了GK，饲料碳水化合物能够诱导鱼类肝脏GK的活性升高，表明鱼类利用碳水化合物差的原因而不是缺乏GK鲤利用碳水化合物要好于金雕和虹鳟，且GK活性受碳水化合物的诱导比金雕和虹鳟更快。而对于鲈鱼，目前还没有对GK深入的研究。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容本研究通过鲈鱼各组织RNA的提取，再通过自己设计的引物和PCR技术来提取鲈鱼GK的部分核心片段，然后连接到载体
3、上并导入感受态细胞中送测序公司测序，之后于NCBI比对，以得到鲈鱼CPT2基因CDNA序列。主要问题鲈鱼总RNA的提取的问题，提取核心序列时引物设计的问题，由于引物的设计有一定的未知性，能否的到核心序列的关键就在此。三、研究的方法与技术路线1、鲈鱼各组织获得新杀死的鲈鱼中取出肌肉、肝脏、心脏、脑、皮肤、肠组织迅速放入80冰箱中待用。2、RNA的提取将组织从80冰箱中取出，放在冰上解冻，待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织于EP管中，剪碎组织，加入适量的TRIZOL试剂，剧烈震荡，冰上静置5分钟，再加入02ML氯仿，剧烈震荡后于412000R/MIN离心30S，取上层水相于一新的EP管
4、中，加入05ML异丙醇，混匀后20静置30MIN；8000R/MIN离心10MIN，弃上清，沉淀用现配的75乙醇洗涤后室温干燥，干燥后用30L的无酶水溶解，得RNA提取液。3、引物设计在NCBI上查找人、小鼠、大鼠、虹鳟鱼的GKCDNA序列，通过软件BIOEDIT和PRIMER50来设计引物。4、GKCDNA的获得在EP管中加入2L的鲈鱼RNA，上引下引各1L,5BUFFER4L，DNTP1L，OLIGODT1L,MMLV1L,然后加入蒸馏水至体系共20L混匀于42反应1小时，冰溶20保存。5、聚合酶链式反应（PCR）扩增取2L步骤4中得到的液体来进行PCR。PCR产物进行凝胶电泳，如电泳的结
5、果和预料的核苷酸长度相似，则切胶回收。否则重否以上步骤。6、切胶回收的产物介入质粒并导入感受态细胞中，送测序公司测序。7、得到的序列于NCBI上已的到的GK（最好是鱼类）做序列比对，看得到的序列是否是鲈鱼GK的部分序列。四、研究的总体安排与进度2010年12月实验前期准备1查询中英文资料、文献2设计实验方案3准备实验中所需的仪器和材料2011年1月进行试验1RNA提取2引物设计3CDNA的克隆4PCR扩增5送公司测序2011年4月撰写论文1实验数据整理、分析2完成论文初稿并交指导老师修改2011年5月准备答辩1完成论文正稿2准备毕业答辩五、主要参考文献1方亦斌,邹大进葡萄糖激酶调节蛋白的研究进
6、展J华夏医学,2003,164224232ALEGRE,M,CIUDAD,CJ,FILLAT,C,ETALDETERMINATIONOFGLUCOSE6PHOSPHATASEACTIVITYUSINGTHEGLUCOSEDEHYDROGENASECOUPLEDREACTIONANALBIOCHEM1988,173,1851893MCGARRYJD,BROWNNF,1997THEMITOCHONDRIALCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASESYSTEMFROMCONCEPTTOMOLECULARANALYSISBIOCHEMJ244,1144HSIAOYS,JOGLG,TO
7、NGL,2006CRYSTALSTRUCTUREOFRATCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIICPTIIBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUNJ346,974805WIESER,T,DESCHAUER,M,ZIERZ,S,1997CARNITINEPALMITOYLTRANSFERASE2DECIENCYTHREENOVELMUTATIONSANNNEUROL42,4146BERGOT,FEFFECTSOFDIETARYCARBOHYDRATESANDOFTHEIRMODEOFDISTRIBUTIONONGLYCAEMIAINRAINBOWTROUTSALMO
