1、本科毕业设计（20_届）免培养法研究三疣梭子蟹养殖塘细菌群落演替所在学院专业班级海洋生物资源与环境学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1前言12材料和方法121样品采集122水样的总DNA提取1221试剂1222菌体收集1222总DNA提取123PCR扩增16SRDNA全序列22416SRDNA克隆文库的构建及测序3241PCR产物的纯化、回收与连接3242ECOIL感受态细胞的制备3243连接产物的转化325PCRDGGE技术326基于16SRDNA的系统发育学分析53结果与讨论631A克隆文库分析6311PCRDGGE分析6312系统发育学分析732B克隆文库分析9321PCRDGGE
2、分析9322系统发育学分析113316SRDNA克隆文库的多样性分析144小结15参考文献17附录20I摘要三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）是我国海产经济蟹类，但是病害发生频繁。养殖水体中菌群结构及其演替规律对于探明梭子蟹发病原因及制定病害防治措施具有重要意义。本文采用构建16SRDNA克隆文库的方法调查三疣梭子蟹养殖塘水体中七月份和八月份细菌的群落结构。通过两个16SRDNA克隆文库的构建，共获得了131条有效序列。结果发现，两个文库中细菌的多样性丰富，共可归属为五个门变形菌门（PROTEOBACTERIA）、蓝细菌门（CYANOBACTERIA）、放线菌门（AC
3、TINOBACTERIA）、CFB类群（CYTOPHAGAFLAVOBACTERIUMBACTEROIDES）以及厚壁菌门（FIRMICUTES）。其中细菌优势类群为蓝细菌门、变形菌纲和变形菌纲，同时获得了蓝细菌门等通过细菌普通培养法无法获得的类群，故通过克隆文库可以更加全面的反映养殖塘水体细菌群落结构。不同养殖时间，蓝细菌门始终占优势，变形菌门、放线菌门和CFB类群细菌均有所增加，而厚壁菌门消失，两个克隆文库中细菌的群落组成及比例明显不同，即实验期间梭子蟹养殖水体中细菌群落发生了演替现象。关键词三疣梭子蟹；细菌群落演替；克隆文库ABSTRACTPORTUNUSTRITUBERCULATUSI
4、SAKINDOFMARINEECONOMYCRABSINCHINA,BUTDISEASEOCCURSFREQUENTLYASTHECOMMUNITYSTRUCTUREANDSUCCESSIONOFMICROORGANISMINAQUACULTURE16SRDNACLONELIBRARYCONSTRUCTIONWASUSEDTOINVESTIGATEBACTERIALCOMMUNITYSTRUCTUREINTHESAMEWATEROFPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDINJULYANDAUGUSTBYTHECONSTRUCTIONOFTWO16SRDNACLON
5、ELIBRARY,131EFFECTIVESEQUENCESHASBEENOBTAINEDTHEBACTERIALCOMMUNITIESOFTHETWOCLONELIBRARIESWEREFOUNDTOBEDIVERSE,INCLUDINGMEMBERSOFFIVEPHYLIPROTEOBACTERIA,CYANOBACTERIA,ACTINOBACTERIA,CYTOPHAGAFLAVOBACTERIUMBACTEROIDESCFBGROUP,ANDFIRMICUTESBACTERIAASSIGNEDTOCYANOBACTERIA,PROTEOBACTERIAANDPROTEOBACTERI
6、AWEREDOMINATEDCYANOBACTERIAWHICHDIDNTOBTAINEDWITHTHEMETHODOFMICROBIOLOGICALCULTURESOTHROUGHCULTIVATIONINDEPENDENTMETHODCANMOREFULLYREFLECTTHEREARINGPONDWATERBACTERIALCOMMUNITYSTRUCTURETHEBACTERIALCOMPOSITIONSOFTWOLIBRARYWEREDIFFERENTINPARTICULAR,THEPROPORTIONSOFVARIOUSGROUPSSHIFTEDSIGNIFICANTLYACROS
7、STHESAMPLINGDATESKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSBACTERIALCOMMUNITYSUCCESSIONLIBRARYCONSTRUCTION11前言梭子蟹养殖塘一般是一种人工生态系统，其中微生物对这种系统的平衡起着很重要的作用，特别是细菌，对梭子蟹的健康生长也有着非常重要的影响12。在这个生态系统中，细菌群落组是相对稳定的状态，有益菌和有害菌二者的相互制约使得养殖动物处在一个相对稳定的环境中，但一旦细菌群落组成发生了变化，将会导致其生态功能多样性发生较大改变，因此而产生一系列后果，包括水质的恶化和病害的爆发等34。因此，对养殖环境中的细菌群落演
8、替进行研究分析是非常有必要的。越来越多的证据表明，自然界中绝大部分的微生物无法纯培养5，由于不可培养微生物的物种类群及新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着丰富的多样性和新颖性，因而比起以往的可培养微生物就具有更加多样和丰富的可以供给人类进行开发和利用的生物资源6。本研究从三疣梭子蟹养殖塘水样中直接提取细菌总DNA，然后通过构建16SRDNA克隆文库的方法来分析水体中微生物的群落演替，从而更为全面的了解不同养殖阶段养殖水体中微生物的群落组成及变化。2材料和方法21样品采集我们于2008年7月12日、8月1日对宁海县明港东坝的三疣梭子蟹养殖塘进行为期两个月的跟踪调查。调查期间，分批次采集水样
9、，采样间隔为2030D。水样的采集时间为11001300AM，采集方法遵照海洋调查规范第6部分7海洋生物调查GB/T1276362007）的要求进行，在采样前开动水车30MIN，使水体充分混匀，然后从深度约05M处取水，采样量为5L，共采样3次。水样采集后贴上标签，立即置于黑暗、4的样品保存箱中保存,在4H内对样品进行处理8。22水样的总DNA提取221试剂TE缓冲液100MMTRISCL（PH80），10MMEDTA（PH80），10贮存液（PH80），分装后121灭菌20MIN，室温保存；溶菌酶缓冲液40MMEDTA（PH80），50MMTRISCL（PH80），10M/V）蔗糖，用022
10、M的过滤器过滤除菌，4保存；STE缓冲液10MMEDTA（PH80），25MMTRISCL（PH80），50MM葡萄糖，121灭菌20MIN，4保存；1工作液（PH80）1MMEDTA（PH80），10MMTRISCL（PH80）9。222菌体收集菌体收集采用MILLIPORE过滤浓缩系统，过滤水样的体积为2L，先用1M的微孔滤膜进行预过滤，去除一些杂质和较大的真核单细胞浮游生物，收集滤液。再将滤液经过022M的微孔滤膜过滤4，菌体被截留在滤膜上。在无菌操作条件下，将滤膜剪碎后，置于50ML无菌聚乙烯离心管中待用。223总DNA提取采用SDS煮沸法101向M1管中加入5MLSTE缓冲液，在漩涡
11、混合器上充分振荡；2加1/10体积的20的SDS溶液约500L），混匀后，放入沸水浴25MIN，将裂解液转移至新的无菌离心管中，冰浴10MIN，温度为20，；3室温离心，10000RPM，10MIN，弃去上清液；4用600L的1TE缓冲液溶解沉淀，然后将溶液转移至15MLEP管中；25加等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液25241，V/V）（约600UL），用手轻轻混匀，再进行离心，10000RPM，4MIN；6收集上清液，然后再加入等体积的氯仿/异戊醇溶液241，V/V）（约500UL）混匀，进行离心，10000RPM，4MIN；7收集上清液，然后加入1/10体积的3M的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇
12、，混匀，室温沉淀10MIN，离心，10000RPM，10MIN；8弃上清液，用70乙醇洗脱一次，然后再次离心10000RPM，10MIN，弃去上清液，自然干燥，加1TE溶液或无菌双蒸水溶解DNA，置于20冰箱中保存备用；23PCR扩增16SRDNA全序列以基因组DNA作为模板进行PCR扩增，采用细菌通用引物27F和1541R扩增16SRDNA的全序列，用于测序11。引物序列见表1。表1扩增16SRDNA全序列所用引物列表TAB1PRIMERSFOR16SRDNAAMPLIFICATION引物名称引物序列（53）扩增片段片段大小27FAGAPTTTGATCCTGGCTCAG16SRDNA全序列约
