1、 微核形成与细胞周期关系的初步研究 摘要： 微核是真核生物细胞中的一种异常结构 ,他 是各种理化因子，如辐射、化学药 物 对分裂细胞作用的 结果 。 一般认为微核是起源于落后染色体与丧失着丝粒的断片，在有丝分裂末期形成。但是另一些实验则表明间期细胞也可形成微核。本课题通过体外培养人的外周血淋巴细胞，在细胞周期的特定时期注射环磷酰胺 20ug/ml， 观察淋巴细胞微核形成与细胞周期的关系 ;实验结果证实了 细胞周期的各时期都可能有微核形成。 关键词 ： 环磷酰胺 ； 淋巴细胞；细胞周期 ; 微核 2 Abstract:Micronucleus are the abnormal structure
2、, which usually are the result of all kinds of physical-chemically factors such as radiation， chemical medicine to mitotic cells. Micronucleus is generally believed that behind the origin and loss of centromere chromosome fragment, formed in late mitosis. However, while some other experiments on cel
3、ls that can form between the micronucleus. This topic through in vitro of peripheral blood lymphocyte, In the cell cycle of specific period 20ug/ml cyclophosphamide injection, Observe lymphocyte micronucleus formation and the cell cycle. The results confirmed the cell cycle may have different period
4、s micronucleus formation. Key Words: Cyclophosphamide; Lymphocytes; Cell cycle ； Micronucleus. 3 目 录 摘要 4 关键词 4 Abstract 4 Key words 5 1 . 选题背景 5 1.1 课题来源 5 1.2 国内外的相关研究 5 1.3 目的和意义 8 1.4 课题设计指导思想 8 2 . 方案论证 8 2.1 方案的设计原理 8 2.2 方案论证 9 3 . 材料与方法 10 3.1 材料与仪器 10 3.2 实验步骤 11 4 . 结果与讨论 14 4.1 实验结果 14 4.
5、2 结果与分析 17 4 5 . 结论与心得 17 5.1 结论 17 5.2 心得 17 参考文献 20 5 1 选题背景 1.1 课题来源 生命科学学院 王洪振老师 1.2 国内外的相关研究 1.2.1微核的研究状况 微核是指位于细胞浆中独立于主核的核小体，其染色同主核，但比主核淡，其直径小于主核 1 3，主要由外界损害因素 (生物、物理、化 学 )作用细胞后，导致细胞染色体丢失或断裂，从而在胞浆中形成 1 个或数个小核 1。因此，微核试验在对外来化合物 (如药品、食品添加剂、农药、化妆品、环境污染物等 )遗传毒性和职业暴露人群遗传损害监测和现场生态环境检测方面，在诊断和预防肝癌、食管癌、