8、GAIRDNERICOMPBIOCHEMPHYSIOL199064A5435477BORREBAEK,B,CHRISTOPHERSEN,BHEPATICGLUCOSEPHOSPHORYLATINGACTIVITIESINPERCHPERCAUVIATILISAFTERDIFFERENTDIETARYTREATMENTSCOMPBIOCHEMPHYSIOL,2000,64A5435478SHIMENO,S,KHEYYALI,D,SHIKATA,TMETABOLICRESPONSETODIETARYCARBOHYDRATETOPROTEINRATIOSINCARPFISHERIESSCI1995,
9、612772819VANDEWERVE,G,LANGE,A,NEWGARD,CNEWLESSONSINTHEREGULATIONOFGLUCOSEMETABOLISMTAUGHTBYTHEGLUCOSE6PHOSPHATASESYSTEMEURJBIOCHEM2000,2671533154910唐永凯,俞菊华,戈贤平翘嘴红鱼白肝脏G6PAS催化亚基的克隆以及摄食和饲料中碳水化合物对其表达的影响水产学报2007,31455311罗毅平,谢小军鱼类利用碳水化合物的研究进展中国水产科学2010,1738139012DESCHAUERM,WIESERT,ZIERZ,ETS,ETAL,2002ANOVE
10、LNONSENSEMUTATION515DEL4INMUSCLECARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIIDECIENCYMOLGENETMETABJ75,18118513SPANSERAT,ECAPILLA,JGUTIERREZ,ETALGLUCOKINASEISHIGHLYINDUCEDANDGLUCOSE6PHOSPHATASEPOORLYREPRESSEDINLIVEROFRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSBYASINGLEMEALWITHGLUCOSEJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGYPARTB,2
11、001,12827528314WILSON,JEHEXOKINASESREVPHYSIOLBIOCHEMPHARMACOL1995,1266519815SMEETSRJ,SMEITINKJA,SEMMEKROTBA,ETAL,2003ANOVELSPLICESITEMUTATIONINNEONATALCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIIDECIENCYHUMGENETJ48,81316WILSON,RPUTILISATIONOFDIETARYCARBOHYDRATEBYSHAQUACULTURE124,678017SARGENT,JR,TACON,AGCDEVELOP
12、MENTOFFARMEDSHANUTRITIONALLYNECESSARYALTERNATIVETOMEATPROCNUTRSOC1999,58,37738318PRINTZ,RL,MAGNUSON,MA,GRANNER,DKMAMMALIANGLUCOKINASEANNUREVNUTR1993,1346349619KEITHFWOELTJE,VICTORIAESSER,BRIANCWEIS,ANJANSENETALCLONING,SEQUENCING,ANDEXPRESSIONOFACDNAENCODINGRATLIVERMITOCHONDRIALCARNITINEPALMITOYLTRAN
13、SFERASEIIJBIOLOGICALCHEMISTRY,2651990107201072520EATONS,2002CONTROLOFMITOCHONDRIALOXIDATIONFLUXJLIPIDRESEACH4119723921MCGARRYJD,WOELTJEKF,KUWAJIMAMETALREGULATIONOFKETOGENESISANDTHERENAISSANCEOFCARNITINEPALMITORYJDIABETES/METABOLISMREVIEW,1989,527128422SERGIOP,MERCEDESRIMMUNOHISTOCHEMICALLOCALIZATION
