1、 本科毕业论文 （ 20 届） 一株产淀粉酶海洋放线菌的分离与鉴定 所在学院 专业班级 生物科学 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 目录 摘要 .I Abstract . II 引言 . 1 1 材料与方法 . 2 1.1 材料 . 2 1.1.1 仪器与设备 . 2 1.1.2 药品与试剂 . 2 1.2 实验方法 . 3 1.2.1 制备培养基 . 3 1.2.2 样品采集和菌株分离 . 4 1.2.3 菌株形态学鉴定 . 4 1.2.4 菌株的生理生化鉴定 . 4 1.2.5 16S rDNA 分子鉴定 . 5 2 实验结果与分析 . 8 2.1 菌株形态学鉴定结果 .
2、8 2.2 菌株生理生化鉴定结果 . 9 2.3 16SrDNA . 9 3 讨论 . 12 3.1 相关菌种分离方法的选择 . 12 3.2 有关菌种鉴定方法的选择 . 12 3.3 鉴定结果分析 . 13 参考文献 . 14 附译文 .错误 !未定义书签。 致谢 .错误 !未定义书签。 I 摘要 确定 1 株从海泥、海藻中分离到产淀粉酶的 菌株的种属分类地位，为以后进一步的研究与应用提供依据。将从不同地方采集来的样品经稀释后，采用涂布平板法和平板划线法进行分离。并通过不同培养基筛选出产淀粉酶的放线菌。将分离到的放线菌进行革兰氏染色、平板插片法等形态学鉴定，生理生化特征及碳源利用，采用分子生
3、物学方法对该菌株的 16S rDNA 进行 PCR 扩增、测序 ， 利用相关软件对 PCR 产物序列进行分析。结果从浙江舟山沿海海泥、海藻中分离得到产淀粉酶放线菌菌株 43 株，其中产淀粉酶能力较高者 3 株， A19 为 革兰氏阳性菌，菌体有基内菌丝和气生菌丝或孢子丝，多分支，长而直 ，单生。形态学鉴定结果该菌为链霉菌属的一个种，碳源利用实验证明是自养型。经形态、生理生化鉴定及 16SrDNA 的系统发育学分析结果表明 A19 菌株为Streptomyces macrosporeus A19， GenBank 登录号为 GU184336。 关键词 放线菌；淀粉酶； 分离；鉴定 II Abst
4、ract To determine a from the mud, algae isolated from strains producing amylase taxonomic status of species, for the future to further provide the basis for research and application.Collected from different parts of the sample was diluted to using spread plate method and the streak plate method to b
5、e separated. Produced by different media amylase screening actinomycetes. The actinomycetes isolated from the Gram stain, flat inserts law morphological identification, physiological characteristics and carbon utilization, the use of molecular biological methods to the strains of 16S rDNA PCR, seque
6、ncing, use of relevant software sequence analysis of PCR products. Results from the mud along the coast of Zhoushan, algae producing amylase isolated strains of 43 strains of actinomycetes, including ability to produce higher amylase 3, A19 for the Gram-positive bacteria, a substrate mycelium biomas