6、肺癌等恶性肿瘤方面得到了大量的应用。微核试验最大的优点是经济、简单、快速，而国内外大量的对比试验研究，比较一致的看法是该方法在敏感性、特异性和准确性方面，与经典的染色体畸变分析方法基本相当 2。因而，特别适合作为大量化合物和现场人群初筛的实验方法。 微核试验创建于 20 世纪 70 年代中期 (1973 1975)3,4，目前许多国家和国际组织，已将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理安全性评价的必做实验 58。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展和渗透到微核研究中，大大拓展了微核试验的检测和应用范围，已发展成为能同时检测染色体断裂、丢失、分裂延迟、分裂不平衡、基因扩增、不分离、 DN
7、A 损伤修复障碍、 Hprt 基因突变、凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传学终点的检测，因而近年来国际上有人提出了新微核试验概念 9，从而大大拓展了微核试验的应用范围 10,11。当然，要 实现一个实验多个遗传损害终点的检测，需要更多的新的技术手段配合，如 FISH技术、图象分析技术等等，这也对我国的实验室条件和研究水平提出了更高的要求。 由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各样工业废物的排出，使人们很需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把微
8、核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。微核试验已 成为检测药物、放射线、有毒物质的遗传毒性，反映其对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤的一个重要方法。近几年，随着 DNA 碎片的分析、细胞凋亡的研究、单克隆抗体的应用、人类基因组学研究和肿瘤基因组解剖计划进一步丰富了微核理论。 6 1.2.2 微核形成的机理 微核形成的机理微核形成的机理，多数学者认为微核主要来源于染色体畸变中的无着丝粒断片和单条或多条染色体。曹佳等采用电镜、 BrdU 标记、 DNA 探针杂交等技术 1214，对微核结构、功能进行了较系统的研究，发现部分淋巴细胞微核具有一定的结
9、构和功能，部分微核具有 DNA 复制能力，不同诱变剂诱导的微核具有不同的染色体组成，并有一定的规律性。如非整倍体断裂剂 (化学诱变剂 )诱导的微核，主要由丢失的整条染色体组成；染色体断裂剂 (物理因素 )诱导的微核，主要由染色体断片组成。 化学诱变学说：当细胞受到化学诱变剂作用后，造成染色体断裂或有丝分裂器 (主要指纺锤丝 )的损伤，在细胞分裂后期，此断片和染色体不能被纳入子细胞核，形成游离在胞质中的小核 (微核 )。纺锤丝毒性类药物如秋水仙碱、 HO 一221 等直接抑制动物细胞纺锤丝的形成，阻止细胞分裂中期纺锤丝将染色体拉至细胞的两端。 Ando 等 n 应用 抗肿瘤药 (HO 一 221
10、)抑制纺锤丝微管组装，破坏纺锤丝，结果在染色体分析时诱导出多倍体和亚二倍体细胞，未见染色体断裂，鼠体内细胞也常被诱导出较大的微核。有机苯能引起微核增多且有明显的致癌作用，苯三酚 (1， 2， 4 一苯三酚， BT)在氧化成醌时产生活性氧损伤 DNA 和其它一些细胞大分子，实验中 BT 能使淋巴细胞微核率上升 2 倍，使 HK 一 60 细胞微核率上升 8 倍，且总微核数两类细胞呈剂量相关性增高， BT 不仅引起染色体数目 和结构的变化，而且通过产生新氧间接引发点突变。此外，我们用不同浓度的重金属砷、铅、锰、汞溶液对人外周血 淋巴细胞染毒试验，发现微核在一定浓度范围内呈显著升高趋势；通过对电焊工
