1、生物化工学院学业作品题目蝴蝶兰组培快繁褐变防治对策姓名张学号201201041112专业园林技术指导教师姚职称讲师中国黄冈二一四年十一月黄冈职业技术学院学业作品目录摘要1ABSTRACT11蝴蝶兰的生态习性32蝴蝶兰的快速繁殖技术321茎尖培养322叶片培养323花梗腋芽培养324根尖培养325原球茎的继代培养与育苗33蝴蝶兰褐变产生的影响因素331植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型432外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同433培养基成分434培养条件44防止外植体产生褐变的对策441适当外植体的选择442对外植体的处理443适宜的培养基4431适当的无机盐浓度5432适当和
2、适量的激素5433培养基的硬度5434培养基中水的硬度5435培养基的PH值5436培养条件544添加褐变抑制剂和吸附剂55总结5参考文献6黄冈职业技术学院学业作品第1页共6页蝴蝶兰组培快繁褐变防治对策摘要被誉为“洋兰王后”的蝴蝶兰，几年来一直都处于花卉销售的首位，一直受到花迷们的青睐。但目前由于专业性培育蝴蝶兰的整体水品不是很高，关键的生产环节技术薄弱，造成蝴蝶兰生产成本较高繁殖系数偏低，工业化生产效率不高。因此建立和完善蝴蝶兰组培快繁技术是解决这一问题的关键环节本文针对植物组织培养中常见的褐变现象,详细地分析了其产生的机理及影响因素,并提出了相应的对策,为科研和生产提供了一定的理论和实践依
3、据。关键词蝴蝶兰；组培快繁技术；培养；褐变ABSTRACTKNOWNASTHE“QUEENOFPHALAENOPSISORCHID“INTAIWAN,INRECENTYEARSHASBEENINTHEFLOWERSALESFIRST,HASBEENTHESUBJECTOFFLOWERFANSFAVORBUTBECAUSEOFTHECURRENTOVERALLQUALITYOFPROFESSIONALCULTIVATIONOFPHALAENOPSISINTAIWANISNOTVERYHIGH,PRODUCTIONTECHNOLOGYOFTHEKEYLINKISWEAK,RESULTINGINLO
4、WERTAIWANPHALAENOPSISPRODUCTIONCOSTHIGHPROPAGATIONCOEFFICIENT,PRODUCTIONEFFICIENCYISNOTHIGHTHEREFORE,THEESTABLISHMENTANDIMPROVEMENTOFTAIWANPHALAENOPSISTISSUECULTUREANDRAPIDPROPAGATIONTECHNOLOGYISTHEKEYTOSOLVETHISPROBLEMINTHISPAPER,THEBROWNINGPHENOMENONINPLANTTISSUECULTUREOFCOMMON,ADETAILEDANALYSISOF
5、THEGENERATINGMECHANISMANDTHEINFLUENCEFACTORS,ANDPUTFORWARDTHECORRESPONDINGCOUNTERMEASURES,ANDPROVIDESSOMETHEORETICALANDPRACTICALBASISFORTHESCIENTIFICRESEARCHANDPRODUCTIONTOMENTIONKEYWORDSPHALAENOPSISTECHNIQUEOFTISSUECULTUREANDRAPIDPROPAGATIONCULTUREBROWNING黄冈职业技术学院学业作品第2页共6页前言近年来，随着人民物质文化生活的提高和东西方文化
6、交流的加强，蝴蝶兰更是受到人们的喜爱。近几年来除了盆花，还大量被用作切花材料，切花中除我们常见的插花用途之外，还是制作胸花的好材料，在开会庆典场合备受瞩目，至于用来制作新娘捧花，也是目前国内流行的新风潮，深受广大消费者的好评，这就使得高品质的蝴蝶兰需求量逐年增加。但由于生产技术的薄弱，使得蝴蝶兰及其它名贵品种短缺，品质较低，销售价格较高。于是，将植物的组织培养技术用在了蝴蝶兰的生产上。在这方面研究较多的是用胚、幼叶、茎尖和根尖、花梗腋芽等多种器官为外植体进行组织培养研究，由于所选外植体材料各异，难度也有高低，虽然有些技术已经用于大规模工厂化生产，但依旧面临一些困难，有待于进一步探索和完善。根据
7、目前蝴蝶兰的发展状况，本文将着重从蝴蝶兰的快速繁殖技术方面介绍了蝴蝶兰的组织培养技术，以及组培生产过程中常见问题之一褐变现象及解决方法，促进了蝴蝶兰组培的工厂化生产。黄冈职业技术学院学业作品第3页共6页1蝴蝶兰的生态习性喜高温、高湿、半阴、通风环境，越冬温度不低于18度。由于蝴蝶兰出生于热带雨林地区，本性喜暖畏寒。生长适温为1520，冬季10C以下就会停止生长，低于5容易死亡。蝴蝶兰的气根颇多，其根尖翠绿，相当敏感，要细心加以保护，切不可触动损伤，否则，就好像打坏了人的嘴巴，要正常进食就困难了。蝴蝶兰喜欢潮湿和半阴的环境，要求空间经常保持湿度5070，盆内不能淋水过多。在夏秋季节不能让阳光直射