13、1500BP1541RACGGCTACCTTGTTACGACT50L的PCR反应体系组成为1210PCRBUFFER（含MG2）5L正向及反向引物4MOL/LDNTP200MOL/LTAQDNA聚合酶1U模板DNA50NG补双蒸水（DDH2O）至50L。PCR反应程序1394，5MIN；94，1MIN，55，1MIN，降落梯度为0510个循环72，05MIN；94，1MIN，60，1MIN，18个循环55，05MIN；72，3MIN。为获得较好的特异性产物，采用降落PCR对反应体系进行扩增。PCR产物采用15W/V琼脂糖凝胶（含有05G/ML溴化乙锭）电泳进行检测，点样量为45L。32416S
14、RDNA克隆文库的构建及测序241PCR产物的纯化、回收与连接琼脂糖凝胶电泳后，将PCR产物对应的目标条带切下，用UNIQ10柱式通用DNA纯化试剂盒上海生工）进行纯化回收DNA，将产物连接到载体PMD18TVECTORTAKARA）上，连接反应的体系及反应条件应参考试剂盒厂家推荐的方法，然后根据实际情况进行适当的调整14。10L反应体系的组成16SRDNA45LLIGATIONMIX内含连接酶）5LT载体50NG/L）05L将上述各成分混匀后，进行低速离心，使管壁无残留液滴，然后在4条件下连接1624H242ECOIL感受态细胞的制备采用传统的CACL2法制备大肠杆菌感受态细胞，具体步骤为1
15、将ECOILDH5接种在LB平板上，37，12H，然后挑取大肠杆菌单菌落接种在100ML无菌的LB液体培养基中，37，200R/MIN，振荡培养68H，至OD60005左右为止；2取两个50ML无菌离心管置冰上预冷，将上述培养液转入离心管中，每管50ML，冰上放置10MIN，4，离心，4000RPM，10MIN；3弃上清夜，取用冰预冷过的01MOL/LCACL2溶液10ML，轻轻悬浮细胞，然后放置冰上2MIN，4离心，4000RPM，10MIN；4重复步骤3一次，弃上清夜，取13ML用冰预冷过的01MOL/L的甘油CACL2溶液轻轻悬浮细胞，放置冰上3MIN，即成为感受态细胞；5将感受态细胞悬
16、液进行分装，并贮存于70冰箱中；243连接产物的转化向上述10L连接产物中加入100L感受态细胞，轻轻混合后，置冰上20MIN，然后用42的水浴热激15MIN，之后进行冰浴25MIN，再加入800L的液体LB培养基，37振荡培养45MIN；然后取200L菌液，涂布在含有AMP的LB平板上，37连续培养12H。之后挑取白色转化子，构建菌株16SRDNA全序列克隆文库，并送到上海生工测序。25PCRDGGE技术PCRDGGE分析技术也称指纹图谱分析技术，指PCR扩增过的标记序列通过电泳技术解析成具有特定条带特征的图谱，一般每个条带可以看作时一个微生物类群1516。以基因组DNA作为模板进行PCR扩
17、增，采用细菌通用引物GC341F和518R对16SRDNA的V3区进行扩增，产物长约230BP，用于DGGE分析。所用引物见表2。扩增体系和反应程序见23。表2扩增不同16SRDNA片段所用引物4TAB2PRIMERSFOR16SRDNAAMPLIFICATION引物名称引物序列（53）扩增片段片段大小GC341FCGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTACGGGAGGCAGCAG16SRDNA的V3可变区约230BP518RATTACCGCGGCTGCTGG变性梯度凝胶电泳（DGGE）在DCORDSYSTEM（BIORAD）上进行，采用8聚丙烯酰胺
18、凝胶，变性梯度为4070，每个点样孔点68LPCR产物17。DGGE相关试剂30丙烯酰胺/双丙烯酰胺（291）丙烯酰胺290G双丙烯酰胺10GDH2O定容至100ML50TAETRIS碱2M05MEDTA（PH80）50MM乙酸1M上样缓冲液（LOADINGDYE）2溴芬蓝025ML2二甲苯箐蓝025ML100甘油70MLDH2O25ML18ML的40变性胶30丙烯酰胺/双丙烯酰胺48ML尿素3024G去离子甲酰胺288ML50TAE360UL双蒸水定容至18ML18ML的60变性胶30丙烯酰胺/双丙烯酰胺48ML尿素4536G去离子甲酰胺432ML50TAE360UL双蒸水定容至18ML操作