11、、油漆工、汽车司机、炼油厂职工这些有害因素接触人群微核的检测，我们也发现其微核率明显高于健康对照组；我们通过对化疗患者外周血淋巴细胞微核监测，发现其化疗前、化疗中和化疗后有明显的变化 (设健康对照组 )，可见化疗药物具有明显的致畸致突变作用。 细胞组成成分缺乏学说：有作者对 9 位健康志愿者进行了叶酸限量试验，从基础用量的 195 mg d，减少到 56 mg d，维持 5 w，然后慢慢补充叶酸，减量后的双核淋巴细胞和全系淋巴细胞内的微核频率均增高， 且着丝点阳性和阴性的微核都增加。当叶酸补充后，两类细胞微核率明显下降，着丝点阳性微核变化更为显著。实验表明，低叶酸血症在临床贫血症状之前，就出现
12、了血液和口腔黏膜细胞遗传物质损伤口引。可见其二者之间呈负相关，而血浆半胱氨酸浓度与微核率呈正相关，低维生素 D 导致血液细胞遗传物质损伤 15，微核率升高。由此可见， DNA 合成过程所需原料的缺乏 (关键酶、核苷酸以及膜完整性所需成分等 )均可导致微核升高。 染色体畸变断片学说：主要指电离辐射 (包括 X，中子， a)，体内外细胞受照射后，导致遗传物质损伤，可诱发微核形成，由此 可见这也是微核形成的一个重要因素 16， 17。研究资料表明，电离辐射诱发的微核主要是断片形成的，其原因是电离粒子穿透染色体或其附近时，是染色体分子电离发生化学变化而断裂形成断片，最终形成微核，主要是有氧增强自由基增
13、多所致。微核又是细胞凋亡产物，当程序性死亡基因被激活，随之 Ca 依赖性内切酶激活切割 DNA，形成细胞核碎片，形态学表现为核深染，染色质边缘分布的帽形核，最后导致无数微核。经过我们多年对放射工作者、核生产厂矿及核爆试验人员外周血淋巴细胞微核观察，发现放射工作人员淋巴细胞微核细胞率、微核阳性检出率均 显著高于正常健7 康对照组，受意外照射人员微核明显增高，淋巴细胞微核细胞率、微核阳性检出率与放射工龄呈陆线正相关关系，与个人年受照射剂量呈直线正相关，与个人累积受照剂量直线正相关。 膜损伤学说：有的学者认为，辐射作用于核膜的某一部位，使之变薄、穿孔，由于张力的作用，使核内容物从受损膜部位向外突出、
14、延伸、收缢，最终连丝断裂而形成微核。国际上普遍认为微核来源于染色体断片或丢失的整条染色体，根据这一理论，细胞必须经过分裂后，才能观察到微核。但国内薛开先采用放射自显影、间期细胞及各周期微核定量分析等手段，于 1986 年 首先提出了间期细胞可以以核芽突方式形成微核学说。曹佳使用 BrdU 标记和电镜技术，也证实了这一途径可以解释部分微核的形成 13,18,19。两学者的工作同时认为：这一途径与染色体断片和染色体丢失形成微核理论并不矛盾，都是遗传物质的丢失，具有相同的遗传毒理效应。根据这一新的论点，在人群监测中采集的外周血不需培养，即可直接在外周血淋巴细胞中观察到微核的存在。 基因突变学说：这里
15、主要指病毒感染，可引起基因突变，蛋白质和酶的变化，从而影响 DNA 的复制，诱发染色体畸变形成微核。 DNA 损伤和修复在机体维持动态的平衡， 通过研究自发微核率与性别、年龄的关系，我们发现人体微核呈偏态分布，说明细胞存在自发突变，微核随年龄增加，不受性别影响，此外，逆转录现象的发现和核酶的研究，加深了我们对中心法则的认识，拓宽了 RNA 病毒致癌、致病的研究。病毒癌基因、细胞癌基因和癌基因活化机制，以及细胞凋亡机制的深入研究，也是对此学说的有力证明。无论何种学说，都认为微核是核物质，并有 DNA 合成能力。 当细胞微核作为一种评价指标用于辐射损伤、药物筛选、肿瘤防治的实验研究 , 使它形成“
16、微核测定法”被肯定以来 , 人们就越来越关心和重视细胞微核在各种因素 作用下形成机理的探讨。 1.3 目的和意义 微核实验从建立开始就因为其灵敏、稳定，且能检测染色体完整性改变和染色体分离改变两种遗传学终点而得到广泛应用，随分子生物学技术的发展，现已成为可检测多终点的分子毒理学方法。在非整倍体毒剂检测、致突变物筛选和外来化合物生物毒作用机制研究等领域有广阏的应用前景。诚然，目前微核实验还存在：用于检测微核着丝粒和端粒的 DNA 探针的特异性和灵敏性不十分满意、尚不能全面分析微核来源于哪条染色体、微核自动化分析费用高等局限性；然而，随新 DNA 探针的不断发现、多色荧光原位杂交和计算机辅助的 激