14、OFGLUCOKINASEINRAINBOWTROUTBRAINCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGY,PARTA,2009,15335235823BORGARB,BERITCHEPATICGLUCOSEPHOSPHORYLATINGACTIVITIESINPERCHPERCAFLUVIATILISAFTERDIFFERENTDIETARYTREATMENTSCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGY,PARTB2000,12538739324IYNEDJIAN,PBMAMMALIANGLUCOKINASEANDITSGENEBI
15、OCHEM1993,293,11325PRINTZ,RL,MAGNUSON,MA,GRANNER,DKMAMMALIANGLUCOKINASEANNREVNUTR1993,13,46349626NAGAYAMA,F,OHSIMA,H,SUZUKI,HAHEXOKINASEFROMSHLIVERWITHWIDESPECICITYFORNUCLEOTIDESASPHOSPHORYLDONORBIOCHEMBIOPHYS1990ACTA615,859327MOMMSEN,TP,PLISETSKAYA,EMINSULININSHESANDAGNATHANSHISTORY,STRUCTURE,ANDME
16、TABOLICREGULATIONREVAQUATICSCI1991,4,225259毕业论文文献综述海洋生物资源与环境鱼类对葡萄糖利用情况的研究状况摘要葡萄糖激酶GLUCOKINASE,GK是己糖激酶家族成员,在人体糖代谢中起着重要的作用。研究还发现GK基因的突变与青年发病型糖尿病的发病密切相关。GK在体内的活性受多种因素的影响。葡萄糖6磷酸酶是一种膜结合酶，主要存在于肝和肾细胞中的内质网膜及核膜上，催化葡萄糖6磷酸分解为葡萄糖和磷酸，是糖异生和糖原分解两个代谢途径中的关键酶之一，调节着生物体内的血糖水平。葡萄糖激酶的底物是葡萄糖，它可以催化葡萄糖转化为葡萄糖6磷酸，进而进一步的氧化分解，产
17、生能量。而葡萄糖6磷酸酶的底物是葡萄糖6磷酸，它的作用却是将葡萄糖6磷酸催化成葡萄糖，进而进一步的生成肝糖原，是糖异生的关键调控酶。这两个酶相辅相成，共同维持着生物体内血糖的稳定。关键词GK葡萄糖激酶调节蛋白鲈鱼鱼类对碳水化合物的消化和代谢能力较差，缺乏对血糖水平的调控能力。众多的研究资料表明，摄入高碳水化合物通常会导致鱼体出现持续的高血糖、肝肿大、肝糖原累积、生长率和饲料效率降低。影响鱼类利用饲料碳水化合物的因素很多，包括鱼的食性、生长发育、胰岛素水平、消化及代谢酶、能量代谢水平等内因以及碳水化合物的种类、含量、摄食频率、环境温度等外因。葡萄糖激酶（GK）是糖酵解过程中重要的限速酶，当哺乳动
18、物血糖增高时，GK活性诱导性增强，从而增强糖酵解。早期的研究者认为，鱼类可能缺乏GK，因而不能正常分解利用葡萄糖，导致鱼类摄食糖后血糖持续偏高，但近年的研究在鱼类（包括肉食性鱼类）的肝脏中发现了GK，饲料碳水化合物能够诱导鱼类肝脏GK的活性升高，表明鱼类利用碳水化合物差的原因不是缺乏GK。鲤利用碳水化合物要好于金鲷和虹鳟，且其GK活性受碳水化合物的诱导比金鲷和虹鳟更快。1GK酶简介葡萄糖激酶GLUCOKINASE,GK是己糖激酶家族成员,在人体糖代谢中起着重要的作用。研究还发现GK基因的突变与青年发病型糖尿病的发病密切相关。GK在体内的活性受多种因素的影响。包括底物及产物对其的反馈作用,胰岛素
19、对其基因表达的调控。此外,GK还受一种68KDA的蛋白质,即葡萄糖激酶调节蛋白GLUCOKINASEREGULATORYPROTEIN,GKRP的调节作用。在鱼体内葡萄糖激酶GLUCOKINASE，GK是糖酵解过程中葡萄糖分解产生能量、调节血糖的关键酶。早期研究表明，鱼类缺乏GK或GK活性很低，这是鱼体对葡萄糖利用效率低的原因之一。后来的研究证实，在大西洋比目鱼HIPPOGLOSSUSHIPPOGLOSSUS、大西洋鲑SALMOSALAR、金头鲷SPARUSAURATA、虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS和鲤CYPRINUSCARPIO存在GK的CDNA，且饵料中高葡萄糖与鱼体的摄食能影