8、。但早上的朝阳对它生长最好，应充分加以利用。如果春季阴雨天过多，晚上要用光管给它增加光照，以利日后开花。2蝴蝶兰的快速繁殖技术21茎尖培养将除去叶的茎用流水冲洗干净，再用10的漂白粉表面消毒15MIN，除去叶原基后，用5漂白粉用业灭菌10MIN,用无菌水冲洗干净。在无菌条件下将茎尖及叶基部腋芽切成大小约23MM的方块，进行接种。22叶片培养取试管实生苗片尾外植体，实生苗年龄以34个月为最好，其诱导率及每个外植体上的原球增殖的个数最高。对于120D的小苗，可将整叶切下直接插入培养基中，效果比将叶切断好。并且取自第1叶的外植体，原球茎形成率较老叶好；将幼叶骗切断进行培养时，中间部分原球茎形成率比顶
9、部和基部好；成年植株用叶片基部好；切断大小与诱导率直接相关，切断太小成活率低，以050CM左右为最好。原球茎的诱导培养基选用。23花梗腋芽培养另一种培养方式是不切下腋芽，取带腋芽的花梗先进行消毒，将消毒后的芽接种到卡特兰属1号培养基上并在培养基中加入10的香蕉匀浆。也可用VW液体培养基震荡培养一段时间后，产生原球茎，进行切割转移、取带腋芽的花梗节。消毒后直接插入培养基上，接种7天后，侧芽膨大并向外伸长。24根尖培养将150天实生苗根尖培养在附加肌醇100MG/L、烟酸1MG/L、VB6MG/L、VB110MG/L、蔗糖30G/L,PH55的B5培养基上，或以30转/MIN的转速液体震荡培养，培
10、养温度5，光强2000LX每天光照12H，结果光培养与暗培养的诱导率差异不大，KT10MG/L和NAA5MG/L的激素配比诱导率最高达70。原球茎的增殖在同样的培养基上，6个月后可形成幼苗。25原球茎的继代培养与育苗接种后12个月培养的茎尖即可形成原球茎球状体，以后即发芽生根长叶。应在其发芽前把它切成小块进行转移，让它继续不断地形成原球茎球状体。这样连续的进行继代培养，短时间可以得到大量的原球茎球状体。继代培养基可选用诱导培养基，可适当加人某些附加物质及调整激素含量以促进原球茎的生长。育苗时用培养基可选用继代培养基，加入一定量复合添加物质促进小植株的发育，如香蕉匀浆或椰乳，也可加人少量的维生素
11、，促进根的生长。进行球茎增殖时，将需要转移的球茎切成几小块，转人新培养基进行增殖培养，培养一段时间后，再进行切割转移，通过这种方式原球茎成倍增长。不需继代的原球茎在继代培养基或育苗培养基上分化出芽，并逐渐发育成丛生小植株，切开丛生小植株，转人育苗培养基上，不久小植株生根，等长到一定大小时可移人温室。切离丛生小植株时，基部未分化的原球茎及刚分化的小芽不要丢弃，收集起来植人另一育苗培养基中，作为种苗。异端时间后将长大的种苗挑出，种植，小苗和原球茎可继续增殖分化。这样既能得到大量的种苗，又能得到大量的不断分化的试管苗。3蝴蝶兰褐变产生的影响因素黄冈职业技术学院学业作品第4页共6页影响植物组织培养褐变
12、的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。31植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶PPO活性的差异有关。32外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。33培养基成分培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其PH值也与褐变程度有较大关系。34培养条件温度过
13、高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素1。4防止外植体产生褐变的对策从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制一是除去引起氧化的物质氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。41适当外植体的选择除培养基成分外，决定蝴蝶兰组培成败的另一个重要因素就是外植体的来源。虽然从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，因此任何器官、任何组织，都可以作为外植体。但实际上，蝴蝶兰的不同器官之间的分化能力有巨大差别，因此选择合适的外植体就显得尤为重要。蝴蝶兰的组培外植体主要有
14、叶片、花梗腋芽、花梗节间、茎尖、根尖等，其中花梗腋芽是蝴蝶兰组培的最佳外植体，也是目前利用最广泛的。在选择外植体时，应先选择生长健壮、无病虫害、不变异的母株。在采取外植体前，对母株进行采前预处理（在采前57天，用杀菌剂喷洒母株），可有效预防和降低内源性污染，提高诱导的成功率。外植体的最佳成熟度叶片叶龄35天花梗腋芽第一朵花现蕾时茎尖或根尖无菌苗或株龄40天内的植株42对外植体的处理通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下外植体经流水冲洗后，在25的低温下处理1224小时，再用升汞或70的酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养57天，使组织中的酚类物质部
