1、本科毕业设计（20_届）两株弧菌的分子鉴定所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录摘要（ABSTRACT）1引言111弧菌分类学现状与分类学历史1111弧菌分类学现状1112弧菌分类学历史11216SRRNA简介与应用113研究的意义与内容22材料与方法221实验材料、仪器和试剂2211材料2212仪器与设备2213试剂322方法与步骤3221实验材料准备及形态学观察3222改良弧菌DNA提取方法3223DNA测定4224PCR扩增与测序4225生物信息学分析53结果与分析531两株弧菌的分离及形态学观察532两株弧菌的DNA提取及其测定63316SRRNA基因的PC
2、R扩增与测序73416SRRNA基因序列分析835系统发育分析84讨论941形态学观察942改良弧菌DNA提取方法1043弧菌分子鉴定结果105结论10参考文献12附录132附录一XHS29号菌株的16SRRNA基因测序结果13附录二461号菌株的16SRRNA基因测序结果133摘要本文选用的环境样品为朱家尖浅水区水样，利用TCBS培养基培养梯度稀释平板法分离纯化出相应的两株未知优势弧菌。本文建立了一种基于CTABNACL法的改良弧菌DNA提取的方法，该法通过高盐和CTAB对黏性多糖的沉淀而除去多糖，从而从富含黏性多糖的弧菌中提取获得了高质量的DNA。以16SRRNA基因作为分子标记对环境样品
3、中分离的两株未知弧菌样品进行系统发育学分析从而对其分类学地位进行鉴定，鉴定结果为461号菌株为弧菌属（VIBRIO）的溶藻弧菌VALGINOLYTICUS，而XHS29号菌株为弧菌属（VIBRIO）的哈维氏弧菌VHARVEYI。关键词弧菌；16SRRNA；分子鉴定；系统发育学分析ABSTRACTTHISESSAYSELECTEDFORENVIRONMENTALSAMPLESFROMZHUJIAJIANPHYTALZONEANDUTILIZEDTHETCBSCULTUREMEDIUMTOCULTURE,SEPARATEANDPURIFYTHECORRESPONDINGDOMINATEVIBRIO
4、SBYTHEMETHODOFSERIALDILUTIONOFWATERSAMPLESAFTERTHEACQUISITIONOFTHECORRESPONDINGTWOSTRAINSOFVIBIROS,WEESTABLISHEDAIMPROVEDDNAEXTRACTIONMETHODBASEDONTHECTABNACLOFTHEVIBRIOSANDTHISMETHODUTILIZEDTHEHIGHSALTANDCTABTOREMOVETHEPOLYSACCHARIDEBYPRECIPITATINGTHEVISCOUSPOLYSACCHARIDE，INTHISMETHODWEACQUIREDHIGH
5、QUALITYDNAFROMTHEPOLYSACCHARIDERICHVIBRIOSWEMADEPHYLOGENETICANALYSESABOUTTHETWOSTRAINSOFSEPARATEDUNKNOWNVIBRIOSFROMENVIRONMENTALWATERSAMPLESANDIDENTIFIEDTHEIRTAXONOMICALSTATUSBYTHEMEANSOF16SRRNAGENEASAMOLECULARMARKERTHEIDENTIFICATIONRESULTSHOWEDTHATTHE461STRAINISTHEVALGINOLYTICUSOFTHEVIBRIOANDTHEXHS
6、29STRAINISTHEVHARVEYIOFTHEVIBRIO。KEYWORDSVIBRIOS；16SRRNA；MOLECULARIDENTIFICATION；PHYLOGENETICANALYSES1引言11弧菌分类学现状与分类学历史111弧菌简介及分类学现状弧菌分布广泛，与人类生活密切相关1。传统形态分类学主要在菌落的形态特征和生理生化特征如菌体的显微结构形状，弧度大小，鞭毛数量与分布，荚膜有无与荚膜的形态特征以及弧菌运动性等方面和如革兰氏染色，发酵葡萄糖反应，氧化酶反应等相应的生理生化特征来对弧菌进行分类。多年来，许多学者致力于弧菌分类学的研究，伯杰氏系统细菌学手册1984，九版3自问