20、响GK活性与其MRNA水平。2葡萄糖6磷酸酶（GLUCOSE6PHOSPHATASE，G6PASE）简介葡萄糖6磷酸酶是一种膜结合酶，主要存在于肾和肝细胞中的内质网膜及核膜上，催化葡萄糖6磷酸分解为磷酸和葡萄糖，是糖异生和糖原分解两个代谢途径中的关键酶之一，调节着生物体内的血糖水平。G6PASE酶系包括催化亚基P36蛋白和转运酶P46蛋白，P36、P46基因的突变均会导致葡萄糖储存疾病。3GK和G6PASE对鱼类肝脏葡萄糖代谢的调节葡萄糖激酶的底物是葡萄糖，它可以催化葡萄糖转化为葡萄糖6磷酸，进而进一步的氧化分解，产生能量。而葡萄糖6磷酸酶的底物是葡萄糖6磷酸，它的作用却是将葡萄糖6磷酸催化成
21、葡萄糖，进而进一步的生成肝糖原，是糖异生的关键调控酶。这两个酶相辅相成，共同维持着生物体内血糖的稳定。在哺乳动物中，在进食过葡萄糖后，血糖会出现升高的现象，此时GK酶的基因会受到葡萄糖的诱导而大量转录、翻译出GK酶，将过量的葡萄糖分解以维持生物体血糖平横。此时血糖过高会抑制G6PASE酶基因的表达，肝脏中G6PASE含量会降低，防止更多的蛋白质和脂肪通过糖异生作用转化成糖。有研究表明，在鱼体中，食物中的葡萄糖含量过高会引起GK酶含量升高，以分解葡萄糖，降低血糖浓度。但是葡萄糖对G6PASE似乎没有明显的抑制作用，其机制还不清楚，需要进一步的研究来发现。推测是鱼天然食物中葡萄糖的含量很低，鱼要不
22、断的进行糖异生以满足自身功能所需的葡萄糖。4其他的调节因素影响动物体糖代谢的激素包括胰岛素、高血糖素、甲状腺激素、高血糖样肽、胰岛素样生长因子、生长素、生长激素抑制素、皮质醇和儿茶酚胺等。在哺乳动物的糖代谢中，胰岛素促进糖酵解、糖原合成及脂肪合成，并且抑制糖异生，从而降低血糖水平。早期的假说认为，鱼类（尤其是肉食性鱼类）胰岛素水平低、缺乏调节作用，类似哺乳动物的胰岛素依赖型糖尿病症状，胰岛素受体数量少、亲和力弱，但近年来的研究发现，鱼类的胰岛素水平接近甚至高于哺乳类，摄入碳水化合物后胰岛素水平及其受体数量能适应性上调，这些研究均不支持关于鱼类缺乏胰岛素和胰岛素受体的假说。不过鱼类的胰岛素对血糖
23、的反应通常比哺乳动物慢，这可能导致胰岛素调节能力在摄食碳水化合物后一段时间内相对不足。还有的研究表明，葡萄糖诱导胰腺分泌胰岛素的能力远远低于氨基酸和脂肪酸，鱼类胰岛素的主要作用是调控蛋白质代谢而不是糖代谢。因此，胰岛素在鱼体的糖代谢调控中所起的作用有待进一步探讨目前，关于除胰岛素外的其他激素调控鱼类糖代谢的研究资料比较缺乏。胰高血糖素水平降低可增加糖原合成，抑制糖异生，从而降低血糖水平，对一些鱼血糖水平的调控作用比胰岛素更为明显。甲状腺激素加速分解肝糖，同时降低血糖水平，雌激素可降低肝糖原含量为卵黄蛋白合成供能。5展望由于鱼是天生的“高血糖”，这对我们养殖鱼类是一个挑战，对鱼类体内蛋白平衡的研
24、究对其养殖发展会有很好的前景，而GK和G6PASE又是葡萄糖平衡的两个关键的调控酶。因此，对这两个酶的进一步研究有一定的价值，对我们鱼类养殖业的发展有重要的意义。参考文献28方亦斌,邹大进葡萄糖激酶调节蛋白的研究进展J华夏医学,2003,1642242329ALEGRE,M,CIUDAD,CJ,FILLAT,C,ETALDETERMINATIONOFGLUCOSE6PHOSPHATASEACTIVITYUSINGTHEGLUCOSEDEHYDROGENASECOUPLEDREACTIONANALBIOCHEM1988,173,18518930MCGARRYJD,BROWNNF,1997THEM
25、ITOCHONDRIALCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASESYSTEMFROMCONCEPTTOMOLECULARANALYSISBIOCHEMJ244,11431HSIAOYS,JOGLG,TONGL,2006CRYSTALSTRUCTUREOFRATCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIICPTIIBIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUNJ346,9748032WIESER,T,DESCHAUER,M,ZIERZ,S,1997CARNITINEPALMITOYLTRANSFERASE2DECIENCYTHREENOVELMUTATIONS