7、s raw gas hyphae or spores wire, multi-branch, long and straight, single students. Morphological identification of bacteria as a result of a Streptomyces species, carbon source utilization experiments proved to be autotrophic. Morphological, physiological and biochemical identification and phylogene
8、tic analysis 16SrDNA results show that the A19 strain of streptomyces macrosporeus strain A19, GenBank accession number is GU184336. Key words： Actinomycetes; Amylase; separation; identification 1 引言 淀粉酶是能够催化淀粉水解转化成葡萄糖、麦芽糖及其它低聚糖的一群酶的总称，它广泛存在于动植物和微生物中。如今淀粉酶在酶市场销售中占据了约 25%的比例。它在制糖，纺织、造纸、发酵、烘烤、蒸馏等工业中发挥
9、着重要的作用，此外它也可作为促消化剂运用于食品、医药工业。 淀粉酶的巨大潜力使其在当今社会中需求量日益提高。因此，如何获得高产量、高活性的淀粉酶显得至关重要。前人对产淀粉酶菌株的研究已有很多，但多局限于细菌，且以陆地土壤为主要来源。例如芽孢杆菌属的生产嗜热酯肪芽孢杆菌、 Bacillus candolyticus、 凝结芽孢杆菌等，也有一些是来自于中度嗜盐真细菌，例如不动杆菌属，Micrococcus halobius,以及酵母菌中 Cryptococcus flavus 和 Halomonas meridiana， 但对于来源于海洋的产淀粉酶的放线菌的研究却很少。 放线菌的细胞结构与细菌相似
10、，是革兰氏阳性细菌中形态分化最复杂的一类微生物，经典放线菌具有发育良好的放射状菌丝体。根据菌丝的形态与功能可分为基内菌丝和气生菌丝，有些形成孢子、孢子链和包囊及包囊孢子等复杂的形态结构。基内菌丝的生长及断 裂方式、孢子的着生部位、孢子数的多寡、孢子表面结构、包囊形状、包囊孢子有无鞭毛的形态特征均是放线菌分类的重要形态学指征。 分子系统学是通过检测生物大分 子（以核酸和蛋白质为主）所包含的遗传信息，定量描述、分析这些信息在分类、系统发育和进化上的意义，从而在分子水平上解释生物的多样性、系统发育及进化规律的一门学科 2。 20 世纪 70 年代末， Woese 等以 16S rRNA、 18SrR
11、NA 序列为研究对象，提出了三域学说。对于原核生物来说， 16S rRNA是目前研究分子系统学最好的材料，是最古老的分子之一，同生物的 16S rRNA有利于研究生物的发生及其分歧年代。作为蛋白质合成的场所， 16S rRNA 广泛存在于真核和原核生物的细胞中；分子长度为 1.5kb， 相比其他分子，既保证了较大的信息量，又便于扩增和测序；由于具有强烈的功能制约， 16S rRNA 是保守的分子，只有 16S rRNA的保守性才能保证蛋白质合成的相对稳定性；但保守性并不意味着不变，这种保守是相对的，有的区段保守性高，有的区段变化很大，这种保守又变化、总体保守局部变化的特性显示了生物界的共性和特
12、异，这正好适于系统进化。 本研究旨在从浙江舟山附近海域进行多层次取 样，筛选出产淀粉酶能力较强且通过选育手段可使其产酶能力提高较多的放线菌，并从形态、生理生化和分子水平上对目的菌株进行鉴定 3。 2 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 仪器与设备 冷冻离心机 Eppendorf 5417R 为艾本德中国有限公司生产、高速冷冻离心机CF16RXII 和显微镜为日立公司生产、 LGJ-10B 冷冻干燥机为北京四环科学仪器厂有限公司生产、梯度 PCR仪为 Whatman Biometra 生产、 DYY-6C 型电泳仪为北京六一仪器厂生产、 JY92-II 超声波细胞粉碎机为宁波新芝生物科技股