19、步骤181）选择合适的玻璃板和梳子，用去离子水洗净玻璃板，晾干，按要求完成凝胶架的安装；2）在高浓度和低浓度变性胶中加入适量的APS和TEMED，混匀，灌制下层胶；53）灌胶期间应使液面保持水平、匀速上升，灌胶完成后用蒸馏水封顶；4）待下层胶凝固后，灌制上层浓缩胶，缓慢的插入梳子，放入梳子时注意避免产生气泡，室温放置12H；5）上层胶凝聚后，取出梳子，用电泳缓冲液吹洗各点样孔，检测电泳液是否会漏。然后将胶板置于1TAE缓冲液中，预热至55；6）将PCR产物与上样缓冲液按11的比例混合，点样；7）调节电泳仪，使电压为180V，温度保持在55，电泳6H；8）电泳结束后，将胶小心取出，银染或EB染色
20、。银染191）固定电泳结束取出胶板，将胶置于固定液（10乙酸）中，固定30MIN；2）洗涤用去离子水或双蒸水漂洗23次；3）染色漂洗后，将胶放入染色液中（AGNO31G/L，37甲醛2ML/L），轻摇30MIN；4）洗涤用去离子水或双蒸水漂洗；5）显影将胶放入冰预冷的显影液中（NA2CO330G/L，37甲醛2ML/L，10MG/MLNA2S2O4200L/L），轻摇至有条带出现。6）停显影将显影后的胶放入10乙酸中轻摇35MIN。7）漂洗用双蒸水洗涤23次，即可。拍照染色后，用凝胶成像系统观察电泳条带并拍照。26基于16SRDNA的系统发育学分析在RDP数据库中对得到的序列进行嵌合体检验，排
21、除质量较差的序列20。用FASTGROUPIIHTTP/BIOMESDSUEDU/FASTGROUP/FG_TOOLSHTM）程序对每个克隆文库的序列进行分组，并将相似性大于98的菌株作为一个OTU，即可操作分类单元，其中每个OTU中选择一株菌作为代表菌株，并用BLAST程序HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/）进行同源性搜索，然后选取与其同源性较高的菌株的16SRDNA序列作为参比对象。将得到的序列进行进一步的系统发育分析，利用MEGA4软件进行多重序列比对，并采用邻接法（NEIGHBOURJOINING）构建系统发育树，根据公式1计算每个克隆文库的覆盖率COVERAGE
22、，C）21；使用FASTGROUPII程序分析文库的多样性指数SHANNONWEINER、物种的丰富度指数及SIMPSON指数D22。覆盖率C）的计算公式公式1）其中N代表16SRDNA文库总克隆数，NL代表在文库中仅出现一次的OTU的数量。SHANNONWIENER指数H1LNSIIIHPP公式2）EVENNESS指数JSHJLN公式3）SIMPSON指数D211ISIDP公式4）6定义不同种的序列作为不同分类单元，以上各式中S为样品中的OTU数目，IP为属于OTU第I个种在全部种中的比例（IIPNN），IN为第I种的个体数，N为个体总数。J取值范围在01之间，反映了种间个体分布的均匀度；D
23、值是种类的优势度。3结果与讨论31A克隆文库分析311PCRDGGE分析七月份，从水样中共挑取125个克隆构建16SRDNA克隆文库，称为A文库，编号为A1A125，其中2株在分离过程中死亡。通过DGGE分析图谱将123个克隆归为47个不同的DGGE带型，其中与A7条带类型相同的克隆数最多，共20个，占总克隆数的163；与A9相同的克隆数15个，占总克隆数的122；与A84相同的克隆数10个，占总克隆数的81。由此可见，A7、A9和A84菌株是此克隆文库的代表菌株。另外，33个克隆是没有相同条带的，认为是不同的菌株都进行测序。见表3。表3七月份三疣梭子蟹养殖塘水样克隆文库的DGGE带型统计结果
24、TAB3DGGETYPESTATISTICALRESULTSOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESOFPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDINJULY克隆代表菌株具有相同条带类型的克隆编号相同克隆数量A50A3，6，24A36A52A43A172A28A31，34，38，40，496A1无1A4无1A23无1A25无1A42无1A52无1A51无1A57无1A59无1A66无1A67无1A68无1A69无1A74无1续表克隆代表菌株具有相同条带类型的克隆编号相同克隆数量A84A45，70，73，44，113，115，117，
25、121，123107A81A65，85，106，102，1076A62无1A72无1A7A8，12，11，13，16，19，20，21，22，23，24，27，30，29，32，33，37，39，4120A10无1A9A14，18，26，46，47，48，54，55，56，61，64，71，72，7515A60A632A35A53，583A82A86，88，91，92，104，1057A78A80，87，114，116，119，122，1258A76无1A118无1A83无1A89无1A90无1A93无1A94无1A97无1A98无1A99无1A103无1A95无1A96无1A112A101，