26、ANNNEUROL42,41433BERGOT,FEFFECTSOFDIETARYCARBOHYDRATESANDOFTHEIRMODEOFDISTRIBUTIONONGLYCAEMIAINRAINBOWTROUTSALMOGAIRDNERICOMPBIOCHEMPHYSIOL199064A54354734BORREBAEK,B,CHRISTOPHERSEN,BHEPATICGLUCOSEPHOSPHORYLATINGACTIVITIESINPERCHPERCAUVIATILISAFTERDIFFERENTDIETARYTREATMENTSCOMPBIOCHEMPHYSIOL,2000,64A
27、54354735SHIMENO,S,KHEYYALI,D,SHIKATA,TMETABOLICRESPONSETODIETARYCARBOHYDRATETOPROTEINRATIOSINCARPFISHERIESSCI1995,6127728136VANDEWERVE,G,LANGE,A,NEWGARD,CNEWLESSONSINTHEREGULATIONOFGLUCOSEMETABOLISMTAUGHTBYTHEGLUCOSE6PHOSPHATASESYSTEMEURJBIOCHEM2000,2671533154937唐永凯,俞菊华,戈贤平翘嘴红鱼白肝脏G6PAS催化亚基的克隆以及摄食和饲料
28、中碳水化合物对其表达的影响水产学报2007,31455338罗毅平,谢小军鱼类利用碳水化合物的研究进展中国水产科学2010,1738139039DESCHAUERM,WIESERT,ZIERZ,ETS,ETAL,2002ANOVELNONSENSEMUTATION515DEL4INMUSCLECARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIIDECIENCYMOLGENETMETABJ75,18118540SPANSERAT,ECAPILLA,JGUTIERREZ,ETALGLUCOKINASEISHIGHLYINDUCEDANDGLUCOSE6PHOSPHATASEPOORLYR
29、EPRESSEDINLIVEROFRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSBYASINGLEMEALWITHGLUCOSEJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGYPARTB,2001,12827528341WILSON,JEHEXOKINASESREVPHYSIOLBIOCHEMPHARMACOL1995,1266519842SMEETSRJ,SMEITINKJA,SEMMEKROTBA,ETAL,2003ANOVELSPLICESITEMUTATIONINNEONATALCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIIDEC
30、IENCYHUMGENETJ48,81343WILSON,RPUTILISATIONOFDIETARYCARBOHYDRATEBYSHAQUACULTURE124,678044SARGENT,JR,TACON,AGCDEVELOPMENTOFFARMEDSHANUTRITIONALLYNECESSARYALTERNATIVETOMEATPROCNUTRSOC1999,58,37738345PRINTZ,RL,MAGNUSON,MA,GRANNER,DKMAMMALIANGLUCOKINASEANNUREVNUTR1993,1346349646KEITHFWOELTJE,VICTORIAESSE
31、R,BRIANCWEIS,ANJANSENETALCLONING,SEQUENCING,ANDEXPRESSIONOFACDNAENCODINGRATLIVERMITOCHONDRIALCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEIIJBIOLOGICALCHEMISTRY,2651990107201072547EATONS,2002CONTROLOFMITOCHONDRIALOXIDATIONFLUXJLIPIDRESEACH4119723948MCGARRYJD,WOELTJEKF,KUWAJIMAMETALREGULATIONOFKETOGENESISANDTHERENAI
