1、 本科生毕业论文（设计） 题 目 : 皖北麦田土壤解磷菌筛选及解磷能力初步研究 姓 名 : 学 院 : 城建与环境学院 专 业 : 农业资源与环境 班 级 : 2010 级 2 班 学 号 : 2204100223 指 导教师 : 职称 : 教授 2014 年 5 月 25 日 安徽科技学院教务处制 1 目录 摘要 . 2 关键字 . 2 引言 . 2 1 材料和方法 . 2 1.1 材料 . 2 1.1.1 土样 . 2 1.1.2 培养基 . 2 1.1.3 磷源物质 . 3 1.2 方法 . 3 1.2.1 解磷菌筛选 . 3 1.2.2 解磷菌在固体培养基上溶磷能力的测定 . 3 1.
2、2.3 解磷菌在液体培养基上溶磷量的测定 . 3 2 结果和讨论 . 3 2.1 菌落形态观察 . 3 2.2 菌株在不同磷源固体培养基上的生长活力 . 3 2.3 菌株在三种液体培养基上的溶磷量 . 4 2.4 三种液体培养基中的 pH 与溶磷量的关系 . 5 3 结论 . 6 致谢 . 6 参考文献 . 7 英 文 翻译 . 8 2 皖北麦田土壤解磷菌筛选及解 磷能力初步研究 10级农业资源与环境专业 指导老师： 教授 摘要： 采用 Pikovskay 培养基从临泉麦田中筛选出具有高效解磷能力的菌株四株，将筛选出的菌株在三种不同磷源（磷酸三钙、磷矿粉、卵磷脂）的固体培养基和液体培养基中培养
3、。在 Pikovskay 平板 3 天后测量解磷菌 D/d 为 1.271.65，在液体摇瓶培养中，其解磷率为0.1320.20mg/L。其中 310 1 对三种磷源都有较高的解磷效果，有较高发展潜力。而 303 3和 310 3 分别对磷酸钙和卵磷脂有较高解磷率，可作 为专性解磷菌株配合单一磷肥施用。 关键字 : 解磷菌；不同磷源；溶磷能力 引言：磷是作物生长必不可少的营养元素之一，在作物生长的各个阶段都扮演重要角色。根据报道我国约 75%的耕地土壤缺磷。土壤中 95%的磷以无效态形式存在，植物难以直接利用。根据报道，土壤中平均含磷量约 0.12%，而其在土壤溶液中的含量仅为 0.0051.
4、0mg/kg。作物当季磷肥利用率仅为 5%10%，大部分磷作为无效态在土壤中累积 1,2。由于长期施用磷肥，土壤磷库充足而磷流不足是目前耕地土壤的现状。土壤中含磷化合物以有机态和无机态的形 式存在。无机态磷约占 30%50%，主要分为闭蓄态磷和非闭蓄态磷。闭蓄态磷是指磷酸铁和磷酸铝被氧化铁形成的酸膜包敝，活性较低，难以被植物利用。非闭蓄态磷主要指铁铝钙的三种磷酸盐，在一定条件下他们可以被释放出来供植物利用 3。土壤中有机态磷约占 30%50%，主要包括肌醇类，核酸，磷脂，磷蛋白，磷糖等。土壤中的有机态磷 5%10%存在于微生物体内， 30%50%以植酸钙镁的形式存在。土壤很多因素影响磷的利用，
5、其中微生物对磷的有效化影响很大。事实上土壤中存在大量的解磷微生物，能够将无效态磷转化为有效态磷（可溶 性磷）。我国旱地土壤的解磷菌平均为 107cfu /g,约占总微生物的 27%82%5 8，其中根际土壤的解磷菌数量要比非根际土壤的解磷菌数量高一到两个数量级解磷菌的分布表现出强烈的根际效应。研究表明不同解磷微生物对不同磷源的喜好不尽相同 9 11。目前科学家已经筛选出许多高效菌株开发出解磷菌制剂，并成功用于生产有效提高作物产量。如东北农科所将巨大芽孢杆菌制成菌剂在黑钙土和非黑钙土上施用，不同的作物增产幅度不同，平均增产黑钙土为 13.5%，非黑钙土为 11.7%3。本文尝试从另一方面出发，利
6、用改良的 Pikovskaya 培养基筛选麦田土壤解磷菌，来探讨其对三种磷源 磷矿粉，磷酸钙，卵磷脂的解离能力的差异。 1 材料和方法： 1.1 材料 1.1.1 土样： 临泉小麦土壤。 1.1.2 培养基： 分离培养基（改良的 Pikovskaya 培养基） :葡萄糖 10g， Ca3(PO4)25g，硫酸铵 0.5g，氯化钠 0.2g，硫酸镁 0.1g，氯化钾 0.2g，酵母膏 0.5g，硫酸锰 0.002g，硫酸亚铁 0.002g， 0.4%溴酚蓝（ pH6.7） 6ml，琼脂 20g，蒸馏水 1000ml， pH7.0 7.2。 液体培养基 ： Pikovskaya 培养基：葡萄糖 1