26、1203A110,A1002A108无1A109无1A111无1总数123312系统发育学分析将不同带型的47个克隆进行PMD检验，与质粒连接上的克隆数有31株，进行16SRDNA全序列的扩增并送测序，序列返回24株，其余7株序列未返回。该文库中有38个有效序列，有10个OTU，分属于5个门（见表4）。通过软件MEGA4构建发育树，属同一门的代表菌株位于发育树的同一分支上（见图1）。从表和图可知，CYANOBACTERIA纲菌株数最多，共有20株，占克隆总数的536，其中UNCULTUREDANABAENASP属占优势地位，有11株菌，占该纲克隆数的550，占克隆总数的289；其次为8UNCU
27、LTUREDPHOTOTROPHICEUKARYOTE，有8株菌，占该纲克隆数的400，占克隆总数的211。BACILLI纲也有较多菌株，包括3个种，共10株菌，占克隆总数的263。另外变形菌门包括4个纲ALPHAPROTEOBACTERIA、BETAPROTEOBACTERIA、GAMMAPROTEOBACTERIA、DELTAPROTEOPROTEOBACTERIA），各纲均为12株菌。其余各种的菌株数量均较少，仅为1株菌。表47月份三疣梭子蟹养殖塘水样克隆文库细菌群落组成的演替TAB4SUCCESSIONOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESOFPO
28、RTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDINJULY门/纲目/科种代表克隆登录号16SRDNA相似性克隆数ACTINOBACTERIAACTINOBACTERIDAE/ACTINOMYCETALESUNCLASSIFIEDACTINOMYCETALES/UNCULTUREDBACTERIUMA10EU592404991CYANOBACTERIA/CYANOBACTERIAFAMILYIGPI/UNCULTUREDANABAENASPA59EU40239710011FAMILYIIGPIIA/SYNECHOCOCCUSSPA25AB0582261001CHLOROPLAS
29、TCHLOROPHYTA/UNCULTUREDPHOTOTROPHICEUKARYOTEA111AY862008998FIRMICUTES/BACILLIBACILLALES/BACILLACEAEBACILLUS/BACILLUSSPA51FJ613839996BACILLUSALCALOPHILUSA109EU231621993UNCULTUREDFIRMICUTESBACTERIUMA108EU703276961PROTEOBACTERIA/ALPHAPROTEOBACTERIAUNCLASSIFIEDALPHAPROTEOBACTERIAUNCULTUREDBACTERIUMA68FJ
30、744955972P/BETAPROTEOBACTERIABURKHOLDERIALESUNCULTUREDBETAPROTEOBACTERIUMA23EF4714541001P/GAMMAPROTEOBACTERIACHROMATIALES/ECTOTHIORHODOSPIRACEAEALKALILIMNICOLA/UNCULTUREDBACTERIUMA69EU592402992续表门/纲目/科种代表克隆登录号16SRDNA相似性克隆数9P/DELTAPROTEOPROTEOBACTERIAUNCLASSIFIEDPROTEOBACTERIAUNCULTUREDDELTAPROTEOBAC
31、TERIUMA4FM242397961BACTEROIDETES/FLAVOBACTERIAFLAVOBACTERIALES/FLAVOBACTERIACEAEFLAVOBACTERIUM/UNCULTUREDFLAVOBACTERIABACTERIUMA42AF5344361001总数38图17月份三疣梭子蟹养殖塘水样克隆文库细菌的16SRDNA序列构建的系统发育树FIG1DENDRGRAMFORCLONELIBRARIESBACTERIABASEDONPARTIAL16SRRNAGENESEQUENCESOFWATERSAMPLESOFPORTUNUSTRITUBERCULATUSREAR