7、世以来，有许多过去未能认定的致病性弧菌有所证实及归属，这在弧菌分类史上是一个非常重要的里程牌。在众多的弧菌之中，不同种的致病性差异很大，而随着当今发现的弧菌种类日益增加，弧菌分类学在致病性差异上的研究日趋重要。如O1型霍乱弧菌被WHO定为国际检疫菌，但许多与O1相似菌株却并不具备致病性2。但是目前弧菌分类学系统仍有诸多不足，而且随着日益增加的弧菌种类和近似菌种的细致区分以及由于菌种之间致病因子的横向基因转移等导致传统的分类鉴定的局限性日益明显。112弧菌分类学历史17世纪80年代，列文虎克首次用自制显微镜观察到微生物这标志着微生物形态学发展阶段的起始2点。但直至19世纪60年代初，关于弧菌分类
8、学所进行的观察和记载，仍只停留在形态学基础分类上4。19世纪60年代初，巴斯德（LOUISPASTEUR）、柯赫（ROBERTKOCH）等一大批杰出科学家建立了一套独特的微生物研究方法，成为微生物生理生化分类学的标志5。在这个时期，霍乱和狂犬病等传染病的致病病因等重大发现，以及固体培养基的改进，划线法的纯种分离，建立了细菌细胞的染色技术，显微摄影技术和悬滴培养法，为弧菌的生理学分类提供了重要的生物技术基础。这时的弧菌分类学主要以弧菌的生理生化特征为基础而进行分类学相关研究。20世纪50年代初，随着分子生物学的兴起以及日益增加的高新技术出现，对弧菌的研究进入到分子生物学的水平。1977年，CWE
9、OSE等经过分析原核生物16SRRNA基因序列和真核生物18SRRNA基因序列后，提出了可将自然界生物分为细菌、古菌和真核生物三域，揭示了各生物之间的系统发育关系6,7，这标志着弧菌分类进入到分子水平阶段。1216SRRNA简介与应用16SRRNA基因有11个恒定区CONSTANTREGION和10个可变区VARIABLEREGION，恒定区相对保守，而可变区因细菌而异，其变异程度与细菌的系统发育密切相关8。16SRRNA基因由大约1550个核苷酸组成，其长度既能够表现足够的种间多态性，又便于序列分析。大量研究试验证明，总体来说，16SRRNA基因比较适合用于揭示各种生物物种间的种属亲缘程度。
10、历时久远的演化历程中，16SRRNA基因进化速率非常缓慢，因此16SRRNA基因适合用于作为生物进化距离及其种属亲缘程度的分子标记。目前想获得16SRRNA基因的精确突变速率仍还有很多问题尚待解决，相异的种群进化速率不同，相同的种群进化速率也不一定相同，且其基因中含有高速率突变的热点区以及高度保守区9。但鉴于16SRRNA基因的功能同源性高且古老，分子大小便于研究，其演化速率和进化距离相对应，既含保守又有可变序列等，因此已是细菌分类学中最常用、最有用的分子鉴定基因。通过分析16SRRNA基因序列，可以判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近，如DNA杂交同源性在60一70以上，或细菌间16SRRNA
11、序列同源性达97以上的菌株就可定为一个种，如同源性只有95，则判定为属于不同属10。16SRRNA基因序列分析检测的优势是速度快，高通量，高精确性等，常规的细菌鉴定系统和生理生化特征等无法望其项背11。另外，一部分难以根据表型来鉴定的弧菌，可用16SRRNA基因序列分析能判定其准确的分类学地位。13研究的意义与内容虽然有些弧菌致病力之间差异较大，但基础形态学检测和生理生化指标较难区分这些弧菌，这给临床上的应用和水产品养殖病害的预防和诊治带来了诸多不便。通过应用16SRRNA基因可以快速鉴定在表型上难以区分的弧菌。哈氏弧菌与创伤弧菌之间，以及双氮弧菌与鳗弧菌等通过表型难以区分，通过16SRRNA
12、基因来对弧菌进行鉴定和区别已经有学者对此作出研究1214。本研究主要通过弧菌群落特征对所分离纯化得到的弧菌进行初步鉴定，然后通过弧菌总DNA的提取及16SRRNA基因的扩增获取，经测序后运用生物信息学的相关知识利用相关软件进行系统发育树的构建从而确定这两株未知弧菌的分类学地位。另本研究针对传统法提取弧菌总DNA的不足做出改进，拟得出最佳改良弧菌总DNA提取方法。本研究目标是获取最佳改良弧菌总DNA提取方法，以及通过16SRRNA基因获取及分析，对环境样品中所采取的两株未知菌进行分子鉴定从而确定这两株弧菌的种属等分类学地位。本研究基于弧菌16SRRNA基因特性，应用PCR技术研究环境样品中两株优