7、0g， Ca3(PO4)2 5g，氯化镁 5g，硫酸镁 0.25g，氯化钾 0.2g，硫酸铵 0.1g，蒸馏水 1000ml， pH7.0。 1.1.3 磷源物质： 无机磷为磷酸三钙 (Ca3(PO4)2)，磷矿粉 : 主要成分为氟 磷灰石。有机磷为卵磷脂。上述均为市售分析纯试剂。 1.2 方法 3 1.2.1 解磷菌筛选： 称取新鲜土壤 10g 置于内含玻璃珠和 90ml 无菌水的 250ml的三角瓶中， 170r/min 振荡 30min，然后按 10-5、 10-6、 10-7 梯度进行稀释，各取0.1ml 涂布于分离培养基上，每个梯度重复 3 次，于 30 培养 35d，挑取有较大溶磷
8、圈的菌落进行纯化保存。 用接种环将上述纯化保存的生长良好的解磷菌，使用平板划线法分别接种于 pikovskaya 培养基中，培养 3d，选取生长良好溶磷圈明显的菌落，观察记菌株菌落特征及生长情况 。 1.2.2 解磷菌在固体培养基上溶磷能力的测定： 用灭过菌的牙签将上述菌株点接在分别以磷酸三钙、磷矿粉和卵磷脂为唯一磷源的培养中，磷源为卵磷脂时，不加溴酚蓝，卵磷脂为 2g/L，并补加碳酸钙 5g/L。 30 培养 3 天，测量溶磷圈直径（ D）和菌落直径（ d）及其比值。初步确定各菌株解磷能力的强弱。 1.2.3 解磷菌在液体培养基上溶磷量的测定： 将上述筛选菌株按 1%的接种量分别接入以磷酸三
9、钙、磷矿粉和卵磷脂为唯一磷源的液体培养基中，并分别以不接种菌的三种培养基作空白对照， 30 ， 170r/min 摇床培养 7d。发酵液经 10000r/min离心机离心 10min，取上清液稀释适当倍数，分别用钼蓝比色法和 pH 计测可溶性磷含量和 pH 值。 2.结果和讨论 2.1菌落形态观察 表 1 解磷菌的菌落特征 Table 1 Characteristics of colony 菌株 Strains 菌落特征 Colony characteristics 生长情况 Growth 303-1 菌落乳白色，圆形，菌落很大，溶磷圈较明显 2 天后观察到生长 303-3 菌落乳白色，圆形，
10、菌落较大，溶磷圈很明显 2 天后观察到生长 310-1 菌落黄色，椭圆形，菌落较大，溶磷圈很明显 2 天后观察到生长 310-3 菌落淡黄色，圆形，菌落很大，溶磷圈很明显 1 天后观察到生长 经过筛选得到 4 株生长良好的菌株 303-1、 303-3、 310-1、 310-3。菌株菌落特征见表 1。四菌株菌落 都比较大，溶磷圈明显。与 310-1 相比，其他三种菌株都为圆形， 303-1 与 303-3 为乳白色， 310-1 与 310-3 分别为黄色和淡黄色。从生长速度来看， 310-3 生长相对于其他 3 株较快，平板培养 1d 就能看到菌株生长，其他 3 株两天后才能看到生长。 2
11、.2菌株在不同磷源固体培养基上的生长活力 将筛选菌株分别接种在以磷酸三钙、磷矿粉和卵磷脂为唯一磷源的培养基上， 30 培养 3 天，测量溶磷圈直径（ D）和菌落直径（ d）及 D/d 值。测量结果见表 2。 4 表 2 固体培养基上解磷菌 D、 d 和 D/d 值 Table 2 The D, d and D/d values of the phosphate-solubilizing bacteria in solid medium 菌株 Strains 溶磷圈直径 Diameter of circle of dissolved phosphorus D（ mm） 解磷菌菌落直径 Diame
12、ter of the colony d(mm) D/d 磷酸钙 Calcium phosphate 磷矿粉 Phosphate rock powder 卵磷脂 Lecithin 磷酸钙 Calcium phosphate 磷矿粉 Phosphate rock powder 卵磷脂 Lecithin 磷酸钙 Calcium phosphate 磷矿粉 Phosphatee rock powder 卵磷脂 Lecithin 303-1 4.3 5.9 5.0 3.3 3.7 3.0 1.30 1.59 1.67 303-3 4.7 4.6 5.0 3.5 3.4 2.9 1.34 1.35 1.7
13、2 310-1 6.2 3.7 3.0 4.8 2.3 2.0 1.29 1.61 1.50 310-3 3.2 5.2 5.0 2.1 4.4 4.0 1.52 1.18 1.25 由表 2 可以看出不同培养基下不同菌株长势不同。生长最好和生长最差的菌株均在磷酸三钙培养基上。其中 310-1 在磷酸三钙培养基上生长最旺， D 和 d分别达到 6.2mm 和 4.8mm。但该菌株在磷矿粉和卵磷脂培养基上长势均比其他三菌株长势弱。 310-3 在磷酸三钙上生长最弱， D 和 d 分别仅达到 3.2mm 和2.1mm，而在磷矿粉和卵磷脂培养基上长势第二高。所以磷酸三钙对菌株选择性较强。除 310-
