1、 本科 毕业 设计 (论文 ) （二零 届） 南湖水体中微生物生理群生态的初步研究 所在学院 专业班级 生物工程 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 I 摘要 : 测定南湖水体中微生物的数量分布、湖底污泥中微生物的数量与分布，对其中异养型细菌进行鉴定，通过对南湖 水体中微生物生理群进行调查，以便了解南湖水体中微生物生理群的 生态分布情况，有助于了解南湖水体受污染的情况，以便为南湖的整体治理方案提供依据。 关键词 : 南湖； 大肠杆菌； BOD； COD；菌群； II South lake water in microbiological physiology group of e
2、cological preliminary studies Abstract:Determine the number of microorganisms in south lake water distribution of microbes in the bottom sludge quantity and distribution， On one of them to heterotrophic bacteria appraisal，Through the south lake water in microbiological physiology group to carry out
3、investigation， In order to understand south lake water in the ecological distribution of microbiological physiology，Helpful for understanding the polluted situation south lake water， so as to provide the overall treatment plan to nanhu basis。 Keywords: South lake； E. Coli； BOD； COD； Flora 目 录 摘要 . I
4、 Abstract. . II 1 绪论 . 错误 !未定义书签。 2 材料与方法 . 3 2.1 实验材料 . 错误 !未定义书签。 2.1.1 培养基 . 3 2.1.2 溶液的配制 . 错误 !未定义书签。 2.1.3 试剂 .4 2.2 微生物的分离纯化方法 .4 2.2.1 平板涂布法 .4 2.2.2 倾注法 .4 2.2.3 菌种鉴定 .4 2.3 细菌生理化得测定 .5 2.3.1 COD 的测定 .5 2.4 BOD5 测定 .6 2.5 含 氮 量测定 .6 2.6 微生物的测定 .6 3 结果与分析 . 7 3.1 细菌分析 . . 7 3.1.1 水体中异养菌数量 .7
5、 3.1.2 水体中大肠杆菌数量 .7 3.1.3 南湖水水质测定 .8 3.2 南湖水体中微生物种属鉴定及分布 .9 4 结论 .11 参考文献 . 错误 !未定义书签。 致 谢 . 错误 !未定义书签。 1 1 绪论 在我国城市化进程中 ，城市河流污染是一个迫切需要解决的问题。由于城市的大规模建设 ，典型城市河流天然汇水区域大幅减少，各种生活污水和工业废水进入城市河流 ，城市面源污染也随着 降水径流进入河流 .我国多数城市河流受到比较严重的污染 ，一些城市河流常年发黑发臭，严重影响生态、景观和居民的健康生活 . 此外 ，伴随着河流水质的恶化 ，河流水体的微生物安全性降低 ，给城市居民的健康
6、带来潜在风险 .。目前 ，虽然对很多河流污染进行过调查分析，然而对于河流嗅味物质的定量分析、变化规律及影响因子还有待深入研究。 以两种嗅味物质 (二甲基异莰醇和土臭素 )作为研究对象，对南方某城市河流进行全程水质调查 ，重点探讨嗅味物质变化规律及其与河流溶解氧、有机物和微生物群落结构的关系以及病原性微生物种类，以期为改 善河流水质和恢复河流生态提供科学依据 . 近年来，随着对环境资源开发利用力度的日益增加，大量含有氮、磷元素营养物质的污染物不断排入湖泊、水库和河流，使水体的营养物质负荷量不断增加。另一方面，为提高农作物产量，农田施用的化肥和牲畜粪便逐年增加，经雨水冲刷和渗透，进入水体的营养物质