32、SSANCEOFCARNITINEPALMITORYJDIABETES/METABOLISMREVIEW,1989,527128449SERGIOP,MERCEDESRIMMUNOHISTOCHEMICALLOCALIZATIONOFGLUCOKINASEINRAINBOWTROUTBRAINCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGY,PARTA,2009,15335235850BORGARB,BERITCHEPATICGLUCOSEPHOSPHORYLATINGACTIVITIESINPERCHPERCAFLUVIATILISAFTERDIFFERENTDIET
33、ARYTREATMENTSCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGY,PARTB2000,12538739351IYNEDJIAN,PBMAMMALIANGLUCOKINASEANDITSGENEBIOCHEM1993,293,11352PRINTZ,RL,MAGNUSON,MA,GRANNER,DKMAMMALIANGLUCOKINASEANNREVNUTR1993,13,46349653NAGAYAMA,F,OHSIMA,H,SUZUKI,HAHEXOKINASEFROMSHLIVERWITHWIDESPECICITYFORNUCLEOTIDESASPHOSP
34、HORYLDONORBIOCHEMBIOPHYS1990ACTA615,859354MOMMSEN,TP,PLISETSKAYA,EMINSULININSHESANDAGNATHANSHISTORY,STRUCTURE,ANDMETABOLICREGULATIONREVAQUATICSCI1991,4,225259本科毕业设计（20_届）鲈鱼GK（GLUCOKINASE）基因CDNA克隆目录1引言1311鱼类对葡萄糖的利用情况1312葡萄糖激酶（GLUCOKINASE，GK）1313影响鱼类碳水化合物吸收利用的其他因素1414研究现状及实验目的142鲈鱼GK基因CDNA克隆1421实验材料和仪
35、器14211实验材料14212实验中所用试剂盒14213其他主要试剂15214主要仪器1522实验方法15221RNA的提取15222肝脏常规CDNA的合成16223鲈鱼GK核心片段的获取162231兼并引物的设计162232鲈鱼GK核心片段的PCR扩增17224PCR产物的纯化17225重组质粒的构建和检测172251PCR纯化产物与PMD18T载体的连接172252感受态细胞的制备182253重组质粒的转化182254重组质粒的抽提192255重组质粒的PCR检测1923实验结果和分析20231鲈鱼GK基因的序列分析20232RTPCR琼脂糖凝胶电泳20233GK核心序列及同源性检测202
36、331氨基酸序列分析242332同源性比较和系统发育分析243小结2631实验目的2632实验结果分析2633展望26致谢26参考文献26摘要在哺乳动物中，高KM值的己糖激酶，即葡萄糖激酶主要是在肝脏和胰腺B细胞中表达的。它的功能是提高生物细胞对过剩的碳水化合物中的葡萄糖的利用效率。当食物中的碳水化合物含量升高时，GK基因受到诱导，大量表达，细胞内的葡萄糖激酶含量迅速升高，调节体内血浆平衡。一些研究发现鱼类肝脏也有类似于人体葡萄糖激酶的酶，它也会受饵料中的高含量葡萄糖诱导，以维持血液平衡。而在胰腺中，此酶的表达受到胰岛素的调控。本实验通过RTPCR的方法克隆了鲈鱼（LATEOLABRAXJAP
37、ONICUS）的部分GK基因。这段序列长511BP，通过分析发现它和金头鲷（SPARUSAURATA），和虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）的GK基因有很高的同源性，其中和金头鲷（SPARUSAURATA）GK基因相似度为94，而和虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）GK基因的相似度为86。通过RTPCR发现，GK基因MRNA主要在肝脏中表达和胰腺中表达，而且在肝脏中的表达量要高于在胰腺中的表达量关键词鲈鱼；GK；葡萄糖激酶ABSTRACTINMAMMALS,THEHIGHKMHEXOKINASE,ALSOCALLEDGLUCOKINASE,ISEXPRESSEDINLIVE