14、1 外， 菌株在卵磷脂培养基长势均超过磷酸三钙培养基，除 310-3外，菌株在磷矿粉培养基上生长均超过卵磷脂培养基。可能是由于不同菌株对不同营养磷源要求不同，而不同培养基提供不同磷源。另外，不同解磷菌在不同磷源培养基上 D/d 值也不尽相同。 303-3 和 310-1 在卵磷脂培养基上 D/d 值比其他两种培养基都大，分别达到 1.72 和 1.67。在表明这两种菌株对有机磷具有较高的固体溶磷能力，其中尤以 310-3 突出。 310-1 和 310-3 分别在磷矿粉固体培养基上 D/d 值达到最大，分别为 1.61 和 1.52。表明 310-1 对磷矿粉具有较 高的固体溶磷能力，而 31
15、0-3 对磷酸三钙具有较高的固体解离能力。 2.3菌株在三种液体培养基上的溶磷量 将筛选的菌株按 1%的接种量接种于不同的磷源培养基， 30 ， 170r/min 摇床培养 7d。发酵液经 10000r/min 离心 10min，钼锑钪比色法测上清液含磷量。结果见图 1。 0510152025303-1 303-3 310-1 310-3菌株s t r a i n s溶磷量Amount of dissolvedphosphorusmg/L磷酸三钙 磷矿粉 卵磷脂图 1 菌株在不同液体磷源培养基中的溶磷量 Figure 1 The amount of dissolved phosphorus i
16、n diverse liquid phosphorus medium 5 由图 1 可以看出不同菌株对不同 液体磷源的溶磷能力差异极为显著（ P0.01）。四种菌株对磷矿粉的溶解能力相比磷酸钙和卵磷脂较小，溶磷量分别仅达到 0.11、 0.12、 2.1 和 0.03mg/L。当以磷酸钙为唯一磷源时， 303-1 和 310-3 的溶磷量仅不足 1mg/L，分别为 0.47 和 0.31mg/L。而 303-3 和 310-1 的溶磷量明显高于前者，分别为 14.32 和 7.00mg/L。而以磷矿粉为唯一磷源时，仅 310-1 有相当程度的解磷能力，溶磷量能达到 2.06mg/L，其他三中菌
17、株都最高的不过 0.12mg/L。以卵磷脂为唯一磷源时， 310-3 菌株溶磷量达到 20.20mg/L。而该菌株对磷矿粉和磷酸三钙的溶磷量分别为 0.03 和 0.31mg/L。可见， 303-3 对有机磷源的溶磷能力较高，而对无机磷源的溶解能力则远远低于前者。结果表明， 303-3、310-1 和 310-3 的优势磷源分别磷酸三钙、磷酸三钙和卵磷脂，而 303-1 对三种液体磷源都没有明显的溶磷能力。 以上结果表明，不同菌株对不同磷源的溶解能力差异很大。同一菌株对不同磷源的溶解效果也很不一致。钟传青等 12,13研究比较了细菌、霉菌、酵母菌等对不同难容性磷源的溶磷效果发现，不同微生物对不
18、同磷 源的亲和解磷能力不同，可能是由于微生物本身复杂的溶磷机制、磷源物质的化学成分和结构差异等多种因素引起的。 Illmer 等人报道了 11四株菌株对 Ca-P、 Al-P、磷矿粉的溶磷效果差异认为这种差异是由微生物不同的溶磷机制造成的，并认为 Al-P 是通过形成络合物而溶解的。 2.4三种液体培养基中的 pH与溶磷量的关系 05101520254 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5pH溶磷量Amount of dissolvedphosphorusmg/L图 2 液体培养基中 pH与溶磷量的关系 Figure 2 The relation between PH and the a
19、mount of dissolved phosphorus in liquid medium 相对于原培养液（不接种菌株） pH 值为 7.25。接种解磷菌后，培养液 pH值下降，在 4.347.20 之间。说明解磷菌在溶磷过程中分泌出致酸物质，导致 pH值下降，使难容性磷溶解。图 2 是培养 7 天的液体培养基 pH 与可溶性磷增量的关系。由图看出，溶磷量越高，则 pH 值越低，但 pH 值低溶磷量未必高。这可能与磷源物质以及菌株的解磷机制差异有关。综合分析四株解磷菌在三种液体培养基中溶磷量与 pH 值的关系， pH 降低可增加液体培养基中可溶性磷量，但当pH 相近时，溶磷量差异较大。由表