13、势弧菌的种属地位，旨在为大规模研究菌落生态演替和生长环境变化打下理论和工具基础，同时为水产品养殖病害的预防和诊治提供理论支持和技术支撑。32材料与方法21实验材料、仪器和试剂211材料本实验选用的环境样品为于2009年8月采集的朱家尖浅水区水样。通过利用TCBS培养基培养，梯度稀释平板法分离纯化出相应的两株菌。已分离的菌株斜面在4冰箱中保存，以备使用。实验前对相应菌株用LB液体培养基进行扩繁培养12H左右。212仪器与设备1BIORAD梯度PCR仪（PTC0100）江苏省科学器材有限公司2EPPENDORF微量移液器上海艾研生物科技有限公司3EPPENDORFCENTRIFUGE冷冻离心机（5
14、415R）上海肯强贸易有限公司4EPPENDORFCENTRIFUGE冷冻离心机（5415D）上海齐羿电子科技有限公司5电泳仪（BGPOWER600I）上海精宏实验设备有限公司6电子天平（AL104）梅特勒托利多仪器有限公司7台式高速冷冻离心机（TGL16M）长沙湘仪离心机仪器有限公司8REVCD13863V型超低温冰箱美国REVCD公司9GALANZ微波炉（PTO23TPKT）佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司10电热恒温水槽DK8D型上海精宏实验设备有限公司11紫外可见分析装置上海博迅实业有限公司医疗设备厂12RXZ智能型人工气候箱宁波江南仪器厂13手掌型离心机（LX100）宁波江南仪器
15、厂14XYJ875净化工作台（GB616885）苏州市伟业空调净化有限公司15微电脑智能化控制新型电热恒温鼓风干燥箱（DHG9123A）宁波江南仪器厂16各种规格TIPS、TUBES和培养皿等。213试剂1TAQDNA聚合酶5UNITSL1购自上海生工生物工程技术服务有限公司；2DNTPS其中DATP、DGTP、DCTP、DTTP均为10MMOLL1，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；310PCRBUFFER购自上海生工生物工程技术服务有限公司；4LB液体培养基蛋白胨10GL1，酵母提取物5GL1，NACL10GL1，PH70,高温高压灭菌后4保存；5TCBS培养基平板TCBS按照说明书上
16、参量调整PH70后加入相应的琼脂粉，高温高压灭菌后冷至60铺平板；6酚/氯仿/异戊醇（25241）体积比4避光短期保存；7氯仿/异戊醇（241）（体积比）4保存；8NAAC5MOL/L高温高压灭菌后4保存；910SDSSDS10，PH72，室温保存；1010TEBUFFER10MMOL/LTRISHCL，100MMOL/LEDTA，PH视需要而定，高温高压灭菌后4保4存；1150TAEBUFFER配制方法称量TRIS242G，NA2EDTA2H2O372G于1L烧杯中；向烧杯中加入约800ML去离子水，充分搅拌均匀；加入571ML的冰乙酸，充分溶解；加去离子水定容至1L后，室温保存。其他倍数T
17、AE按照对应倍数要求稀释即可。12CTAB/NACL溶液10CTAB，07MNACL在80ML双蒸水中溶解41GNACL，然后缓慢加入10GCTAB十六烷基三甲基溴化铵，同时加热并搅拌，可加热至65溶解，定容终体积至100ML；13RNASEA溶液将RNASEA溶于10MOL/LTRISHCLPH75，15MMOL/LNACL中，配成10MG/ML的溶液，于100加热15分钟，冷却后用15ML离心管分装成小份保存于20。22方法与步骤221实验材料准备及形态学观察配置TCBS培养基，高压灭菌后倒在平板内，将所取得到的水样按原液加入生理盐水而分为五个稀释梯度浓度接种至平板上，每个梯度做三个重复，
18、用划线法接种在平板上，在培养箱中培养一段时间后，挑出单菌落后接种在新的TCBS培养基上继续培养。从而分离纯化得到的两株菌。两株菌在TCBS培养基和2216E平板培养基上30培养1天。分别对此两株菌在TCBS培养基及2216E平板培养基生长的菌落形态学特征进行观察记录。222改良弧菌DNA提取方法由于弧菌本身富含黏性多糖，蛋白等杂质尤其是多糖物质难以除去，应用传统法提取弧菌DNA效果不理想，经过多次尝试后用改良后的DNA提取方法DNA质量效果较好。现将改良弧菌DNA提取方法的展示步骤如下1从培养皿或斜面上挑取单菌落至大试管LB液体培养基，大试管液体扩繁12H左右，收集10ML培养液，10,000