7、不断增多。由于这些人为因素的影响使水体的污染和富营养化问题日益严重。富营养化水体的有效治理已成为迫待解决的重要环境问题。 水体富营养化分为天然富营养化和人为富营养化。天然富营养化要经过几千年甚至几万年才能完成，而人类经济活动可 导致湖泊在几年内就出现富营养化。可见人为富营养化是目前水体富营养化的主要原因。水体中藻类生长离不开碳、氮、磷 3 种关键元素的存在，而这 3 种元素也是引起水体富营养化的决定因素。在受氮、磷元素影响的水体中，尤其是封闭水体，藻类会不断大量繁殖，消耗水体中大量溶解氧 (DO)，而藻类的死亡和解体又会将从水体中所吸收的氮、磷元素释放回水体，从而造成水体中藻类的恶性循环繁殖。
8、另外水体中可供藻类利用的碳、氮远远多于可利用的磷元素，磷元素通常被认为是水体富营养化的限制因子。对于水体富营养化状况，英国国家环境署规定，在静 止水体中，总磷浓度 0.086 mg L1为富营养化的临界值。国际上一般认为湖水中总磷浓度 0.02 mg(P) L1际上一般认为湖水中总磷浓度 0.02 mg(P) L1、总氮浓度 0.2 mg(N) L1是水体富营养化的发生浓度。我国考虑到湖泊总氮、总磷等营养盐浓度普遍较高的实际情况，对总氮、总磷标准进行适当调整后通过界定叶绿素含量、总氮、总磷、 COD、透明度等水质指标值，对我国湖泊富营养化程度进行了分类。 2 我国城市湖泊污染类型主要以富营养化
9、为主 ，而受污染缓流水体底泥中污染物质的长期缓慢释放是 水体生态修复的难点。湖泊治理、 修复的方法可分为物理法、 化学法和生物法三大类型。物理法主要以工程疏浚为主 ,具有见效快的优点 ,但投资大 ,并且由于富有养分的底泥被挖走后不利于其后的生态系统恢复。化学法主要以投放试剂为主 ,能有针对性地控制某些污染指标 ,但不能从根本上控制水体污染 ，且给水体带入了新的化学物质。固定化微生物法是国际上较先进的水体治理方法。本研究采用固定化微生物技术对受污染缓流水体湖泊底泥进行了生态修复试验 ，研究了采用固定化微生物技术对底泥中营养物质降解与释放。这对以后开展类似湖泊的治理 工作将有非常重要的意义。3 2
10、 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 培养基 （ 1） 牛肉膏蛋白胨培养基： 牛肉胨 3 g/L、 蛋白胨 10 g/L、 NaCl 5 g/L、 琼脂 20 g/L (pH7.2 7.4)。 （ 2） 硝化细菌培养基： (NH4)2SO4 2 g/L、 CaCO3 5 g/L、 K2HPO4 0.75 g/L、 MnSO4 0.01 g/L NaH2PO4 0.25 g/L、 MgSO47H 2O 0.3 g/L、 琼脂 20 g/L。 （ 3） 纤维素分解细菌培养基： K2HPO4 1 g/L、 (NH4)2SO4 1 g/L、 MgSO47H 2O 0.5 g/L、 NaCl 0.
11、5 g/L、 琼脂 20 g/L。 （ 4） 马铃薯培养基 ： 马铃薯 ： 200 g/L、 蔗糖 20 g/L、 琼脂 15 20 g/L。 （ 5） 氨化细菌培养基 :牛肉膏 ： 3 g/L、 鸡蛋白 10 g/L、 NaCl 15 g/L、 琼脂 20 g/L。 （ 6） 放线菌培养基 ： 可溶性淀粉 20 g/L、 KNO3 1g/L、 NaCl 0.5g/L、 FeSO47H2O 0.01 g/L、 K2HPO4 0.5 g/L、 MgSO47H2O 0.03 g/L、 琼脂 20 g/L。 2.1.2 溶液的配制 （ 1） 草酸铵结晶紫染液 A液： 1%结晶紫、 95%酒精溶液；