20、3、表 4 看出，卵磷脂培养基中 pH 值下降较多，在 6.034.34。且 pH 与溶磷量没有线性关系。如 303-1 和 303-3 的溶磷量分别为 0.5889 和 1.095mg/L，而 pH 分别为 5.75 和 5.94。这一结果与赵晓蓉等的研究结果一致 1。而有一些研究发现，许多溶磷菌溶磷量与 pH 值有一定的线性相关。本实验的磷酸三钙培养基恰可以证明这一点。有效磷量增加， pH 值降低。席林桥等人的研究表明解磷菌在溶解难容性磷的过程中会分泌有机酸 4，使溶液pH 值下降，分泌有机酸的种类取决于解磷菌种类， pH 值下降和有机酸生成是解6 磷菌重要溶磷机理。从表中还可以看 出，磷
21、矿粉培养基中 pH 值下降较小，最低不过 6.23，这可能是因为磷矿粉培养基中溶磷量较小。 表 3 液体培养基下解磷菌株 pH值 Table 3 The pH in phosphate-solubilizing strains liquid medium 菌株 Strains 磷酸三钙 Calcium phosphrus 磷矿粉 Phosphorus powder 卵磷脂 Lecithin 303-1 7.20 6.53 5.75 303-3 5.02 6.23 5.94 310-1 5.79 6.56 6.03 310-3 6.92 7.19 4.34 表 4液体培养基下解磷菌株溶磷量 Ta
22、ble 4 The amount of dissolved phosphorus in liquid medium 菌株编号 Strains 磷酸三钙 Calcium phosphate (mg/L) 磷矿粉 Phosphoresce powder (mg/L) 卵磷脂 Lecithin (mg/L) 303-1 0.16 0.11 0.59 303-3 14.32 0.12 1.10 310-1 6.95 2.01 3.08 310-3 0.31 0.13 20.20 3 结论 3.1 通过对解磷菌的筛选，解磷菌在不同磷源培养基的生长状况、溶磷圈的观察，解磷菌在三种液体磷源培养基上溶磷能力的
23、测定，可以得出不同菌株对在不同磷源的固体培养基上生长状况以及在不同液体培养基中溶磷效果各有不同，这可能与解磷菌复杂的溶磷机制、不同磷源物质的化学组成和结构差异等多种因素有关。 3.2 解磷菌溶解难溶性磷时会分泌酸性物质使 pH 值下降，分泌的酸性物质的种类与数量却不尽相同，这可能也是导致溶液 pH 与解磷菌溶磷量没有线性关系的 原因。 3.3 从临泉麦田中筛选出具有高效解磷能力的菌株四株，将筛选出的菌株在三种不同磷源（磷酸三钙、磷矿粉、卵磷脂）的固体培养基和液体培养基中培养。得到结果 310 1 对三种磷源都有较高的解磷效果，有较高发展潜力。而 303 3和 310 3 分别对磷酸钙和卵磷脂有
24、较高解磷率，可作为专性解磷菌株配合单一磷肥施用。 致谢 本文在 老师 的指导下完成，在实验设计，实验过程及写作过程中，承蒙汪老师的精心指导，值此论文答辩之际，向尊敬的汪老师致以最真诚的感谢。同时段立珍老师也在我的试验完成提供了诸多便利，我在此表 示衷心的感谢。并感谢左静、李雪峰、江杰等的热心帮助，使我的论文顺利完成。最后向帮助过我的其他同学和老师表示由衷的谢意！ 参考文献： 1 赵小蓉 ,林启美 ,李保国 .溶磷菌对 4 种难溶性磷酸盐溶解能力的初步研究 J.微生物学报 ,2002,42(2): 236-241. 7 2 赵小蓉 ,林启美 .微生物解磷的研究进展 J.土壤肥料 ,2001, 5
25、(3): 7-11. 3 王光华 ,赵英 ,周德瑞等 .解磷菌的研究现状与展望 J.生态环境 , 2003, 12(1): 96101. 4 席琳乔 ,姚拓 ,韩文 星 ,等 .联合固氮菌分泌 IAA 能力及对燕麦的促生效应测定 J.草原与草坪 ,2005,4: 2529. 5 赵小蓉 ,李保国 .微生物溶解磷矿粉能力与 pH 及分泌有机酸的关系 J.微生物学杂志 , 2003, 23(3): 5-7. 6 尹瑞玲 . 我国旱地土壤溶磷微生物 J. 土壤 ， 1988， 20（ 5）： 243-246. 7 张宝贵，李贵桐 . 土壤生物在土壤磷有效化中的作用 J. 土壤学报 ， 1998， 3