19、G离心2MIN离心；2加入2MLTE悬浮沉淀菌体，再加入溶菌酶100UL（50MG/ML）、RNASEA10UL10MG/ML，摇匀后；37水浴30MIN；3加入120UL10SDS和蛋白酶K20MG/ML10UL，混匀后；60水浴30MIN1H；注意观察粘稠度增加和破壁效果。4加入500UL5MOL/LNACL，320ULCTAB/NACL，65水浴10MIN；53ML酚氯仿25241抽提一次（一定要混匀）；在4，12，000G离心10MIN；6转移上清后用等体积氯仿异戊醇241抽提23次（转移上清过程中应避免吸入中间沉淀杂质，建议用剪掉尖端的TIPS来吸取转移上清）；在4，12，000G离
20、心10MIN；7加入1/10体积的3MOL/LNAAC，06体积异丙醇（或1体积的无水乙醇）沉淀DNA；在4，12，000G离心1MIN；8用70的酒精洗少量多次，三次以上。第一次不用弄起DNA沉淀，第二次洗涤弄起DNA沉淀，混匀充分后洗涤。第三次重新洗涤，尽量减少DNA里面的盐分和其他杂质。9所得的沉淀DNA用50UL水溶解，加入50UL的5MOL/L的NACL溶液，充分混匀。加入06倍体积的异丙醇沉淀后重新70酒精洗涤。风干后，用25UL水溶解样品。10风干后，用50UL水溶解样品，20保藏以备进一步使用。223DNA测定凝胶电泳制备1的琼脂糖凝胶，5LDNA样品和1L6XLOADINGB
21、UFFER混匀后添加至加样孔，电5泳100V，20MIN。电泳检测可鉴定DNA样品的完整性和质量，通过电泳中DNAMARKER也可推算出DNA大致浓度。超微量紫外可见分光光度取1LDNA样品，以1LDDH2O为对照，超微量紫外可见分光光度计测定OD260/OD280和浓度。22416SRRNA基因的扩增与测序PCR扩增两株未知优势弧菌的16SRRNA基因所用的引物为通用引物。上游引物5AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG3；下游引物5GGTTACCTTGTTACGACTT3。25L的反应总体系中包括模板DNA1LPCRBUFFER2L上游引物1L下游引物1LDNTPS2LTAQASE0
22、5LQQH2O175L总体积25L混匀后，PCR反应条件如下94预变性3MIN34个扩增循环94变性45SEC温度梯度退火72延伸适当时间72继续延伸10MIN。PCR产物经琼脂糖/1TAE凝胶电泳和紫外检测后，回收目的DNA条带。PCR扩增产物经检测后送上海生物工程技术公司测序。225生物信息学分析对两株优势弧菌测序后的16SRRNA基因序列结果的生物信息学分析主要基于16SRRNA基因序列比对和系统发育树构建来对此两株优势弧菌的种属分类学地位进行鉴定。为确定测序所得的两株未知弧菌的16SRRNA基因序列和模式弧菌的16SRRNA序列之间的相似性或同源性，利用CLUSTAL软件将序列按照特定
23、规律排列，利用CLUSTAL程序序列排列在一起后进行同源性分析。CLUSTAL程序有许多版本，CLUSTALW（THOMPSON等，1994）15，根据对亲缘关系较近的序列间空位情况，确定如何在亲缘关系较远的序列之间插入空位。为进一步确定此两株未知弧菌的种属关系，我们根据基因测序结果和相关网站上的弧菌属内和弧菌属间的16SRRNA基因序列来进行系统发育进化树的构建。弧菌属间选择了杀鲑气单胞菌AEROMONASSALMONICIDA，弧菌属内种选择了多株哈维氏弧菌（VIBRIOHARVEYI）、多株溶藻弧菌（VIBRIOALGINOLYTICUS）以及霍乱弧菌（VIBRIOCHOLERAE）、拟
24、态弧菌（VIBRIOMIMICUS）、创伤弧菌（VIBRIOVULNIFICUS）等。对于此两株未知分离菌的16SRRNA基因序列通过NCBI的BLAST检索系HTTP/WWWNCBINLMNIHGOVBLAST或RDP网站（HTTP/RDPCMEMSUEDU/）进行序列同源性分析，并使用MEGA40软件的ALIGNMENTCLUSTAL/ALIGNBYCLUSTALW在与GENEBANK数据库或RDP数据库中获得的序列相似性较高的菌株的序列进6行多序列匹配排列MULTIPLEALIGNMENTS和成对序列匹配排列（PAIRWISEALIGNMENTS），采用MEGA40MOLECULAREV
25、OLUTIONARYGENETICSANALYSIS，MEGA软件构建系统发育树，采用邻接法NEIGHBORJOININGMETHOD建树方法，并通过BOOTSTRAP法1000次重复检验。系统学分类描述不同生物之间的相关关系，通过系统学分类分析可帮助人们了解所有生物的进化历史过程16。构建系统树具体步骤如下1建立TXT文档，从NCBI或RDP网站下载不同属种的16SRRNA基因FASTA文件，将所需序列复制到记事本中。WPS建树时，先将属内所有种的序列下载，还有科内其他属各选择一个或多个序列下载下来，其中SP等的种不需要加入到记事本中来。2将下载的序列和已经得到的两株未知菌的序列并入到同一个