12、B液： 1%草酸铵溶液，取 A液 20ml， B液 80ml，静置 48 小时后使用。 （ 3） 路哥氏碘液：碘片 1.0g， KI 2.0g，蒸馏水 300ml。 （ 4） 蕃红复染液： 2.5%蕃红， 95%酒精溶液，取此液 10ml于 90ml蒸馏水混匀即可 . （ 5） 重铬酸钾标准溶液（ 1/6K2Cr2O7=0.02500mol/L）：称取预先在 120 烘干两小时的基准或伏级重铬酸钾 1.22克溶于水中，移入 100ml容量瓶中，稀释至标线，摇匀。 （ 6） 亚铁灵指示液 ： 称取 1.485g邻菲啰啉（ C12H8N2H 2O） 0.695克硫酸亚铁溶于水中，稀释至 100ml
13、棕色瓶中。 （ 7） 硫酸亚铁铵标准溶液：称取 3.95克硫酸亚铁铵溶于水中，边搅拌边缓慢加入 2ml浓酸，冷却后移入 100ml容量瓶中，加入蒸馏水稀释至标线，摇匀，临用前重铬酸钾标准溶液标定。标4 定硫酸亚铁铵溶液：准确吸取 10.00ml重铬酸钾标准溶液于 500ml锥形瓶中加不黧至 110ml左右，缓慢加入 30ml浓硫酸，混匀冷却后，加入 2滴试亚铁灵指示液（约 0.1ml）用硫酸亚铁溶液滴定，溶液的颜色经蓝绿色至红褐色即为终点。 C =（ 0.0250010.00 ） / V c 硫酸亚铁铵标准溶液的浓度（ mol/L） V 硫酸亚铁铵标准溶液的用量（ ml） 0.02500mol
14、/L 重铬酸钾标准溶液 由公式所得 C=0.01016 mol/L 2.1.3 试剂 浓硫酸、硫酸钾 3份与硫酸铜 1份混合（ W/W）、 30%NaOH溶液： 30gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml、 2%硼酸溶液： 2g硼酸溶于蒸馏水，稀释至 100ml 混合指示剂： 0.1%甲基红酒精溶液和 0.1%甲烯蓝酒精溶液按 4： 1比例（ V/V）混合 0.01mol/L标准盐酸溶液：用恒沸盐酸准确稀释。 2.2 微生物的分离纯化方法 细菌用营养琼脂培养基，大肠杆菌用远藤氏培养基，酵母菌，霉菌用马铃薯培养基（倒平板时注入少量青霉素钠），氨化细菌，硝化细菌，亚硝化细菌，真菌，放线菌，均采用相
15、应培养基。 分离微生物最常用的方法是平板划线法，涂布平板法和倾注平板法，此次实验主要采用涂布平板法。 2.2.1 平板涂布法 移取部分水样于装有玻璃珠和无菌水的三角瓶中，震荡约 20分钟，使水样与无菌水样充分混合， 将 菌分 散。用 1ml无菌吸管从中吸取 1ml注入装有 9ml无菌水的试管中，吸取三次，并振摇使这充分混合。然后再用另一只吸管从此试管中吸取 0.5ml注入另一盛有 4.5ml无菌水的试管中，以此类推，就此制成 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5等各种稀释度。 将 所制培养基熔化，待冷却至 45 左右时倒平板，其方法右手持三角瓶，左手拿培养皿并松动棉塞用小指
16、和无名指夹住拔出，瓶口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开少许，迅速注入培养基约 15ml左右，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基平均分布，平置于桌面上，待 凝后即成平板。 5 2.2.2 倾注法 将融化后冷却至 45 左右的琼脂培养基，向加有南湖水样稀释液的各培养皿分别倒入 1015ml，迅速旋转培养皿，使培养基和稀释液充分混合，水平放置待冷凝后，恒温培养。 2.2.3 菌种鉴定 形态观察：采用革兰氏染色法，判断其是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，细菌先经碱性染料着色，然后用媒染剂处理后，以脱色剂脱色，最后复染。若菌仍保持原来的染料颜色，称为革兰氏阳性菌，如被脱色剂脱色染上了复染染料的颜