13、份有限公司产、 SSW 型 微电脑电热恒温水槽为上海博讯实业有限公司医疗设备厂生产、 YXQ-LS-50A 型压力蒸汽灭菌锅由上海云泰仪器仪表有限公司生产， HHS 型电热恒温水浴锅由上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产、 凝胶成像系统由伯乐公司生产、 722S 型分光光度计为上海精密科学仪器有限公司生产、细菌基因组 DNA 提取试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司生产 、 PCR 扩增试剂盒为上海生物工程有限公司生产、 3S 柱离心式琼脂糖 DNA小量快速纯化试剂盒和 PCR 产物胶回收试剂盒为上海博彩生物科技有限公司生产、pMD19-T 质粒为大连宝生物工程有限公司 生产、 PCR 扩增引物
14、由上海英潍捷基贸易有限公司生产。 此外还有锥形瓶（容量 200mL， 250mL， 500mL 中国医药（集团）上海化学试剂公司）、烧杯（容量 50mL， 100mL， 500mL， 1000mL，国药集团化学试剂有限公司）、量筒（容量 50mL， 100mL， 500mL 中国医药（集团）上海化学试剂公司）、微型离心机 （ Qspin BAYGENE） 、干燥箱（ PH070A 型，上海 -恒科学仪器有限公司）、超净工作台（ SB JC IA 型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、电子天平（ BS124S 型，塞多利斯科学仪器 (北京 )有限公司）、超纯水器（ DPWS-T-20L/H 型，
15、杭州永洁达净化科技有限公司）、恒温培养箱（上海恒科学仪器有限公司）。 1.1.2 药品与试剂 革兰氏染色试剂盒， 格里斯氏试剂，卢哥氏碘液，二苯胺试剂，可溶性淀粉，蛋白胨，酵母浸膏，琼脂， 酪 蛋白， 蛋白胨，酵母粉， 柠檬酸铁 ， 曲利酚蓝，陈海水，燕麦粉浸液，适量盐溶液，蒸馏水，天门冬素，牛肉膏，麦芽精，蔗糖，明胶，脱脂鲜牛奶， 甘油，天冬门素， 大豆蛋白胨， 木糖，葡萄糖，阿拉伯糖 ， L-鼠李糖 ， 麦芽糖 ， 甘露糖 ， 肌醇 ， 山梨醇 ， 乳糖， K2HPO4， KH2PO4 ， NaCl， KNO3， MgSO47H2O，FeSO4， MgSO4， （ NH4） 2SO4， C
16、aCO3， FeSO47H2O， MnCl27H2O， ZnSO47H2O，0.1mol L HCl， 0.1mol L NaOH . 3 1.2 实验方法 1.2.1 制备培养基 1） 高氏 1 号琼脂培养基：可溶性淀粉 2.0%、 K2HPO40.05%、 NaCl0.05%、KNO30.1%、 MgSO47H2O 0.05% 、 FeSO4 0.001%、琼脂 1.5%-2.0%、 PH 7.2-7.4 2） LB 培养基： 蛋白胨 10g/L，酵母浸膏 5g/L， NaCl 10g/L，琼脂 15g。 3） 曲利酚蓝平板培养基：可溶性淀粉 20.0g， 蛋白胨 20.0g， 酵母粉 1
17、0.0g， 曲利酚蓝溶液 （ 1.0%） 10ml， 琼脂 20.0g，陈海水 1000ml。 4） 发酵培养基：可溶性淀粉 20g/L,蛋白胨 20g/L，酵母粉 10g/L，陈海水 1L， PH自然 3,6 5） 燕麦汁培养基：燕麦粉浸液 20.0g， 琼脂 18.0g，适量盐溶液 1ml， 蒸馏水1000.0ml， PH7.2 6) 甘 油 天冬 门 素 培养 基 :甘油 20.0g ， 天 冬 门素 1.0g ， K2HPO41.0g ，FeSO47H2O0.2g 7) 葡糖天门 冬素琼脂培养基 :葡萄糖 1.0%、天门冬素 0.05%、 牛肉膏 0.2%、K2HPO40.05%、琼脂
18、 2.0%、 PH 6.8 8) 酵母粉麦芽精琼脂培养基 :酵母粉 10.0g，麦芽精 10.0g， 葡萄糖 4.0g， 琼脂20.0g， 蒸馏水 1000.0ml， PH7.0 9) 蔗糖硝酸盐琼脂培养基 :蔗糖 50g， KNO3 0.2g， 琼脂 15-20g， 蒸馏水 1000ml 10)无机盐淀粉培养基 :可溶性淀粉 10.0g， K2HPO41.0g， MgSO4 1.0g， NaCl1.0g，（ NH4） 2SO42.0g， CaCO32.0g， FeSO47H2O 0.001g， MnCl27H2O 0.001g， ZnSO47H2O 0.001g， PH 7.0-7.4 11