38、RANDPANCREATICBCELLSITSFUNCTIONINTHELIVERISTOINCREASETHEINTRACELLULARUTILIZATIONOFGLUCOSEINACARBOHYDRATESURPLUSSITUATIONTHISENZYMEISADAPTIVE,ITSINTRACELLULARCONCENTRATIONINCREASESWITHINCREASINGCONTENTOFCARBOHYDRATEINTHEDIETSOMESTUDIESFOUNDTHATAGLUCOKINASELIKEENZYMEISPRESENT,ANDADAPTIVE,ALSOINLIVEROF
39、FISNINPANCREATICBCELLS,GLUCOKINASEISINVOLVEDINTHESTIMULATORYACTIONOFHIGHBLOODGLUCOSEONTHESECRETIONOFINSULINAPARTIALCDNAOFGKINLATEOLABRAXJAPONICUSWASAMPLIFIEDBYRTPCRMETHODTHECDNAWAS511BPINSIZETHESEQUENCEANALYSISINDICATEDTHATITSHAREDHIGHIDENTITYWITHSPARUSAURATAANDONCORHYNCHUSMYKISSWHICHIS94WITHSPARUSA
40、URATAAND86WITHONCORHYNCHUSMYKISSTHERTPCRANALYSISREVEALEDTHATGKMRNAWASMAINLYEXPRESSEDINLIVER,ANDPANCREASFURTHERMORE,THEEXPRESSIONLEVELOFGKWASHIGHERINLIVERTHANINPANCREASKEYWORDSLATEOLABRAXJAPONICUSGKGLUCOKINASE1引言11鱼类对葡萄糖的利用情况葡萄糖是鱼类的脑、鳃组织和红细胞等必需的代谢供能底物之一，与鱼体维持正常的生理功能和存活能力密切相关1。但鱼类主要的能量来源是蛋白质和脂肪，鱼类对葡萄糖
41、的利用能力较差，适宜的饲料葡萄糖水平一般低于202，饲料中葡萄糖含量过高会抑制鱼体生长，导致免疫功能降低3，血糖水平持续偏高4。因此，鱼类曾被认为是天生的糖尿病患者。为阐明鱼类对碳水化合物利用率低的原因，众多的研究者从鱼类的食性、消化率、内分泌系统、饲料碳水化合物种类、含量、加工工艺和糖代谢酶系等角度进行了大量研究。鱼体对葡萄糖的代谢方式包括转化储存和氧化分解两种。饲料中的葡萄糖经消化吸收后主要以血糖的形式转运到鱼体各组织器官，在天然状态下，直接通过尿或鳃排出体外的血糖仅占极少部分（通常低于15）。肝脏是鱼类葡萄糖代谢的主要场所。葡萄糖由葡萄糖转运子转运进入肝细胞，在糖代谢酶系的调控下进行糖原
42、合成和分解、糖酵解和异生及磷酸戊糖途径等代谢。葡萄糖在己糖激酶的催化下转化为葡萄糖6磷酸（G6P）。G6P可经磷酸戊糖途径为脂肪酸的合成提供NADPH，或用于糖原合成，也可进一步无氧酵解成为丙酮酸，之后可经乙酰辅酶A进入三羧酸循环完全氧化供能，但鱼类以糖为底物氧化供能占总代谢耗能的比例较小6。鱼体各种组织对葡萄糖的利用能力差异很大，研究发现，代谢活性高的组织对糖的利用能力较强。鱼类的心脏具有较强的葡萄糖转运和储存能力，而脑组织以葡萄糖为主要代谢能源，对糖的利用能力也很强。研究表明，尼罗罗非鱼（OREOCHROMISNILOTICA）的脑、心的葡萄糖转运子I（GLUT1）和糖原水平甚至比一些哺乳
43、动物高10倍以上7。鱼类对葡萄糖的消化和代谢能力较差，缺乏调控血糖水平的能力。众多的研究资料表明，影响鱼类利用饲料葡萄糖的因素很多，包括鱼的生长发育、食性、消化及代谢酶、胰岛素水平、能量代谢水平等内因以及碳水化合物的含量、种类、环境温度等外因、摄食频率8。葡萄糖激酶（GLUCOKINASEGK）是糖酵解过程中重要的限速酶，当哺乳动物血糖增高时，GK活性诱导性增强，从而增强糖酵解。早期的研究者认为，鱼体内可能缺乏GK，因而不能正常分解利用葡萄糖，导致鱼类摄食糖后血糖持续偏高，但近年的研究在鱼类（包括肉食性鱼类）的肝脏中发现了GK，饲料中的葡萄糖能够诱导鱼类肝脏GK的活性升高，表明鱼类利用葡萄糖差
44、的原因不是缺乏GK。鲤CYPRINUSCARPIO利用碳水化合物要好于金鲷SPARUSAURATA和虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS，且其GK活性受碳水化合物的诱导比金鲷和虹鳟更快9。12葡萄糖激酶（GLUCOKINASE，GK）葡萄糖激酶GLUCOKINASE,GK是己糖激酶家族成员,在糖代谢中起着重要的作用。己糖激酶HEXOKINASE，HK是糖代谢的关键酶，催化葡萄糖磷酸化生成6磷酸葡萄糖GLUCOSE6PHOPHATE，G6P10。哺乳动物己糖激酶有4种同工酶，其中型，其KM值为20130MOL/L，他们主要存在于肝外组织，受到6磷酸葡萄糖反馈抑制。型主要存在于肝脏和胰岛细胞，