26、TXT文档中，并在MEGA40上进行比对修饰构建系统发育进化树。打开MEGA40软件输入序列ALIGNMENTALIGNMENTEXPLORER/CLUSTALOKYES复制记事本上所有序列到MEGA40中ALIGNMENTCLUSTAL/ALIGNBYCLUSTALWOK转换成MEGA格式DATAEXPORTALIGNMENT导出MEGAFORMAT和FASTAFORMAT（命名保存）打开MEGAFORMAT序列框PHYLOGENYBOOTSTRAPTESTOFPHYLOGENYNEIGHBORJOININGCOMPUTEIMAGESAVEASENHANCEDMETAFILE命名保存3结果与
27、分析31两株弧菌的分离及形态学观察最初环境样品为朱家尖浅水区水样，用梯度浓度平板法在TCBS上培养，分离物间的菌落特征有一定差异。因此选择来自不同编号分别为XHS2和461的两个菌株作进一步研究。XHS29号菌株和461号菌株这两株弧菌的个体形态特征较为相似这两株菌革兰氏染色均为阴性,呈短杆状或短弧状,都可运动,两株弧菌的大小均为06M08M09M2M。而菌落形态比较见表1。表1菌落形态比较TABLE1THECOMPARISONOFTHECOLONYMORPHOLOGY7图1A图1B图1菌落形态图（TCBS培养基）FIGURE1THEFIGUREOFCOLONIALMORPHOLOGYTCBS
28、CULTUREMEDIUM图1A中为461号菌株，图1B为XHS29号菌株THEFIGURE1AREPRESENTSTHECOLONIALMORPHOLOGYOF461STRAINVIBRIO，ANDTHETHEFIGURE1BREPRESENTSTHECOLONIALMORPHOLOGYOFXHS29STRAINVIBRIO32两株弧菌的DNA提取及测定提取弧菌的总DNA经超微量紫外分光检测纯度（OD260/280值18左右）和浓度（1000NG/UL左右均较好。利用改良法提取DNA电泳结果表明总DNA质量较佳（见图1中XHS2和461），而传统法提取总DNA电泳结果表明总DNA仍由于富含粘
29、性多糖未被除去而呈滞状（见图2中XHS2和461）。XHS2924612XHS29461M8图2两株弧菌总DNA电泳图FIGURE2THEDNAGELELECTROPHORESISOFTHETWOSTRAINSVIBRIOM表示为MARKER，XHS29（2）表示为改良法提取XHS29弧菌DNA的电泳图，461（2）表示为改良法提取461弧菌DNA的电泳图，XHS29表示为传统法提取XHS29号弧菌DNA的电泳图，461表示为传统法提取461号弧菌DNA的电泳图。THEMREPRESENTSTHEMARKER,XHS292REPRESENTSTHEDNAGELELECTROPHORESISBY
30、THEMODEFIEDMETHODOFTHEXHS29STRAINVIBRIO4612REPRESENTSTHEDNAGELELECTROPHORESISBYTHEMODEFIEDMETHODOFTHE461STRAINVIBRIOXHS29REPRESENTSTHEDNAGELELECTROPHORESISBYTHETRADITIONALMETHODOFTHEXHS29STRAINVIBRIO461REPRESENTSTHEDNAGELELECTROPHORESISBYTHETRADITIONALMETHODOFTHE461STRAINVIBRIO3316SRRNA基因序列的PCR扩增与测序
31、本实验对两株弧菌的16SRRNA基因PCR扩增的引物为通用引物。上游引物5AGAGTTTGATCCATGGCTCAG3；下游引物5GGTTACCTTGTTACGACTT3。PCR产物经凝胶电泳鉴定图如下，基因长度约1000BP左右，说明扩增目的基因成功。PCR扩增产物由上海生物工程技术公司进行基因序列测定。XHS29461M图3PCR结果电泳图FIGURE3THEGELELECTROPHORESISOFTHEPCRPRODUCTM表示为MARKER，XHS29表示为以改良法提取的XHS29号菌株总DNA为模板，以通用引物为引物扩增出的16SRRNA基因片段，而461表示为以改良法提取的461号