15、分渗入培养基中。取出外植体用01的漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，35天后再转移培养基23次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。用抗坏血酸预处理吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。43适宜的培养基黄冈职业技术学院学业作品第5页共6页培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。431适当的无机盐浓度在组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS大量元素减半和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。432适当和适量
16、的激素在组织培养过程中，培养基中添加1MG/LBA05MG/L2,4D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1MG/LBA1MG/L2,4D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。433培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。434培养基中水的硬度硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。435培养基的PH值在细胞培养中，PH值为4550时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白
17、色，而PH值为5560时，愈伤组织严重褐变。一般来说，酸性环境PH值为4550不利于褐变过程的发生。436培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度的二氧化碳也会促进褐变，其原因是环境中的二氧化碳向细胞内扩散，细胞内的碳酸根离子增多，碳酸根离子与细胞膜上的碳酸根离子结合，使有效碳酸根离子减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。44添加褐变抑制剂和吸附剂褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可
18、以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚12。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在细胞的培养基中，添加植酸PA，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的CU2结合，从而降低了其活力。常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在
19、培养基中加入14G/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响。而聚乙烯吡咯烷酮PVP是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变。5总结植物组织培养既是植物遗传工程的基础和关键环节之一，也是一种实用性极强的高新技术。通过学习植物组织培养技术我了解了了蝴蝶兰组织的常规问题和培养基成分，繁殖方法。在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分
20、离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组黄冈职业技术学院学业作品第6页共6页织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。学习了这门课程是我受益匪浅，对我以后进一步的学习以及以后的工作都有很大的帮助。参考文献1陈超；王桂兰；乔永旭；孙晓燕；蝴蝶兰无菌播种方法的比较研究北方园艺；2006年01期2杨美纯；周歧伟；许鸿源；蝴蝶兰的种子培养广西农业生物科学；2002年04期3范成五；
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