19、)明胶液化培养基 :蛋白胨 0.5%， 葡萄糖 2.0%， 明胶 20.0%， PH 7.0 12)牛奶凝固胨化培养基 :脱脂鲜牛奶 1000mL， CaCO3 0.02g 13)黑色素产生培养基 :可溶性淀粉 10.0g， 酪 蛋白 1.0g， K2HPO40.5g， 陈海水1000.0ml 14)碳源利用培养基 :（ NH4） SO4 0.5%， KH2PO4 0.1%， MgSO4 0.05%， 酵母膏0.02%， 琼脂 2%， 木糖、葡萄糖等 碳源 0.5%5 15)完全培养基 :牛肉膏 0.3%， 蛋白胨 1%， NaCl0.5%， 琼脂 2%， PH 7.47.8 16)高渗培养基
20、 :大豆蛋白胨 10.0g， 葡萄糖 210.0g， 酵母浸膏 1.0g， 蔗糖 300.0g，琼脂 16.0g， PH7.0 4 17） Tresner 培养基：蛋白胨 10.0g，柠檬酸铁 0.5g，蒸馏水 1000.0ml，琼脂 18g，PH 7.2 1.2.2 样品采集和菌株分离 分别从舟山东极岛、海滨公园、鸭蛋山码头采集海泥、海水、海草等样品，采用稀释平板涂布法，分别称取样品 5g 加入盛有 45ml 灭菌水的三角瓶中，充分振荡，制成10-1 样品浓度悬浮液。待土粒沉淀后，吸取 1.0ml 上清液，移入盛有 9ml 灭菌水的试管中制成 10-2 样品浓度悬浮液。依此类推，制成 10-
21、3、 10-4 和 10-5 样品浓度悬浮液吸取上述 5 种浓度悬浮液 1ml，加到分离培养基上，用灭菌涂布棒涂匀。将上述接种好的培养皿倒置于 28 恒温培养箱中培养 3-4d6。待菌落长出后，挑取不同菌落形态的菌株接种于高氏 1 号培养基上 3,8,划线分离纯化，得到各个放线菌菌株的纯培养物，保存。利用定性培养基（ 一种是加曲利酚蓝的，另一种是未加曲利酚蓝的 产淀粉酶鉴定培养基 ）接种培养后根据产生水解圈情况，去掉不产淀粉酶的菌株。根据水解圈的大小及酶的活力的高低，初步确定目的菌株。 1.2.3 菌株形态学鉴定 1.2.3.1 形态特征和培养特征的观察 采用平板插片法在光学显微镜下观察目的菌
22、株的形态特征，包括菌丝、孢子丝、孢子产生的时间，以及它们的着生方式和形态特征。观察试验菌在形态学鉴定培养基上的生长情况，例如基内菌丝、气生菌丝的颜色及分布情况以及可溶性色素的有无及颜色。 1.2.3.2 革兰氏染色 将目的菌株涂片经火焰固定，加结晶紫溶液染 1min， 用清水 冲去染液；然后加碘液染色 1min， 水洗；之后再加脱色液，不时摇动玻片 10-30s， 至紫色脱落为止，水洗；最后加复染液，染 1min， 水洗；将玻片晾干后油镜镜检。并在显微镜下观察菌体的形态特征 4 1.2.4 菌株的生理生化鉴定 按照伯杰系统鉴定手册及微生物实验手册进行。 生理生化特征主要通过观察试验菌在明胶液化
23、培养基、牛奶凝固胨化培养基、黑色素产生培养基、 H2S 产生培养基、纤维素生长培养基、硝酸盐还原等培养基上的生长情况及现象。碳源利用主要是通过测定其对木糖、阿拉伯糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、 肌醇、山梨醇、乳糖、果糖、 L-鼠李糖等糖的利用情况来判断其碳源的利用情况。 5 1.2.4.1 明胶液化 将菌种接种于明胶培养基表面， 28下培养，分别在 5d、 10d、 15d 观察其液化程度，观察前将试管冷却 20-30min，再观察，若不液化仍成固体，若有液体出现即认为已经液化。 1.2.4.2 淀粉水解 菌种接种于淀粉水解的平板， 28培养，待菌落长成后，在平板上滴加卢哥氏碘液。若菌落周
24、围出现透明圈，表明菌株产生淀粉酶水解淀粉，透明圈的大小代表淀粉酶活性的强弱。若菌落周围被染成蓝色，不出现透明圈，则表明菌株不产 生淀粉酶。 1.2.4.3 牛奶凝固 将菌种接种于牛奶凝固陈化的培养基， 28 培养，以未接种的牛奶培养基为空白对照，与 5d、 10d、 15d 观察，若有凝块产生，则为凝固现象，表明该菌株产生凝乳酶能使蛋白质凝固。若培养基被水解成透明或半透明的液体则为牛奶冻化，表明该菌株产生了蛋白酶是蛋白冻化。 1.2.4.4 黑色素产生 将菌种接种于能产生黑色素的培养基， 28培养，观察菌落周围是否有黑色素生成。若出现黑色素为阳性，表明该菌株能产生 酪氨酸 酶，反之为阴性。 1