32、菌株总DNA为模板，以通用引物为引物扩增出的16SRRNA基因片段。9MREPRESENTSTHEMARKERXHS29REPRESENTSTHATTHIS16SRRNAGENEFRAGMENTISAMPLIFIEDWITHTHETEMPLATEOFTHEXHS29STRAINVIBRIOTOTALDNABYTHEIMPROVEDDNAEXTRACTIONMETHODANDWITHTHEUNIVERSALPRIMERASTHEPRIMERWHILE461REPRESENTSTHATTHIS16SRRNAGENEFRAGMENTISAMPLIFIEDWITHTHETEMPLATEOFTHE461
33、STRAINVIBRIOTOTALDNABYTHEIMPROVEDDNAEXTRACTIONMETHODANDWITHTHEUNIVERSALPRIMERASTHEPRIMER3416SRRNA基因序列分析分离菌XHS29号菌所扩增的16SRRNA基因序列长度为1067BP，而461号菌所扩增的16SRRNA基因序列长度为1242BP。XHS29和461号菌株与S000426482VIBRIOHARVEYITNCIMB1280TAY750575菌株以及GI|AY3730271|VIBRIOALGINOLYTICUS16SRIBOSOMALRNAGENE序列部分比对结果如下图416SRRNA基因
34、序列部分比较分析图FIGURE4THEPARTIALCOMPARISONANALYSISPHOTOGRAMSOFTHE16SRRNAGENE35系统发育分析16SRRNA基因序列分析鉴定一般能够精确到种的水平，因此可以用来鉴定用其他方法难于区分的弧菌。弧菌属间的代表选择了杀鲑气单胞菌AEROMONASSALMONICIDA模式菌（TYPESTRAIN），弧菌属内种选择了多株哈维氏弧菌（VIBRIOHARVEYI）、多株溶藻弧菌（VIBRIOALGINOLYTICUS）以及霍乱弧菌（VIBRIOCHOLERAE）、10拟态弧菌（VIBRIOMIMICUS）、创伤弧菌（VIBRIOVULNIFIC
35、US）等参与进化树的构建。图5461及XHS29弧菌16SRRNA基因系统进化树FIGURE5THEPHYLOGENETICTREEOFTHE16SRRNAGENEINCLUDING461ANDXHS29STRAINVIBRIOS分支旁的数字为BOOTSTRAPTEST1000次的置信度标尺表示1的核苷酸序列差异NUMBERSNEARTHEBRANCHESAREBOOTSTRAPPROBABILITYVALUESWITH1000REPLICATESSCALEBARCORRESPONDSTO1DIFFERENCEINNUCLEOTIDESEQUENCE由图5可以看出461号菌株与溶藻弧菌（VIB
36、RIOALGINOLYTICUS）在进化系统发育树上聚集为一个分支，而XHS29号菌株则与哈维氏弧菌（VIBRIOHARVEYI）聚集为一个分支。4讨论41形态学观察弧菌与人类肠道感染性疾病和水产品养殖感染性疾病有关，与人类生活密切相关。据相关研究表明，已知的致病弧菌有70多种，哈维氏弧菌VHARVEY、副溶血弧菌VPARAHAEMOLYTICUS、溶藻弧菌11VALGINOLYTICUS、鲨鱼弧菌VCARCHARIAE、霍乱弧菌（VCHOLERAE）、创伤弧菌VIBRIOVULNIFICUS、鳗弧菌VANGUILLARUM和最小弧菌VMIMICUS等是主要的致病弧菌。其中溶藻弧菌与哈维氏弧菌
37、较难区分，因为溶藻弧菌与哈维氏弧菌都同属于哈维氏弧菌群，在系统分类学上，通过形态学观察以及生理生化检测都难以达到准确的鉴定结果。分离的两株弧菌菌落形态上有一定的相似性，光学显微镜下观察到的形态结构，可运动性，大小也很相似。菌落形态之间有一定差异，溶藻弧菌的菌落（TCBS培养基）直径一般稍大于哈维氏弧菌。菌落湿度，色泽，边缘规则性也有所不同。但是根据以上的结果，仅通过形态学观察只能给出初步的判断而不能做出最终鉴定结果的依据。本次实验并未涉及相关的生理生化鉴定反应，根据相关资料，弧菌属菌种具有兼性厌氧、氧化酶阳性、发酵葡萄糖产酸不产气、对弧菌抑制剂O/1292,4二氨基6,7二异丙基喋啶磷酸盐,1