17、光共焦显微分析技术的发展，通过微核实验能更细致、快捷地检测微核的染色体来源。评价外来化台物的毒性作用。 微核试验已成为检测药物、放射线、有毒物质的遗传毒性，反映其对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤的一个重要方法。近几年，随着 DNA 碎片的分析、细胞凋亡的研究、单克隆抗体的应用、人类基因组学研究和肿瘤基因组解剖计划进一步丰富了微核理论，但研究范围仍局限于幼红细胞、成熟淋巴细胞及体外细胞株。随着微核试验检测范围的进一步拓宽，新微核试验正向我们走来，我国学者应加强对这一方法的研究，加大新技术示范与推广的力度，以缩 小与国际同行研究的距离。 8 1.4 课题设计指导思想 本试验的目的是为了掌握微核试
18、验的基本原理和基本技能，通过研究环磷酰胺诱导人的外周血淋巴微核形成，判断微核在细胞周期的哪个时期形成或哪个时期微核率（ MNF）最大。 2 方案论证 2.1 方案的设计原理 本试验选取人的外周血淋巴细胞作为试验对象，观察环磷酰胺对其影响以及微核的产生，判断微核在细胞周期的哪个时期形成或哪个时期微核率（ MNF）最大，以及微核的一些性质研究。 2.2 方案论证 2.2.1 实验对象的选择 微核实验的研究对象已从骨髓红细胞扩 展到多种在体细胞和离体培养细胞。过去认为红细胞成熟过程中能把主核排出胞外微核滞留在胞内，易于识别，而外周血中的含微核红细胞又常被脾脏清除，所以常规微核实验以小鼠骨髓嗜多染红细
19、胞为研究对象。 80 年代后发现小鼠脾脏不能有效清除含微核红细胞小鼠外周血红细胞微核实验结果与骨髓嗜多染红细胞微核实验有较好的一致性。显然前者更简便。并可对同一动物进行多次采样分析。目前，该方法已被国际组织普遍接受，日本学者还直接分离小鼠血中微核进行有关微核染色体组成的研究 23。最近还发现红细胞也可把微核排出胞外。并且被排出的微核主 要来源于整条染色体 24。 随技术发展，已能有效识别有核细胞中的微核。人外周血淋巴细胞、实体组织活检细胞、组织脱落细胞 (口腔、泌尿道 )微核率等能在一定程度上反映射线及外来化合物等对某些器官造成的遗传毒性损害，对肿瘤的研究、诊断均有较大参考价值，许多研究把它们
20、作为生物剂量监测指标。生殖细胞 (主要是精子 )微核率，由于其特殊的遗传地位，亦有较多研究报道。 培养细胞微核实验避免了个体差异因素的影响，易于控制实验条件，操作简便。体外培养的血淋巴细胞、各种哺乳动物细胞系、原代肿瘤细胞、肝细胞及蚕豆根尖、紫露草等植物细 胞等已广泛用于微核实验研究。总之，可根据实验需要9 选择合适的细胞进行微核实验研究。 2.2.2 实验研究的方法 细胞动力学阻滞微核分析 :1985年 Feneeh等建立了该方法，用胞质分裂阻滞剂阻断胞质分裂，但不影响胞核分裂，有丝分裂细胞呈特殊形态的双核细胞，未发生核分裂的细胞则维持单核细胞形态。检测致突变固索作用后的双核细胞率和双核细胞
21、做核率，可同时获得致突变因素对细胞的遗传毒性损害和对细胞周期影响的信息。这一方法倍受青睐迅速得到广泛应用，不仅与后面提及的免疫荧光和原位杂交技术配合运用，可以准确分辨微核 来源，判断姐妹染色单体在子代细胞的分市。而且，通过观察双核细胞的两个子代核间是否有染色质桥，可检测染色体分离障碍；用阿糖胞苷抑制 DNA切除修复，观察双核细胞微核率的变化，可检测 DNA双链损伤情况及 DNA切除修复缺陷；观察含 6一琉基嘌呤的培养基中生长的双核和多核细胞率可以检测 HPRT基因突变情况 25。 免疫荧光微核分析 :硬皮病患者血清中含有抗着丝粒 (antikinetochore antibodies)，能特异