32、INGPONDINJULY32B克隆文库分析321PCRDGGE分析八月份，从水样中共挑取148个克隆构建16SRDNA克隆文库，称为B文库，编号为B1148，其中有3株在分离过程中死亡。通过DGGE分析图谱将145个克隆归为70个不同的DGGE带型。其中23个克隆是没有相同类型的条带，与代表菌株B16有相同条带类型的克隆数量最多，有14个，占总克隆数的97，其余有相同条带类型的克隆数较少。见表5。表5八月份三疣梭子蟹养殖塘水样克隆文库的DGGE带型统计结果TAB5DGGETYPESTATISTICALRESULTSOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESO
33、FPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDINAUGUST克隆代表菌株具有相同条带类型的克隆编号相同克隆数量B16，17，5B4，14，15，12，13，8，9，30、31、34，331410B6，7，28，29，24，25B327B3B1，23B10B112B20，21B18，19，22，236B26B272B55无1B53、54B513B52无1B50无1B49无1B48B412B47B39，353B46无1B45无1B44B422B40无1B36无1B372条明显条带，未测序1B38B432B63，64B85，77，81，846B67，68，75B69，70，
34、82，767B73B742B71B722B65B56、663B61、62无2B57，58B793B59、60B803B83无1B97B90，92，964续表克隆代表菌株具有相同条带类型的克隆编号相同克隆数量B87B952B88、89无2B93，105无2B94B1012B91无1B98无111B99无1B100无1B102无1B103无1B104无1B106B107、108、113、114、119、120、136、1379B134B123，124，1354B132B1332B130B131、115、1184B127B129，121，1224B125B126，111，1124B116B117，1
35、09，1104B138B1482B128无1B139无1B140B142、143、145、1465B141无1B147无1总数145322系统发育学分析将不同带型的70个克隆进行PMD检验，与质粒连接上的克隆有58个，进行16SRDNA全序列的扩增并送测序，序列返回52个，其余6个克隆序列未返回。该文库中有93个有效序列，有18个OTU，分属于4个门（见表6）。从表6和图2中可知，93个克隆分属于4个门，8个纲。各门中的克隆数量相差不大，CYANOBACTERIA、BACTEROIDETES、ACTINOBACTERIA、PROTEOBACTERIA分别有25、24、24、20个，占克隆总数的
36、269、258、258、215。ACTINOBACTERIA包括2个科3个种，其中UNCULTUREDACTINOBACTERIUM占优势地位，有21个，占该纲克隆数的875，占克隆总数的226。CYANOBACTERIA包括3个科4个种，其中SYNECHOCOCCUSSP和UNCULTUREDPHOTOTROPHICEUKARYOTE都有较多克隆，分别有11、10个，占该纲克隆数的44、400，占克隆总数的118、108。PROTEOBACTERIA包括4个纲ALPHAPROTEOBACTERIA、GAMMAPROTEOBACTERIA、DELTAPROTEOPROTEOBACTERIA、E
37、PSILONPROTEOBACTERIA）6个科10个种，其中ALPHAPROTEOBACTERIA和GAMMAPROTEOBACTERIA中的克隆数量相同，均有8个，均占克隆总数的86。BACTEROIDETES包括2个纲3个科6个种，其中UNCLASSIFIEDSAPROSPIRACEAE属的UNCULTUREDBACTERIUM、UNCLASSIFIEDFLAVOBACTERIACEAE属的UNCULTUREDBACTERIUM克隆数量较多，分别有11、8个，占该纲克隆数的458、333，占克隆总数的118、86。表68月份三疣梭子蟹养殖塘水样克隆文库细菌群落组成的演替TAB6SUCCE