38、50G/ML敏感等特征，溶藻弧菌和哈维氏弧菌的测定结果都一致。42改良弧菌DNA提取方法传统法提取的DNA对于弧菌来说，由于特性各异，有些较为适用，但是仍有大量弧菌由于富含黏性多糖、RNA等杂质而导致提取DNA效果不佳。通过试剂盒（MOBIOULTRACLEANSOILDNAISOLATIONKIT）提取的弧菌总DNA效果也较好，但是若提取弧菌DNA的种类繁多时，费用较多。而使用改良法提取DNA利用CTAB/NACL和高盐条件下黏性多糖沉淀的特点而除去多糖，对提取后的DNA重新使用NACL提高DNA溶液中盐浓度而重新洗涤而进一步除去黏性多糖，这样提取的DNA效果较为理想，也适合进一步的实验以及
39、保藏备用。43弧菌分子鉴定结果16SRRNA基因的功能同源性高而且古老，其中既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，且其序列变化与进化距离相适应，因此16SRRNA基因是细菌分类学研究中最常用、最有用的分子钟。通过分析16SRRNA基因序列，可以判定不同菌属、菌种间遗传关系及亲缘关系的远近，如DNA杂交同源性在60一70以上，或细菌间16SRRNA序列同源性达到97以上的菌株就可定为一个种，如同源性只有95，则判定为属于不同属17。应用16SRRNA基因可以快速鉴定表型上难以区分的弧菌。哈氏弧菌与创伤弧菌之间，以及双氮弧菌与鳗弧菌等通过表型难以区分，通过16SRRNA基因来对弧菌进行鉴定
40、和区别已经有学者对此作出研究。但对于哈维氏菌群内通过16SRRNA基因来鉴定尚未有人做出鉴定，而且16SRRNA基因分析的高速度，高精度，高通量可以为大规模研究菌落生态演替和生长环境变化打下理论和工具基础。BLAST分析结果表明XHS29号菌株的16SRRNA基因序列与包括模式菌株在内的几株哈维氏弧菌（VIBRIOHARVEYI）最为接近,相似性均为98以上,而与所有其它弧菌相似性均不到93。461菌株的16SRRNA基因序列与包括模式菌株在内的几株溶藻弧菌（VIBRIOHARVEYI）最为接近,相似性均为98以上,而与所有其它弧菌相似性均不到93。461号菌株、XHS29号菌株与溶藻弧菌、副
41、溶血弧菌和哈氏弧菌模式菌株的16SRRNA基因序列比较如图4。16SRRNA基因系统发育树图5上461号菌株与溶藻弧菌紧密聚集为一个分支,而与其它弧菌明显区分。XHS29号菌株与哈维氏弧菌紧密聚集为一个分支，而与其他弧菌明显区分，综合上述形态、生理生化特征、16SRRNA基因序列分析结果,可将菌株461鉴定为溶藻弧菌，XHS29号菌株为哈维氏菌株。5结论1本文建立了一种基于CTABNACL法的改良的DNA提取的方法，主要通过对黏性多糖的沉淀而多步除去，从而从富含黏性多糖的弧菌中提取获得了高质量的DNA。122本文以16SRRNA基因作为分子标记对环境样品中分离的两株未知弧菌样品进行系统发育学分
42、析从而对其分类学地位进行鉴定，鉴定结果为461号菌株为溶藻弧菌，而XHS29号菌株为哈维氏弧菌。3利用16SRRNA基因作为鉴定这两种较难区分的在海水特别是近岸养殖海水中较常见的优势弧菌，将会为水产品养殖、环境微生物学中群落更替以及校正过去系统分类学的错误提供一种重要的工具手段。虽然16SRRNA基因序列具体分子进化的系统发育机理目前还未能有明确的结论，但是本次实验作为弧菌系统分子分类学的一部分，一方面有助于进一步阐明弧菌的系统发育学分析，另一方面也为通过进一步研究与其他相关基因结合更进一步提高分子鉴定的分辨率从而为弧菌系统分类学提供了更多的实验支持，具有重要的理论意义和应用价值。参考文献1东
43、秀珠,蔡妙英常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社20011061282CRISTIANECTHOMPSON,ANACAROLINAPVICENTE,RANGELCSOUZAGENOMICTAXONOMYOFVIBRIOSJBMCEVOLUTIONARYBIOLOGY2009,9258213121483WILLIAMS,WILLKINS,BALTIMOREBERGEYSMANUALOFSYSTEMAICBACTERIOLOGYM19862842964THOMPSONFL,KLOSEKEVIBRIOTHEFIRSTINTERNATIONALCONFERENCEONTHEBIOLOGYOFVIBRI