22、性地与人和一些哺乳动物的着丝粒蛋白结合，通过免疫荧光技术检测微核中是否存在着丝粒蛋白，可初步 判断微核来自于整条染色体还是染色体断片。由于硬皮病患者常有明显的 CREST征 (即钙质沉着、雷诺现象、食管能动性障碍和指、趾硬皮病等 )，这种方法也称 CREST染色。 1986年 Vig26 等首先报道了这一方法，其后很多研究采用了这种方法，我们也用这种方法分析了昆明山海棠和丙烯酰胺诱导的微核 27,28。由于这种方法检测的是着丝粒蛋白，如果化合物能使着丝粒蛋白失活或合成受抑，就会导致假阴性结果。已有研究表明丝裂霉素 c(mitomyein c)、 5一氮胞嘧啶 (5一 azacyti dine)
23、、地西泮 (diazepam)、甲胺嘧啶 (pyrimethamine)和氢酿 (hydroqnone)等均可通过上述途径导致着丝粒阳性微核率下降。然而，这种方法简便易行，当受试化合物对着丝粒蛋白无影响时，还是相当准确可靠，所以受到不少学者推崇。 荧光原位杂交微核分析 :用着丝粒 DNA探针或同时应用着丝粒和端粒 DNA探针，通过荧光原位杂交，检测做核着丝粒和端粒信号，可准确判断微核来源于整条染色体还是染色体断片，推测微核所含染色体和断片的数目。应用染色体特异性 DNA探针，可检测姐妹染色单体在于代细胞的分布 (包括染色体丢失和染色体不分离 )，分辨微核内是否含有某几条染色体 。 从而深入分析
24、诱导微核形成的理化因素的遗传毒性及毒作用靶位等。 原位启动 DNA合成微核分析 :用寡核苷酸引物，通过少数几轮 PCR原位扩增目的 DNA序列 。 并掺入地高辛标记的 dUTP，如荧光原位杂交一样地度微核内的着丝粒或端粒呈现荧光信号。 Russo等用这种方法检测了丝裂霉素 C和秋水仙素诱导的小鼠脾细胞着丝粒和端粒组成，认为这种方法灵敏度高，重复性好并且更快捷。 对微核细胞进行凋亡检测 :凋亡是一种由遗传调控的细胞生理性死亡机制，由于一些癌基因和抑癌基因参与了凋亡的调控， 引起了人们的广泛关注。尤其是 P53基因，它既参与了 DNA损伤所致的细胞周期阻滞和凋亡，也是维持基 因组稳定性所必需 。
25、有研究认为 P53还与微核形成有关。细胞遗传物质受损伤可能出现：仍能正常分裂、微核和非整倍体形成、发生凋亡。可见，凋亡也是遗传毒性损伤后续效应的一个重要指标，评估化合物遗传作用时 ， 进行细胞凋亡率检测有重要意义。 10 3 材料与方法 3.1 材料与仪器 3.1.1 药物与试剂 环磷酰胺粉末（针剂），生理盐水， 0.5 KCl 溶液 ，蒸馏水，甲醇，冰醋酸，Giemsa 原液 ， 1mg/ml Brdu， PHA 粉 末（针剂）， 1 ug/ml 秋水仙素，灭活小牛血清。 3.1.2 仪器与设备 试剂瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，注射器，滴管， 10ml 离心管，镊子，酒精灯，手套，口罩，离心机，
26、电子天枰，光学显微镜， 37 培养箱，超净台，酒精灯，移液抢，冰箱 , 试管架 ，定时钟，脱脂玻片，火柴等 3.2 实验步骤 3.2.1 溶液的配置 一常规溶液 (一 )1/15mol/L PBS(磷酸缓冲液 Phosphate Buffer Solution， PBS) 甲液： 1/15mol/L Na2HPO4溶液 Na2HPO4 9.465g 蒸馏水 加至 1000ml 乙液： l/15mol/L KH2PO4溶液 KH2P04 9.07g 蒸馏水 加至 1000m1 分装在棕色瓶内，于 4冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需 pH 的缓冲液 ,见下表 : pH 甲液 ml 乙液 mI pH 甲液 ml 乙液 mI