45、又被称之为葡萄糖激酶GLUCOKINASE，GK，其KM值为58MMOL/L，6磷酸葡萄糖对此酶无抑制作用，当血糖浓度升高时启动此酶，于是多余的葡萄糖最终被转化为糖原或脂肪贮存，胰岛素在转录水平上调控GK基因的表达，在鱼类，特别是肉食性鱼类，由于它们对饵料中消化葡萄糖用于能量供应的能力非常有限，这些鱼类摄食富含葡萄糖的饵料后会出现高血糖症，饵料葡萄糖含量过高还有可能诱发养殖鱼类脂肪肝病,因此,人们开始关注鱼类GK基因,并已经进行了一些研究，克隆了虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS、金鲷SPARUSAURATA、翘嘴红鮊ERYTHROCULTERILISHAEFORMIS等鱼类的GK基因全
46、长CDNA序列11，为进一步研究鱼类糖代谢途径奠定了基础。13影响鱼类碳水化合物吸收利用的其他因素在哺乳动物中,在进食之后血糖升高,血液中高含量的葡萄糖会诱导肝脏中的GK基因表达,以迅速的将葡萄糖转化为葡萄糖6磷酸,进而进行糖原的合成或经磷酸戊糖途径为脂肪酸的合成提供NADPH12，也可进一步无氧酵解成为丙酮酸13。高的血糖含量还会抑制葡萄糖6磷酸激酶基因的表达，从而阻断糖异生的途径，防止其它大分子转变为葡萄糖。但是，在鱼类中，血液中的葡萄糖含量升高对葡萄糖6磷酸酶的影响似乎并不明显14。影响鱼类糖代谢的激素包括高血糖素、胰岛素、高血糖样肽、甲状腺激素、生长素、胰岛素样生长因子、生长激素抑制素
47、、儿茶酚胺和皮质醇等15。在哺乳动物的糖代谢中，胰岛素促进糖原合成及脂肪合成、糖酵解，并且抑制糖异生，从而降低血糖水平。早期的假说推测，鱼类（特别是肉食性鱼类）胰岛素水平低、缺乏调节作用，类似哺乳动物的胰岛素依赖型糖尿病症状（INSULINDEPENDENTDIABETES，IDDM16），胰岛素受体数量少、亲和力弱，但近年来的研究发现，鱼类的胰岛素水平接近甚至高于哺乳类,有胰岛素受体，摄入葡萄糖后胰岛素水平及其受体数量能适应性上调17，这些研究结果均不支持关于鱼类缺乏胰岛素和胰岛素受体的假说。不过鱼类的胰岛素对血糖的反应通常比哺乳动物慢，这可能导致胰岛素调节能力在摄食葡萄糖后一段时间内相对不
48、足18。还有的研究表明，葡萄糖对胰腺分泌胰岛素的诱导能力远远低于脂肪酸和氨基酸，推测鱼类胰岛素的主要作用是调控蛋白质代谢而不是糖代谢19。因此，胰岛素在鱼体的糖代谢调控中所起的作用有待进一步探讨。14研究现状及实验目的对于鱼类对碳水化合物的吸收和利用途径目前已经初步清楚，但是一些细节的地方还是比较模糊，例如之前提到的血糖升高对葡萄糖6磷酸激酶的影响尚不清楚20。而且，前人的研究致力于分析鱼类整体的情况，具体到特别的某种鱼时，虽有指导意义，但也要具体情况具体分析。本实验的目的在于对鲈鱼GK基因CDNA的克隆21，为以后对鲈鱼体内碳水化合物代谢途径更深入的研究打下基础，以期能使鲈鱼养殖在一定程度上
49、有所突破。2鲈鱼GK基因CDNA克隆21实验材料和仪器211实验材料（1）实验鲈鱼购买于宁波水产品大世界，经麻醉后迅速取出肝组织，放入液氮冷冻后备用。（2）本实验室保存的大肠杆菌ESCHENICHIACOLIDH5。212实验中所用试剂盒（1）PRIMESCRIPTTM1STSTRANDCDNASYNTHESISKITTAKARA公司。（2）DNA凝胶回收试剂盒（碧云天生物有限公司）。（3）PMD18T试剂盒（TAKARA公司）。（4）质粒抽提试剂盒（碧云天生物有限公司）。213其他主要试剂（1）TRIZOLREAGENTINVITROGEN公司（2）氯仿（常熟市杨园化工厂）。（3）异丙醇（上海试剂四厂）。（4）DEPC处理灭菌水（上海生工）。（5）琼脂糖（上海生工）。（6）甘油（上海生工）。（7）氨苄青霉素（上海生工）。（8）LB培养基在950ML蒸馏水中加入酵母提取物（OXOID公司）5G，胰蛋白胨（OXOID公司）10G，NACL5G。调整PH值至70后定容至1000ML。如需要固体培养基则每1000ML液体培养基中加入琼脂15G，高压灭菌后备用。（9）01MOL/LCACL2称取分子量为147G的CACL22H2O（上海生工生物工程技术服务有限公司）147G加蒸