38、SSIONOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESOFPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDINAUGUST12门/纲目/科属/种代表克隆登录号16SRDNA相似性克隆数ACTINOBACTERIAACTINOBACTERIDAE/ACTINOMYCETALESUNCLASSIFIEDACTINOMYCETALES/UNCULTUREDBACTERIUMB103EU592404992UNCLASSIFIEDACTINOMYCETALES/UNCULTUREDACTINOBACTERIUMB58AJ57552210021ACTIN
39、OBACTERIAUNCLASSIFIEDACTINOBACTERIA/UNCULTUREDBACTERIUMB54DQ520190991CYANOBACTERIA/CYANOBACTERIAFAMILYIGPI/UNCULTUREDANABAENASPB16EU4023971003FAMILYIIGPIIA/SYNECHOCOCCUSSPB67AB05822610011GPIIA/UNIDENTIFIEDBACTERIUMB98AY3444311001CHLOROPLASTCHLOROPHYTA/UNCULTUREDPHOTOTROPHICEUKARYOTEB3AY8620089910PRO
40、TEOBACTERIA/ALPHAPROTEOBACTERIARHODOBACTERALES/RHODOBACTERACEAEOCEANICOLAGRANULOSUSB46DQ915616911UNCLASSIFIEDRHODOBACTERACEAE/RHODOBACTERALESBACTERIUMB63FJ869046992UNCLASSIFIEDRHODOBACTERACEAE/UNCULTUREDALPHAPROTEOBACTERIUMB47EF471669993YANGIAPACIFICAB68AJ877265961ROSEICYCLUSMAHONEYENSISB139AJ315682
41、981续表门/纲目/科属/种代表克隆登录号16SRDNA相似性克隆数P/GAMMAPROTEOBACTERIAOCEANOSPIRILLALES/HALOMONADACEAEHALOMONASSPB61AM945678993O/ALCANIVORACEAEALCANIVORAX/UNCULTUREDGAMMAPROTEOBACTERIUMB83FM242201100113UNCLASSIFIEDGAMMAPROTEOBACTERIAUNCULTUREDGAMMAPROTEOBACTERIUMB44FJ744938994P/DELTAPROTEOBACTERIAUNCLASSIFIEDDELTA
42、PROTEOBACTERIAUNCULTUREDBACTERIUMB65FJ1550321003P/EPSILONPROTEOBACTERIACAMPYLOBACTERALES/HELICOBACTERACEAESULFURIMONAS/UNCULTUREDBACTERIUMB52EF379628951BACTEROIDETES/FLAVOBACTERIAFLAVOBACTERIALES/FLAVOBACTERIACEAEUNCLASSIFIEDFLAVOBACTERIACEAE/UNCULTUREDBACTERIUMB94EU592335998PSYCHROSERPENS/UNCULTURE
43、DBACTERIUMB100EF574469981B/SPHINGOBACTERIASPHINGOBACTERIALES/CRENOTRICHACEAEBALNEOLA/UNCULTUREDBACTERIUMB45EU592350981B/UNCULTUREDBACTEROIDETESBACTERIUMB28EF471452951S/SAPROSPIRACEAEUNCLASSIFIEDSAPROSPIRACEAE/UNCULTUREDBACTERIUMB57FJ15506310011HALISCOMENOBACTER/UNCULTUREDBACTEROIDETESBACTERIUMB26EF4