17、色的称为革兰氏阴性菌。 芽孢的染色观察：用枯草芽孢杆菌制作涂片标本，固定。取一 小片小于载玻片的滤纸，将其覆盖在涂片标本上。在滤纸片上滴加孔雀绿液，用蒸汽加热 5 10分钟，注意及时补加染液，以防染液蒸干。轻轻取下纸片，玻片冷却后，水洗。沙黄水溶液复染 30秒，水洗，干燥，镜检。荚膜的染色观察：滴一滴黑色素于干净的载玻片一端，取一接种环菌悬液与黑色至少混合。若从斜面取菌，应先加一滴无菌水。另取一块干净的载玻片将此混合物自载玻片的一端刮至另一端，使之成一薄层。让涂片自然干燥，轻热固定。加蕃红液染色 30秒，水洗，自然干燥，镜检。 鞭毛的染色观察：实验宜用新培养的菌体。保存斜面菌种，应用新鲜斜面
18、连续接 3 5次后再使用。取经过特殊处理的载玻片一块，于其一端滴加一滴蒸馏水，用接种环挑取少量的菌体（勿带出培养基），在载玻片上的水滴中轻沾几下（勿涂布），将载玻片倾斜，使菌液流至另一端，然后放平，自然干燥（切勿回执固定）。滴加鞭毛染色 A液染色 2 3分钟，水洗，将残水沥干，或用鞭毛染色 B液冲去残水。一定要将 A液充分洗净再用 B液。滴加 B液，将载玻片稍加热，染色30 60 秒，冷却后水洗。油镜观察，菌体的颜色比鞭毛深些。 玻片选择无滑痕纹玻片，先用国产 SDS液煮沸，为了充分接触，将玻片置特制玻片架，煮沸30分钟，然 后冷却，再放入洗液，浸泡过夜，用水冲去残酸，最后用蒸馏水冲洗，沥干水
19、，再放入 95%乙醇脱水，取出玻片，以火焰去乙醇，立即使用。 2.3 细菌生理生化的测定 2.3.1 COD 的测定 原理：在强酸性溶液中，一定量的重铬酸钾氧化水样中还原性物质，过量的重铬酸钾以试亚铁灵作指示剂，用硫酸亚铁铵溶液回滴，根据用量算出水磁中还原性物质水泵的量。 6 干扰及其消除：酸性重铬酸钾氧化性很强，可氧化大部分有机物，加入硫酸银作催化剂时，直链脂肪化合物可完全被氧化，而芳香族有机物却不易被氧化，吡啶不被氧化，挥发性直链脂肪族化合 物，苯等有机物存在于蒸汽相，不能与氧化剂液体接触，氧化不明显，氯离子能被重铬酸盐氧化并且能与硫酸银作用产生沉淀，影响测定结果，故在回流前向水样中加入硫
20、酸汞，合成为络合物以消除干扰。 适用范围：用 0.2500mol/L 浓度的重铬酸钾溶液测定大于 50mg/L的 COD值，本实验采用0.02500mol/重铬酸钾溶液。 操作步骤：取 20.00ml 混合均匀的水样置 250ml 磨口的回流锥形瓶中，准备加入 10.00ml重铬 酸钾标准溶液及数粒玻璃珠或沸石，边接磨口回流冷凝管，从冷凝管上口慢慢加入 30ml硫酸-硫酸银溶液 ，轻轻摇动锥形瓶使溶液混匀，加热回流两个小时。（自开始沸腾时计时） A、 冷却后用 90ml水冲洗冷凝管壁，取下锥形瓶，溶液体积不得少于 140ml否则会因酸度太大，滴定终点不明显。 B、 溶液再度冷却后，加 2滴试亚
21、铁灵指示液，用硫酸亚铁铵标准溶液，滴定溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量。 C、 测定水样的同时，以 20.00 ml重蒸水，按同样操作步骤，做空白实验记录滴定空白时硫酸亚铁按标准溶液的用量。 COD计算式： COD (O2,mg/L)= (V0 V1) c8 1000 / V V0 滴定空白进硫酸亚铁铵标准溶液用量（ ml） V1 滴定样品时硫酸亚铁铵标准溶液用量（ ml） c 硫酸亚铁铵标准溶液的浓度（ ml） V 水样的体积（ ml） 8 氧（ 0.50）摩尔的质量（ g/mol） 2.4 BOD5 测定 原理 ： 生物需氧量（ BOD5）定义为水平中需氧微生物消耗溶解氧的量，当样品放在培养中，培养温度为 20 培养五天时，测定所消耗溶解氧的含量来确定水样的 BOD5值。生物需氧量，是指在特殊条件下，通过水中需氧微生物的系列和呼吸作用，分解水中有机物时所消耗 或所需要溶解氧的量。水中 BOD值，通常以样品在 20 放置五天所消耗溶解氧的量（ mg/L）表示，记为 “ BOD5”。 操作过程：取水样倒入培养瓶，再将搅拌子放入培养瓶内，密封杯中放入 CO2吸收剂氢氧化