26、5（ 1）： 104-111. 8 Pace NR. A molecular view of microbial diversity and the biosphere J. Science, 1997, 276: 734-740 9 Hurek T, Handley LL, Reinhold-Hurek B, Piche Y.Azoarcus grass entophytes contribute fixed nitrogen to the plant in an uncultivable state. Molecule. Plant-Micro J. Interact, 2002, 15
27、(3): 233-242 10 李淑高 .解磷微生物的研究 J.土壤通报 ,1981,(5):33-37. 11 Paul N B, Sundara Rao W B. Phosphate-dissolving bacteria in the photosphere of some cultivated legumesJ.Plant land Soil,1971,35(3):127132. 12 钟传青 ， 黄为一 .磷细菌 P17 对不同来源磷矿粉的溶磷作用及机制 J.土壤学报 , 2004,41(6): 931-936. 13 钟传青 ,黄为一 .不同种类解磷微生物的溶磷效果及其磷酸酶活性的
28、变化 J.土壤学报 , 2005,42(2): 286-294. 8 Primary study on isolation and ability of phosphorus-solubilizing bacteria in soil of wheat in Northern Anhui Student majoring in the agriculture resource and environment Zhao Jiayin Tutor: Wang Jianfei Abstract: 4 phosphorus-solubilizing bacteria were isolated fro
29、m soil in Northern Anhui by Pikocskay solid medium. Then put the phosphate-solubilizing bacteria in three different phosphorus source (calcium phosphate and phosphate rock powder, lecithin) of solid medium and liquid medium to cultivate. The ratio of D/d values raged from 1.27 to 1.65 after 3 days i
30、n Pikocskay solid medium and the ratio of dissolving phosphorus varied from 0.13 to 20.20 mg/L in liquid cultivate. In which, strain 310-1 showed stronger ability of dissolving phosphorus to all the medium. This strain had great potential for application. While 303-3 and 310-3 respectively showed st
31、ronger ability of dissolving phosphorus to calcium phosphate medium and to the lecithin. These two strains can be used to cooperate with the apply of solo-phosphorus fertilizer as sole phosphorus-solubilizing bacteria phosphorus fertilizer. Key words: the phosphate-solubilizing bacteria; source of diverse phosphorus ; ability of phosphorus-solubilizing