44、71455962总数9314图28月份三疣梭子蟹养殖塘水样克隆文库细菌的16SRDNA序列构建的系统发育树FIG2DENDRGRAMFORCLONELIBRARIESBACTERIABASEDONPARTIAL16SRRNAGENESEQUENCESOFWATERSAMPLESOFPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDINAUGUST3316SRDNA克隆文库的多样性分析近年来，很多人研究水体环境中的微生物多样性，但发现对于同种环境样品所采用的研究方法不同，获得的结果也存在很大差异23，特别是采用不同的采样方法会对实验结果造成重大的影响24，目前各种分子方法用于微
45、生物多样性研究时各有利弊，仍然无法分辨出各种方法的偏好性及准确性。方法学的差异局限性远远不如样品本身的差异和数据分析来的重要25。在本论文中，我们选择了构建16SRDNA文库的方法来研究三疣梭子蟹养殖塘水体中的微生物多样性，对于两次样品，我们尽可能在相同的实验条件下使用相同的实验方法对其进行处理，从而使操作中的误差降到最低。以一个月为时间间隔，我们分别构建了七月份A文库）和八月份B文库）两个克隆文库。本次实验选取两个养殖时期的水样作为代表，分别构建16SRDNA克隆文库。结果如表35所示。A文库中，38个序列为有效序列，共有10个OTU，分属于5个门，经计算，该文库的覆盖率C为74，多样15性
46、指数为1382，EVENNESSINDEXJ为0665，SIMPSONINDEXD为0840。该文库中，蓝细菌门（CYANOBACTERIA）、厚壁菌门（FIRMICUTES）和变形菌门（PROTEOBACTERIA）较为丰富，分别占该文库中克隆总数的523、263和158。另外，放线菌门（ACIDOBACTERIA）和CFB类群（即CYTOPHAGAFLAVOBACTERIUMBACTEROIDES类群）的细菌也出现，但是比例很小，均为26。B文库中，93个序列为有效序列，共有18个OTU，分属于4个门，经计算，该文库的覆盖率C为80，多样性指数为1634，EVENNESSINDEXJ为03
47、55，SIMPSONINDEXD为0221。该文库中，蓝细菌门（CYANOBACTERIA）、放线菌门（ACIDOBACTERIA）、CFB类群和变形菌门（PROTEOBACTERIA）的细菌分布较为平均，分别占该文库中克隆总数的269、258、258和215。表7不同养殖时期水样的16SRDNA克隆文库TAB7THE16SRDNALIBRARYOFDIFFERENTWATERBREEDINGPERIOD文库取样时间克隆数目覆盖率（）多样性指数（SHANNONWIENER）EVENNESSINDEXJSIMPSONINDEXDA文库7月12日3874138206650840B文库8月1日938
48、0163403550221从多样性指数计算结果可知，A文库的SHANNONWIENER指数H较低于B文库，但EVENNESS指数J和SIMPSON指数D都高于B文库，说明与A文库比较，B文库物种多样性增加，均匀度提高，导致种群结构的稳定程度增加，但种类的优势度降低。在A和B文库中，归属于蓝细菌门（CYANOBACTERIA）的细菌始终占有优势，放线菌门（ACIDOBACTERIA）、变形菌门（PROTEOBACTERIA）和CFB类群的细菌均有所增加，而厚壁菌门（FIRMICUTES）的细菌减少，而且厚壁菌门只在七月份出现。养殖塘中细菌的群落具有独特的组成和结构，既包括海洋微生物（如变形菌纲和
49、蓝细菌门的细菌26,27），也包括一些陆源或淡水微生物28,29（如放线菌门的细菌）。另外，归属于放线菌门ACTINOBACTERIA）的细菌和归属于拟杆菌门BACTEROIDETES）的细菌在A文库中均只有1株，但在B文库中均增加到24株，在B文库的群落中占有很大比例，为B文库的第二有势纲。通过两个文库的比较，我们可以发现在不同养殖阶段微生物的群落结构发生了演替现象。放线菌门被认为是典型的陆源微生物，主要分布于土壤环境，也有研究显示，放线菌类在淡水环境中也普遍存在30，但有关海水养殖环境中放线菌的报道却相对较少，而我们的研究结果显示，在B文库中，放线菌类所占的比例超过了20，表明海水养殖塘中微生物具有独特的群落组成。4小结1两个文库中共包括131条有效序列，分属于5个门变形菌门PROTEOBACTERIA）、蓝细菌门CYANOBACTERIA）、放线菌门ACTINOBACTERIA）、CFB类群CYTOPHAGAFLAVOBACTERIUMBACTEROIDES）以及厚壁菌门FIRMICUTES）。其中，蓝细菌门、放线菌门和CFB类群的细菌为优势类群。以一个月为时