25、.2.4.5 硝酸盐还原 将菌种接种于硝酸盐还原培养基， 28培养 7-14d 后测定活性。取少许培养液分别加入格里斯氏试剂 A、 B 各一滴，呈红色则为阳性，若不变红则可加 1-2 滴二苯胺试剂，若呈蓝色则为阴性，不呈蓝色为阳性 7 1.2.4.6 纤维素分解 将滤纸条一端没在液体培养基中，灭菌后，将菌种菌种接种于液面以上的滤纸条上，一段时间后观察滤纸条是否被分解。 1.2.4.7 H2S 产生 将菌种接种于 Tresner 平板中， 28培养 7-14d，以未接种的作为对照，如果有黑色素说明能产生 H2S，反之不产生 7 1.2.5 16S rDNA 分子鉴定 1.2.5.1 菌株基因组总
26、 DNA的提取及回收 利用细菌基因组 DNA提取试剂盒提取目的菌株的基因组。提取过程如下： 1、 将菌株接种于发酵培养基中， 28 ,180r/min摇床发酵 5-10d。 2、 发酵菌液 1.5ml， 10000-11500rpm离心 1min，尽量吸净上清液。 6 3、 加入 180L缓冲液， 37 孵育 1h，每 15min翻转混匀一次。 4、 向离心管中加入 20L蛋白酶 K（ 20mg/ml）溶液混匀，再加 22L20 SDS充分混匀， 37孵育 30-60min。 5、 加入 220L缓冲液 GB，振荡 15s。在 70水浴 10min，溶液应变清亮时离心去除管盖内壁的水珠。 6、
27、 加入 220L无水乙醇，充分振荡 15s，可能会出现絮状沉淀，离心去除管盖内壁的水珠。 7、 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3中， 12000rpm离心 30s，倒掉废液，将吸附柱 CB3放入收集管中。 8、 向吸附柱 CB3中加入 500L缓冲液 GD，重复上步。 9、 向吸附柱 CB3中加入 700L漂洗液 PW，重复上步。 10、 向吸附柱 CB3中加入 500L漂洗液 PW， 12000rpm离心 30s， 倒掉废液，将吸附柱 CB3放入收集管中。 11、 将吸附柱 CB3放回收集管中， 12000rpm离心 2min，倒掉废液，将 吸附柱 CB3开盖置于室温放置数
28、分钟，以彻底晒干吸附材料中残余的漂洗液。 12、 将吸附柱 CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位悬空加入 50-200L洗脱液 TE，室温放置 2-5min， 12000rpm离心 2min。 将溶液收集到离心管中 8. 采用 16SrDNA通用引物，在适当的反应体系及条件下进行 PCR扩增， 并通过通用引物 27f5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-31504r5AAGGAGGTG ATCCAGCCG CA-3对 A19株菌进行 PCR扩增（ 50L扩增体系为 :5ul的 10xTaqBuffer,4ul2mM/LdNTP,1u的2.5U/L的 Taq酶 ,10uM/L的
29、 27f、 1504r引物各 1L， 4L的模板 DNA,34L的 ddH2O。扩增程序为： 95 预变性 10min， 95 变性 1min， 55 退火 1min， 72 延伸 1min，进行 30个循环， 72 延伸 10min）， 转化、克隆 ，将克隆产物送交公司进行 16SrDNA测序。完成系统建树后注册登录号。 扩增结束后进行电泳检测。确定成功后用 PCR胶回收试剂盒对扩增产物进行胶回收。操作过程如下： 1、通过琼脂糖凝胶电泳，将目的 DNA片段 与其他 DNA尽可能分开，用干净手术刀割下需回收的琼脂块，放入 1.5ml离心管中，在紫外光照射的时间尽可能短。 2、按 Binding Buffer与琼脂糖凝胶为 400L/100mg，置于 50-60水浴中 10min，加热融胶时，每 2min混匀一次，使胶彻底融化。 3、将融化的胶溶液转移到放于收集管内的 UNIQ-10柱中，室温放置 2min后