44、OSJBACTERIOL2005,18813459245965DUBNAUD,SMITHI,MORELLP,ETALGENECONSERVATIONINBACILLUSSPECIESCONSERVEDGENETICANDNUCLEICACIDBASESEQUENCEHOMOLOGIESJPMCNAILACADSCIUSA1965,5424914986WOESECRBACTERIALEVOLUTIONJMICROBIOLREVL987,512212717WOESECR,FOXGEPHYLOGENETICSTRUCTUREOFTHEPROKARYOTICDOMAINTHEPRIMARYKINGDO
45、MSJPROCNATLACADSCIUSA1977,7411508850908BIOSCAEG,OLIVERJD,AMAROCPHENOTYPICCHARACTERIZATIONOFVIBRIOVULNIFICUSBIOTYPE2,ALIPPOLYSACCHARIDEBASEDHOMOGENEOUSOSERIGRAPHWITHINVIBRIOVULNIFICUSJAPPLENVIMICROBIOL1996,6639189279YAMAMOTOS,HARAYAMASPCRAMPLIFICATIONANDDIRECTSEQUENCINGOFGYRBGENESWITHUNIVERSALPRIMERS
46、ANDTHEIRAPPLICATIONTOTHEDETECTIONANDTAXONOMICANALYSISOFPSEUDOMONASPUTDASTRAINSJAPPLENVIRONMICROBIOL1995,6131104110910杨鸢劫,俞菊华,陈辉等暗纹东方鲢非O1群霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测J水产学报2006,30452553011FOUZB,AMAROCISOLATIONOFANEWSEROVAROFVIBRIOVULNIFICUSPATHOGENICFOREELSCULTUREDINFRESHWATERFARMSJAQUACULTURE2003,21767768212韩先朴,卢全
47、章鳗鲡弧菌病病原的分离与鉴定J微生物学报1984,24438639113林天龙,许斌福,董传甫等鳗鲡创伤弧菌的分子鉴定J中国人兽共患病杂志2005,211199599714王国良,金珊,薛良义等海水网箱养殖鲈鱼皮肤溃疡病及其病原菌的研究J黄渤海海洋2000,183858915THOMPSONC,THOMPSONK,VANDEMEULEBROECKEK,ETALUSEOFRECAASANALTERNATIVEPHYLOGENETICMARKERINTHEFAMILYVIBRIONACEAEJINTERNATIONALJOURNALOFSYSTEMATICANDEVOLUTIONARYMICROB
48、IOLOGY2004,545,91992416塞文婴,东秀珠定向进化同源基因在细菌系统进化研究中的应用J微生物学通报2000,27537738117朱传华,何建国,黄志坚网箱养殖石斑鱼爆发性溃疡病病原菌分离、鉴定及致病性研究J中山大学学报2000,39327828218谢珍玉,胡超群弧菌毒力基因水平转移与进化的研究进展J热带海洋学报2005,243869519郭明元,刘广锋,冯娟1株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析J中国水产科学2006,13582382820LINKOUSDA,OLIVERJDPATHOGENISISOFVIBRIOVULNIFWUAMINIREVIEWJFEMSMIC
49、ROBIOLLETTERS1999,1741620721321邴旭文,阎斌伦,张晓君等泥鳅病原霍乱弧菌的表型与分子鉴定J海洋与湖沼2009,40669269822张晓君,陈翠珍,阎斌伦等凡纳滨对虾病原副溶血弧菌的表型及分子特征J海洋与湖沼2009,40565466213附录附录一XHS29号菌株的16SRRNA基因测序结果XHS29GGAGGTTGCGTAGCCTGATACGTGCAGTCGAGCGGAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGAACGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC
